Đề tài nghiên cứu “Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae trên mẫu phổi heo được giết mổ tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, thời gian từ 01042007 đến 30102007. Kết quả thu được: Mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do M. hyopneumoniae được đánh giá dựa trên bệnh tích đại thể theo công thức của Christensen (1999) và Rice (2000), phân lập MH, và kỹ thuật PCR. Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng do M. hyopneumoniae trên heo thịt giết mổ là 63,55%. Tỷ lệ hư hại trung bình của phổi phải là 41,37%, phổi trái là 38,39%. Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ do MH trên phổi phải là 2,2 điểm, phổi trái là 2,09 điểm. Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm MH ở mức điểm 2 (25 – 50%) cao nhất là 48,06 %, ở mức điểm 4 (>75%) thấp nhất với 6,98%. Tỷ lệ phân lập MH trên thạch Friis cho kết quả dương tính là 18,18%. Kỹ thuật PCR trên phổi cho kết quả dương tính là 13,64%
SỞ LÝ LUẬN
Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm
Bệnh suyễn heo hay còn gọi là bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm do
Mycoplasma hyopneumoniae là tác nhân gây viêm phế quản phổi tiến triển chậm ở heo, dẫn đến triệu chứng ho kéo dài nhiều tuần, làm giảm tốc độ tăng trưởng và sức kháng bệnh của heo Mặc dù tỷ lệ heo mắc bệnh cao, nhưng tỷ lệ chết thường thấp nếu không có sự kết hợp với các bệnh truyền nhiễm khác (Trần Thanh Phong, 1996).
Bệnh viêm phổi địa phương là một trong những bệnh hô hấp phổ biến nhất ở heo, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi tại nhiều quốc gia Bệnh này dẫn đến giảm năng suất, khiến heo còi cọc, chậm lớn, tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao và tăng chi phí thuốc men (Nguyễn Đức Lưu và Nguyễn Hữu Vũ, 2004).
2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý
Bệnh viêm phổi do Mycoplasma đã được phát hiện hơn 100 năm trước, khi vào năm 1898, Nocard và Rous đã phân lập vi khuẩn từ phổi bò bị viêm và đặt tên cho vi khuẩn này là PPLO (Pleuro – Pneumoniae – Like – Organism) (theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001).
Năm 1907, Hytyra đã loại bỏ vai trò chính do nhiễm Mycoplasma và gọi tên là
“dịch viêm phổi địa phương” (trích dẫn bởi Dương thị Thu Thủy, 2004)
Năm 1933, Kobe phát hiện bệnh viêm phổi mãn tính trên heo và gọi là bệnh cúm heo
Pullar (1948), Gulrajani và Peveridge (1951) đã mô tả đặc điểm của bệnh viêm phổi địa phương và phân biệt với bệnh cúm heo (Ross, 1992; trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004)
Mare, Switer, Goodwin và cộng sự (1965) đã phân lập loài Mycoplasma từ phổi heo bị viêm, đặt tên là Mycoplasma hyopneumoniae (Ross, 1999; trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005) Tại Việt Nam, bệnh này được phát hiện lần đầu vào năm 1957 từ đàn heo ngoại nhập ở Miền Bắc và đã nhanh chóng lan rộng ra toàn quốc, hiện nay bệnh xuất hiện ở hầu hết các trại heo trong nước (Trích dẫn bởi Trần Thanh Phong, 1996).
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào năm 1933 và sau đó lan rộng ra nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm các nước Châu Âu như Anh, Pháp, Hungary, Thụy Điển, cũng như Châu Úc vào năm 1946, và tiếp theo là các quốc gia ở Châu Á và Châu Phi Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện đầu tiên ở miền Bắc và sau đó nhanh chóng lây lan ra toàn quốc.
Theo bảng phân loại của Bergeys (1995)
Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Mollicutes Bộ: Mycoplasmatales Họ: Mycoplasmataceae Giống: Mycoplasma Các loài: M hyopneumoniae
Trong 6 giống của lớp Mollicutes thì giống Mycoplasma có số lượng loài phong phú nhất với hơn 80 loài đã được mô tả Theo Barbara (1999), Mycoplasma có hơn 13 loài gây bệnh trên heo, nhưng các loài phổ biến nhất thường được quan tâm là:
M hyosynoviae: gây viêm đa khớp ở heo 12 - 14 tuần tuổi
M.hyorhinis: gây tình trạng viêm khớp và viêm đa thanh dịch mãn tính ở heo từ
M flocculare: đa hình thái, có cấu trúc kháng nguyên và sự sinh trưởng tương tự như M hyopneumoniae nhưng không phải là tác nhân gây bệnh phổ biến trên phổi heo
M hyopneumoniae: gây dịch viêm phổi địa phương.
Đặc điểm của Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma hyopneumoniae là một loại prokaryote nhỏ, gram âm, có khả năng bắt màu kém với thuốc nhuộm gram nhưng lại bắt màu tốt với giemsa và romanowsky Chúng sống ký sinh nội bào, sản sinh cytotoxin và có thể bị vô hiệu hóa ở nhiệt độ 100°C trong 15 phút Cấu trúc kháng nguyên của M hyopneumoniae bao gồm nhiều loại protein như lactate dehydrogenase (36kDa) và các protein có trọng khối phân tử 40, 43, 64, 71, 79 kDa, giúp phân biệt với M hyorhinis.
MH có kích thước rất nhỏ, khoảng 400 - 1200nm (bằng khoảng 1/5 vi trùng), bộ gene 893 - 920 kilobase pairs (kb), nhỏ hơn rất nhiều so với vi khuẩn (1050.10 4 )
Màng tế bào của vi khuẩn MH được cấu tạo từ protein, glycoprotein, glycolipid và phospholipid, nhưng không có thành tế bào do thiếu gen tổng hợp Điều này khiến MH có tính mềm mại và hình dạng đa dạng như hình cầu, hình xoắn, hình sợi hoặc vũng, đồng thời có khả năng dễ dàng qua lọc 0,22 µm Mặc dù không có thành tế bào, MH vẫn có khả năng kháng lại một số kháng sinh tác động lên thành tế bào như penicillin, streptomycin và sulfonamid, nhưng lại nhạy cảm với các kháng sinh ức chế tổng hợp protein hoặc acid nucleic như tetracycline, chloramphenicol, và amino acid.
MH thường xuất hiện trong lòng ống phế quản, chủ yếu giữa các tế bào lông rung và đỉnh của tế bào vi nhung mao Nó hiện diện trên bề mặt tế bào biểu mô phế quản và một số trường hợp nằm tự do trong lòng ống, tiếp xúc với màng plasma của vi nhung mao qua capsule hoặc nằm tự do trong lòng ống phế quản (Masanori Tajima, 1982; trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005).
MH cú khuẩn lạc hỡnh trũn, lồi, rất nhỏ cú kớch thước khoảng 200 - 400àm (sau
5 - 10 ngày nuôi cấy), không mọc xuyên qua bề mặt thạch như các Mycoplasma khác (trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005)
Khi nuôi cấy Mycoplasma, môi trường cần phải giàu dinh dưỡng, với môi trường Friis (1975) là lựa chọn phổ biến nhất, bao gồm huyết thanh heo hoặc ngựa để tổng hợp cholesterol Các yếu tố tăng trưởng như cao men và acid nucleic cũng rất quan trọng cho sự phát triển của Mycoplasma Để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm mốc, các chất như penicillin, streptomicin và thalium acetate được sử dụng Ngoài ra, phenol red được thêm vào như một chất chỉ thị để theo dõi sự phát triển và kiểm soát pH, đặc biệt trong môi trường có lượng glucose và arginine cao, với pH lý tưởng từ 7,2 đến 7,8 Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ 37°C trong điều kiện khí có 5% CO2 và 95% N2.
Vi khuẩn này nhạy cảm với chất sát trùng, tia tử ngoại và sự khô hạn Chúng bị bất hoạt sau 48 giờ trong điều kiện khô, nhưng có thể tồn tại đến 17 ngày trong nước mưa ở nhiệt độ 2 - 7 độ C Trong phổi, chúng có thể sống đến 2 tháng ở -25 độ C, từ 9 - 11 ngày ở nhiệt độ 1 - 6 độ C và chỉ 3 - 7 ngày ở nhiệt độ 17 - 25 độ C.
Bệnh MH có khả năng lây lan trong không khí với bán kính từ 3 đến 3,5 km, khiến cho việc truyền nhiễm giữa các trại trở nên dễ dàng, đặc biệt trong điều kiện thời tiết lạnh và khí hậu ẩm ướt.
Heo dễ mắc bệnh nhất do sức đề kháng yếu Ngoài ra dê, cừu, thỏ có thể mắc ở thể ẩn
Heo con rất dễ bị nhiễm bệnh, đặc biệt là heo mới sinh, thường bị lây từ mẹ hoặc từ môi trường xung quanh Nếu sống trong điều kiện nuôi dưỡng không tốt, heo con có thể phát bệnh khi được 1 tháng tuổi hoặc trong giai đoạn cai sữa.
Heo nuôi thịt giai đoạn từ 30 - 70 kg cũng dễ mắc bệnh, giai đoạn cuối nuôi thịt (vỗ béo), tỷ lệ mắc bệnh giảm dần
Heo nái mang thai và nuôi con cũng dễ cảm nhiễm mầm bệnh
Heo ngoại có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn giống heo lai và heo rặt giống nội (trích dẫn Nguyễn Như Pho, 2000)
Trong phòng thí nghiệm, heo 10 - 12 ngày tuổi thường được dùng làm vật thí nghiệm
Phổi và hạch phổi, cùng với chất tiết từ đường hô hấp, là nơi chứa mầm bệnh Ngay cả khi heo đã khỏi bệnh, chúng vẫn có thể mang mầm bệnh trong đường hô hấp từ vài tháng đến cả năm.
Lây truyền trực tiếp: tiếp xúc với chất tiết đường hô hấp, không có sự truyền qua nhau thai
Khởi đầu truyền theo chiều dọc, từ heo nái đến heo con trước khi cai sữa (sow to pig)
Kế tiếp là lây truyền ngang, giữa các heo sau cai sữa với nhau (pig to pig)
Mycoplasma hyopneumoniae gây bệnh từ từ không dồn dập “slow disease”
(Trích dẫn bởi Nguyễn Văn Khanh, 2006)
Mycoplasma hyopneumoniae xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và cư trú tại tiểu phế quản tận cùng, nơi nó định vị ở các tế bào có tiêm mao trong phế quản và tiểu phế nang Hai trường hợp có thể xảy ra khi vi khuẩn này xâm nhập.
Sức đề kháng của cơ thể gia súc đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát Mycoplasma; nếu sức đề kháng tốt, Mycoplasma sẽ bị tạm thời cô lập Ngược lại, khi sức đề kháng yếu do vệ sinh kém, chuồng trại bẩn hoặc thay đổi thời tiết đột ngột, Mycoplasma sẽ sinh sản nhanh chóng, gia tăng độc lực và tấn công từ thùy tim qua thùy đỉnh đến thùy hoành, gây hư hại cho nhu mô phổi, mặc dù lúc này vi sinh vật vẫn chưa ra khỏi đường hô hấp.
Nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc xác định cơ chế gây bệnh của M hyopneumoniae trong viêm phổi địa phương Zang và cộng sự (1995) đã phát hiện hai protein 97 và 145 kDa liên quan đến quá trình kết bám trên màng tế bào M hyopneumoniae Ngoài ra, Chen (1996) cũng đã phát hiện thêm hai protein 28,5 và 57 kDa có khả năng cạnh tranh liên kết giữa M hyopneumoniae và nhung mao của vật chủ (Barbara, 1999; trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006).
Theo Betts (1952), thời gian ủ bệnh của Mycoplasma pneumoniae ở lợn (MPS) dao động từ 10 đến 16 ngày trong điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, nhiều báo cáo cho thấy khoảng thời gian này có sự biến thiên đáng kể Trong môi trường phòng thí nghiệm, thời gian ủ bệnh có thể ngắn hơn, chỉ khoảng 5 ngày.
- 12 ngày (Nguyễn Như Pho, 1990; trích dẫn Nguyễn Tiến Khoa, 2002)
Bệnh thường có biểu hiện mãn tính với sốt cao nhưng tỷ lệ tử vong thấp Triệu chứng chính của bệnh bao gồm ho kinh niên và tình trạng chậm lớn (Betts, 1952; trích dẫn bởi Nguyễn Thanh).
Cường độ ho ở heo nuôi vỗ thường gia tăng, đặc biệt khi di chuyển, sau khi ăn hoặc khi thời tiết thay đổi đột ngột, như lúc trời lạnh hay sáng sớm Ở thể cấp tính, heo có thể sốt cao, bỏ ăn, khó thở và tỷ lệ chết lên đến 20 - 25% Những heo chữa khỏi thường bị còi cọc và có dấu hiệu viêm phổi kéo dài đến khi giết mổ Tuy nhiên, thể cấp tính này ít gặp, chủ yếu xảy ra ở những đàn heo chưa từng mắc bệnh.
Bệnh do Mycoplasma đặc trưng bởi viêm phổi, bắt đầu từ thùy tim và lan dần sang thùy đỉnh với đặc điểm viêm ở vùng rìa, có tính đối xứng giữa hai bên phổi Hệ hô hấp xuất huyết, phổi xuất hiện nhiều vùng nhục hóa (gan hóa) Trên mặt cắt phổi, có bọt trắng và phế quản chứa dịch viêm lẫn bọt.
Các hạch bạch huyết dọc khí quản sưng to gấp 3 - 4 lần, mặt ngoài hơi ướt, hơi tụ máu nhưng không xuất huyết
Cơ sở lý luận cho chẩn đoán M hyopneumoniae dương tính
2.3.1 Đánh giá bệnh tích hư hại nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae
Bệnh tích nghi ngờ MPS được xác định qua các biểu hiện như sự hiện diện của tổn thương ở hai bên phổi, bao gồm thùy đỉnh, thùy tim, thùy phụ và phần trước thùy hoành cách mô Trong thể cấp tính, phổi có màu xậm, màu hồng và có hiện tượng phù Đối với thể mãn tính, phổi có màu đỏ xậm đến xám, thường xẹp và có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng bệnh tích và vùng phổi bình thường Hạch lympho phế quản và hạch lympho màng trung thất cũng có dấu hiệu sưng lớn Mỗi thùy phổi được chấm điểm từ 0 đến 4, với điểm tối đa là 16.
28 trên 7 thùy phổi của từng phổi, theo Rice (2000) điểm bệnh tích trên phổi nhiễm
MH được xác định dựa trên mức độ bao phủ bệnh tích trên bề mặt phổi như sau: Điểm 0 tương ứng với không có bệnh tích, Điểm 1 khi sự bao phủ bệnh tích nhỏ hơn 25%, Điểm 2 khi chiếm từ 25% đến 50%, Điểm 3 khi chiếm từ 50% đến 75%, và Điểm 4 khi sự bao phủ bệnh tích vượt quá 75% bề mặt phổi.
M hyopneumoniae rất khó phân lập, nó không mọc trên môi trường thông thường mà lại cực kỳ kén chọn và còn rất dễ bị các Mycoplasma khác lấn át do sự hiện diện thường xuyên của M hyorhinis trong đường hô hấp Ngoài ra M flocculare không gây bệnh cũng thường có ở phổi heo có nhiều dạng đặc tính phát triển và kháng nguyên tương tự M hyopneumoniae (Mattsson, 1995) Môi trường nuôi cấy thông dụng nhất do Friis (1975) đã mô tả (trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003) Ý nghĩa các thành phần trong môi trường nuôi cấy MH (theo Ross, 1983)
Bacto-heart infusion broth (BHI) là thành phần chính trong môi trường nuôi cấy Mycoplasma, bao gồm 500g beef heart infusion, 10g bacto-tryptose và 5g sodium chloride.
Chiết xuất nấm men là một chất lỏng được lấy từ nấm men tươi đã trải qua quá trình lên men Mặc dù chưa có xác định chính xác, nhưng chất chiết này được cho là giàu acid nucleic và chứa nhiều tiền chất của nucleic acid.
Huyết thanh cung cấp acid béo và cholesterol dễ hấp thụ, không độc hại, hỗ trợ cho quá trình tổng hợp màng Huyết thanh ngựa có nồng độ cao, mang lại lợi ích cho sức khỏe.
10 - 20%, không bị bất hoạt bởi nhiệt, và là huyết thanh động vật thường xuyên được sử dụng
Trong môi trường nuôi cấy, nồng độ glucose và arginine có thể đạt tới 1%, giúp kích thích sự phát triển mạnh mẽ của các vi sinh vật dị hóa glucose và arginine Tuy nhiên, một số chủng Mycoplasma lại bị ức chế phát triển khi có 1% arginine, do đó, nồng độ arginine được khuyến cáo nên ở mức tối đa là 0,2% (Leach, 1976; Washburn và Somerson, 1977; trích dẫn bởi Freundt, 1983).
Phenol red được sử dụng như một chất chỉ thị để theo dõi sự phát triển và ngăn chặn sự thay đổi pH kéo dài trong môi trường có nồng độ glucose và arginine cao.
Deoxyribonucleic acid (DNA) là thành phần thiết yếu trong việc phân lập M bovigenitalium và kích thích sự phát triển của nhiều loài Mycoplasma khác Do đó, DNA thường xuất hiện với nồng độ nhỏ trong nhiều môi trường nuôi cấy.
L-cysteine, β-nicotinamide dinucleotide (NADH) và các vitamin là những yếu tố cần thiết để hỗ trợ sự phát triển của các loài Mycoplasma khó tính trong môi trường phức hợp.
- Các chất kiềm khuẩn (bacteriostatic): các chất kiềm khuẩn thường xuyên được cho vào môi trường nuôi cấy là benzylpenicillin (khoảng 50 - 500UI/ml) và thalium acetate (0.005 - 0.01%)
Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho Mycoplasma ở 37 0 C, yếm khí và 5 - 10% CO2 là điều kiện tối hảo để phân lập Mycoplasma
2.3.3 Phát hiện M hyopneumoniae bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR, được phát hiện bởi Karl Mullis và cộng sự vào năm 1985, là phương pháp khuếch đại nhanh chóng một đoạn gene đã biết lên hàng triệu lần Mục đích của kỹ thuật này là tạo ra số lượng lớn bản sao của một đoạn mã di truyền cụ thể (Stemke 1985; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003).
Kỹ thuật PCR được áp dụng để phát hiện Mycobacterium, trong đó đoạn gene 16S rRNA được sử dụng để thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho vi khuẩn này (Stemke và cộng sự, 1985).
Tổng DNA khuếch đại = m x 2 n có thể sử dụng một đoạn gene khác như P97 adhensin trong DNA nhiễm sắc thể (Lin,
1999) và thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho MH (trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003)
2.3.3.2 Nguyên tắc kỹ thuật PCR
Tất cả các DNA polymerase cần sự hiện diện của mồi đặc biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mồi là đoạn DNA ngắn bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, giúp DNA polymerase kéo dài mồi và hình thành mạch mới Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt cho hai đầu của trình tự DNA, ta có thể tổng hợp đoạn DNA nằm giữa chúng Kỹ thuật PCR yêu cầu biết trình tự đầu tận cùng của đoạn DNA cần khuếch đại để tạo oligonucleotide bổ sung Mồi tác động lên dây DNA 3’ – 5’ gọi là mồi xuôi (forward primer: F), trong khi mồi tác động lên dây DNA 5’ – 3’ gọi là mồi ngược (reverse primer: R) Sự sắp xếp này đảm bảo cho vùng bị can thiệp được tăng cường qua ba bước: biến tính, bắt cặp, kéo dài, tạo thành một chu kỳ lặp lại nhiều lần.
2.3.3.3 Các bước của chu kỳ trong phản ứng PCR:
Biến tính DNA mạch đôi thành hai mạch đơn là bước đầu tiên trong quy trình, diễn ra ở nhiệt độ cao từ 94 đến 95 độ C Hai mạch đơn này sau đó sẽ trở thành khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Bước 2 (Ủ bắt cặp) là giai đoạn quan trọng trong quá trình lai phân tử, trong đó đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung với mạch khuôn ở hai đầu nhằm chuẩn bị cho sự kéo dài Nhiệt độ trong bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các mồi được sử dụng.
Sơ lược một số nghiên cứu chẩn đoán M hyopneumoniae
Năm 1965, Mare, Switer và Goodwin là những người đầu tiên phân lập
Mycoplasma từ phổi heo bị viêm và gây bệnh thực nghiệm
Bruggemann và cộng sự (1977) đã phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae (MH) trong phổi của heo bệnh thông qua kỹ thuật miễn dịch enzyme peroxidase Nghiên cứu của Whitlestone (1979) chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh này có sự khác biệt giữa các quốc gia, với tỷ lệ viêm phổi do MH ở đàn heo thịt dao động từ 30% đến 80%.
Nicolet và ctv (1980), Bommeli và Nicolet (1983) đã phát hiện kỹ thuật ELISA gián tiếp với Tween 20 để phát hiện kháng thể chống MH
Trong một cuộc điều tra 597 đàn heo giống ở Iowa, Young và cộng sự (1983) đã sử dụng phương pháp kết hợp bổ thể để phát hiện kháng thể chống lại các tác nhân gây bệnh.
Cuộc điều tra của Pointon (1990) cho thấy chỉ số OD đạt đỉnh khoảng 5 – 7 tuần sau khi nhiễm, và vẫn duy trì phản ứng dương tính sau một năm Phản ứng chéo với M Flocculare đã được loại trừ tối đa nhờ sử dụng Tween 20 trong phương pháp ELISA.
Mattsson và ctv (1995), Blanchard (1996) dùng kỹ thuật PCR để phát hiện MH nhanh chóng đặc hiệu trong dịch mũi và nước rửa khí quản của phổi bệnh
Nguyễn Thị Ngọc Hạnh (2002) điều tra tỷ lệ nhiễm MH trên heo bằng kỹ thuật ELISA tại xí nghiệp chăn nuôi heo công nghiệp tại TP HCM
Quách Tuyết Anh (2003) một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện MH trên mẫu bệnh tích phổi nhục hóa
Nguyễn Thị Phước Ninh (2003) đã nghiên cứu hiệu quả của vaccine Respisure trong việc phòng ngừa bệnh viêm phổi địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae (MH) trên heo thịt Đỗ Tiến Duy (2004) đã thực hiện chẩn đoán M hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể và kỹ thuật ELISA trên heo thịt tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, TP HCM.
Nguyễn Tất Toàn (2004) đã tiến hành so sánh và đánh giá các phương pháp chẩn đoán như phân lập, PCR và bệnh lý lâm sàng đối với heo nhiễm MH tại các trang trại chăn nuôi heo ở vùng Luzon, Philippines.
Năm 2005, tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong của Nguyễn Thoại Thức, kết quả chẩn đoán bệnh MH trên heo thịt cho thấy tỷ lệ nuôi cấy và phân lập MH dương tính đạt 4,9% trong số 70 mẫu có bệnh tích nghi ngờ.
Vân Minh Tâm (2005) đã tiến hành chẩn đoán Mycoplasma hyosynoviae (MH) trên heo thịt tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, với tỷ lệ nuôi cấy và phân lập MH dương tính đạt 3,4% trong tổng số 58 mẫu có bệnh tích nghi ngờ.
Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006) đã thực hiện nghiên cứu chẩn đoán Mycoplasma Hyopneumoniae (MH) trên heo thịt tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Kết quả cho thấy tỷ lệ nuôi cấy phân lập MH dương tính đạt 76,09% trong tổng số 46 mẫu phân lập có bệnh tích nghi ngờ MH.
Võ Thị Hoàng Sang (2006) phân lập Mycoplasma hyopneumoniae trên phổi heo được thu thập tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Tỷ lệ nuôi cấy phân lập
MH dương tính trên thạch là 25%, trên canh là 33,33% Kỹ thuật PCR dương tính sau phân lập là 100% đối với glucose và 100% âm tính với ure và arginine.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Thời gian và địa điểm
- Lấy mẫu tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, 344 Nơ Trang Long, phường 13, quận Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh
+ Phòng vi sinh Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM + Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm
Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
- Những mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH thu thập được
3.2.2 Dụng cụ thu thập mẫu
- Cốc nhựa, kéo, viết ký hiệu mẫu
- Bảng đánh giá bệnh tích phổi
3.2.3 Dụng cụ xử lý phân lập tại phòng thí nghiệm
- Hai cốc thủy tinh 1000ml dùng để đun sôi nước, sát trùng mẫu
- Bao nylon chịu nhiệt sạch, vô trùng
- Khay đựng mẫu phổi vô trùng
Tất cả các dụng cụ này cần phải được sát trùng bề mặt bằng tia cực tím trước khi nuôi cấy.
Đối tượng nghiên cứu
Phổi heo có bệnh tích nghi ngờ do MH
Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu
Chỉ tiêu Số lượng Loại mẫu
Khảo sát bệnh tích đại thể 203 Phổi
Dùng kỹ thuật PCR để xác định MH 22 Phổi
Nội dung
- Đánh giá mức độ hư hại của phổi có bệnh tích đại thể nghi ngờ do MH
- Phân lập MH từ mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH đã được thu thập
- Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán MH từ mẫu phổi
Phương pháp tiến hành
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ các bước thực hiện thí nghiệm
3.5.1 Đánh giá mức độ hư hại có bệnh tích đại thể nghi ngờ do MH
Tại nơi thu thập mẫu, phổi được treo trên giá để quan sát tổng thể và từng thùy phổi Việc đánh giá và kiểm tra sự hư hại trên từng thùy phổi dựa vào bệnh tích, màu sắc, kích thước bề mặt, độ rắn chắc và mặt cắt mô phổi.
Mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH
Nhận định kết quả đánh giá bệnh tích hư hại trên phổi theo phương pháp của Christensen (1999) cho thấy mức độ hư hại được chấm điểm từ 0 đến 100 Điểm số được tính trung bình cho từng thùy phổi, bao gồm cả phổi trái và phổi phải, và cuối cùng là tính toán điểm trung bình hư hại cho toàn bộ phổi.
Theo Rice (2000), việc đánh giá bệnh tích hư hại trên phổi theo định hướng MH được thực hiện bằng cách chấm điểm từ 0 đến 4 (Nguyễn Tất Toàn, 2004) Bệnh tích được đánh giá và tính điểm cho từng thùy phổi, từng bên phổi và trên toàn bộ phổi.
Mẫu phổi được thu thập từ heo nghi mắc bệnh MH, dựa vào các đặc điểm bệnh tích rõ ràng Khi phổi xuất hiện các vùng săn chắc màu đỏ xám hoặc màu cẩm chướng (nhục hóa), bệnh tích thường xuất hiện ở rìa thùy đỉnh và thùy tim với tính đối xứng rõ ràng, có khả năng lan rộng sang thùy hoành cách mô và thùy phụ.
3.5.2.2 Xử lý và bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu: Các mẫu được đánh số thứ tự và được giữ trong thùng đá, mang về phòng thí nghiệm để tiến hành xử lý trong 12 – 24 giờ
Để xử lý mẫu, cần sát trùng bề mặt phổi bằng cồn, sau đó sử dụng kéo vô trùng để cắt sâu vào bên trong phổi, lấy phần phổi chứa tiểu phế quản nhằm mục đích phân lập.
Môi trường nuôi cấy thường sử dụng là môi thạch Friis, với thành phần chính bao gồm canh BHI, thạch PPLO, và bổ sung chất triết nấm men tươi cùng huyết thanh heo (ngựa) không chứa kháng thể đặc hiệu Để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn từ vi sinh vật và nấm, môi trường cần được bổ sung các chất kiềm khuẩn như thallium acetate, penicillin G, và streptomycin Phenol red được sử dụng như một chỉ thị tăng trưởng, giúp theo dõi pH môi trường, khi môi trường lên men glucose sẽ làm giảm pH và chuyển phenol red thành màu vàng.
3.5.2.4 Các bước nuôi cấy Mycoplasma hyopneumoniae
Các bước thực hiện nuôi cấy được mô tả qua sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập Mycoplasma hyopneumoniae 3.5.3 Kỹ thuật PCR để xác định MH
3.5.3.1.1 Ly trích DNA từ khuẩn lạc
Trên thạch cú có sự hiện diện của khuẩn lạc, thêm 1000 - 1500 µl đệm PBS (phosphate buffered saline) vào hỗn dịch và chuyển vào ống Eppendorf Ly tâm ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn, sau đó hòa tan cặn trong 300 µl nước cất hai lần.
Để tách DNA, đầu tiên, phá vỡ màng tế bào bằng cách ủ mẫu trong nước nóng (90 - 95 độ C) trong khoảng 10 phút, sau đó cho vào tủ đá ở -20 độ C trong 10 phút Tiếp theo, ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút để thu hồi phần nổi chứa DNA, sử dụng làm mẫu xét nghiệm.
3.5.3.1.2 Ly trích DNA từ mẫu phổi
Mẫu phổi được cắt nhỏ khoảng 1cm³ tại vùng ranh giới giữa vùng nhục hóa và vùng phổi bình thường, sau đó nghiền nát và cho vào ống nghiệm chứa 5ml dung dịch đệm PBS Tiến hành vortex mạnh trong 5-10 phút, sau đó để lắng và lấy 500-1000µl huyễn dịch cho vào ống Eppendorf Ly tâm ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 20 phút và thu lấy cặn, sau đó hòa tan cặn trong 200µl buffer A.
Mẫu phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH
Khuẩn lạc nghi ngờ MH
PCR Định danh 7-10 ngày 37 0 C, 5-10% CO2
Phá vỡ màng tế bào bằng cách
- Phương pháp rã đông 3 lần (cho mẫu vào tủ lạnh -70 0 C cho đến khi đông đá và sau đó để vào nước sôi cho tan)
- Thờm 10àl SDS 20% (sodiumodecyl sulfat)
- Thờm 10àl proteinase K 20mg/ml, ủ 55 0 C trong 5 phỳt
- Sau đú thờm vào 100àl SDS 20% và 300àl TE
Để tinh sạch DNA, thêm 600µl dung dịch phenol/chloroform/isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) vào hỗn hợp nhằm loại bỏ protein, sau đó lắc đều và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút Tiếp theo, nhẹ nhàng lấy phần chất lỏng phía trên (không chạm vào màng trắng giữa hai lớp) và chuyển vào ống Eppendorf khác.
- Thêm 1/10 V dung dịch sodium acetate 3M, pH 5,2 và 2 lần thể tích (2V) cồn tuyệt đối lạnh, vortex đều
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, nhẹ nhàng bỏ phần trên, lấy tủa
- Kết tủa DNA được làm khụ ở 50 0 C, hũa tan cặn khụ trong 100àl nước tinh sạch
3.5.3.2 Kiểm tra hiệu quả ly trích DNA
Các mẫu DNA ly trích được kiểm tra bằng cách đo độ mật quang OD (Optical Density) ở bước sóng 260nm và 280nm bằng máy quang phổ kế (model HP 8453)
Hàm lượng DNA được tính bằng công thức
DNA (ng/ml) = (62,9 × OD 260nm ) – (36 × OD 280nm ) DNA được xem là sạch nếu tỷ số giữa hai bước sóng 260nm và 280nm (OD260nm/ OD280nm) nằm khoảng giữa 1,8 – 2
3.5.2.3 Phản ứng PCR để phát hiện MH Đoạn mồi đặc hiệu cho MH
212f: 5’ – GAG CCT TAC AGG TTC ACC AAG A – 3’
839R: 5’ – TGT GTT AGT GAC TTT TGC CAC C – 3’
(Mattsson, 1995; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003)
Cỏc thành phần trong phản ứng PCR cho đoạn mồi đặc hiệu MH: 15,4àl hỗn hợp sau phản ứng với 2àl DNA xột nghiệm (khoảng 100ng – 500ng DNA/àl)
MgCl2 25 mM 0,6àl dNTPs 10 mM 0,4àl
Mồi xuụi 100 pmol/àl 0,2àl Mồi ngược 100 pmol/àl 0,2 àl
- PCR nucleotide mix (dNTPs) và Taq DNA polymerase do hãng Abgene cung cấp
- Mồi xuôi, mồi ngược do hãng IDT cung cấp
Chu kỳ khuếch đại DNA gồm:
72 0 C 7 phút Sản phẩm PCR cần thu hoạch là DNA có kích thước 649bp
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,3% (100V, 250mA, 30 phút)
Sau khi hoàn thành quá trình điện di, gel cần được nhuộm trong dung dịch TBE (triborate EDTA) có chứa ethidium bromide với nồng độ 1 µg/µl trong thời gian 30 phút Sau đó, gel được rửa lại bằng nước và kiểm tra dưới ánh sáng tia UV.
Các công thức tính
Tỷ lệ hư hại trung bình trên từng thùy phổi
Tỷ lệ hư hại trung bình của từng thùy phổi (%) = ∑ phần trăm bệnh tích trên thùy phổi/∑ phổi đánh giá
Phần trăm hư hại phổi trái, phổi phải và toàn phổi theo Christensen (1999)
% hư hại phổi trái (Pt) = ((Đt x 5) + (Gt x 6) + (Ht x 29))/40
% hư hại phổi phải (Pp) = ((Đp x 11) + (Gp x 10) + (Hp x 34) + (Tp x 5))/ 60
% hư hại cả phổi (P) =((Pt x 40) + (Pp x 60))/100 Đt: Tỷ lệ hư hại thùy đỉnh trái
Gt: Tỷ lệ hư hại thùy giữa trái
Tỷ lệ hư hại thùy hoành cách mô trái (Ht) và thùy đỉnh phải (Đp) là những chỉ số quan trọng trong việc đánh giá tổn thương Bên cạnh đó, tỷ lệ hư hại thùy giữa phải (Gp), thùy hoành cách mô phải (Hp) và thùy phụ phải (Pp) cũng đóng vai trò không kém trong phân tích tình trạng sức khỏe Những tỷ lệ này giúp xác định mức độ ảnh hưởng đến các thùy khác nhau của cơ thể.
Công thức chấm điểm của Rice (2000) được phân loại như sau: Điểm 0 thể hiện không có bệnh tích; Điểm 1 khi bệnh tích phủ trên bề mặt phổi nhỏ hơn 25%; Điểm 2 cho bệnh tích chiếm từ 25 đến 50%; Điểm 3 khi bệnh tích chiếm từ 50 đến 75%; và Điểm 4 khi bệnh tích lớn hơn 75%.
Tính toán kết quả
Trắc nghiệm Chi-Square được tính trên phần mềm Minitab for Window Version 12.21.
KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN
Kết quả đánh giá mức độ hư hại của phổi nghi ngờ do Mycoplasma hyopneumoniae
4.1.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do M hyopneumoniae
Tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, chúng tôi đã tiến hành quan sát và đánh giá bệnh tích trên 203 mẫu phổi heo sau khi giết mổ, với kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH
Bệnh tích Số phổi Tỷ lệ (%)
Bệnh tích nghi ngờ MH 129 63,55
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH
Ghi chú: BTK: bệnh tích khác
BTNNMH: bệnh tích nghi ngờ Mycoplasma hyopneumoniae
Theo bảng 4.1, tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH cao hơn đáng kể so với các bệnh tích khác, điều này cũng đồng nhất với nhận định của Ross.
Tỷ lệ bệnh tích do Mycoplasma hyopneumoniae (MH) trên đàn heo hạ thịt năm 1999 đạt khoảng 30-80%, cho thấy mức độ nghiêm trọng của bệnh khá cao Nguyên nhân có thể do nguồn heo thịt chủ yếu từ các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, nơi có mật độ chăn nuôi lớn và người chăn nuôi chưa chú trọng đúng mức đến việc điều trị và tiêm phòng vaccine Hiện nay, tình trạng bệnh hô hấp ở heo đang rất phổ biến, đặc biệt trong thời điểm giao mùa, làm cho diễn tiến bệnh trở nên nghiêm trọng hơn.
Kết quả đánh giá tỷ lệ bệnh tích nghi ngờ do MH trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các khảo sát trước đó, cụ thể là 62,27% của Lâm Chí Hiếu (2004), 67,94% của Đỗ Tiến Duy (2004), và 55% của Nguyễn Thoại Thức (2005) Tuy nhiên, tỷ lệ này thấp hơn so với các nghiên cứu của Võ Thị Hoàng Sang (2006) với 76%, Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006) với 75,77%, và Vân Minh Tâm (2005) với 71,34%.
4.1.2 Kết quả đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi nghi nhiễm MH Đánh giá phần trăm hư hại trên từng thùy phổi, phổi trái, phổi phải và cả phổi theo công thức được đề nghị bởi Christensen (1999) Kết quả được trình bày qua bảng 4.2
Bảng 4.2 Tỷ lệ hư hại trên phổi nghi ngờ MH
Số mẫu phổi (n = 129) Tỷ lệ (%)
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ hư hại trên từng thùy phổi
Ghi chú: HCM: Hoành cách mô
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ hư hại trung bình trên phổi
Ph ổ i trái Ph ổi ph ả i Thùy đỉnh Thùy giữ a Thùy HCM Thùy ph ụ
Ph ổ i trái Ph ổ i ph ải C ả ph ổ i
Ph ổ i trái Ph ổ i ph ải C ả ph ổ i
Theo bảng 4.2, tỷ lệ hư hại trung bình của phổi phải (41,37%) cao hơn so với phổi trái (38,39%) và trung bình cả hai phổi (40,18%), với sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Kết quả cho thấy mức độ hư hại phổi ở mức trung bình, có thể do ảnh hưởng của các yếu tố như kháng sinh trong điều trị và vaccine, dẫn đến diện tích bề mặt phổi bị hạn chế theo nghiên cứu của Rice.
Vaccine MH và kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu mức độ bệnh tích trên phổi, theo nghiên cứu của Nguyễn Tất Toàn (2004) và được trích dẫn bởi Vân Minh Tâm (2005).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ hư hại phổi cao hơn so với các nghiên cứu trước đây Cụ thể, Võ Thị Hoàng Sang (2006) ghi nhận tỷ lệ hư hại phổi phải là 44,16%, phổi trái 29,43% và cả phổi 38,27% Trong khi đó, Vân Minh Tâm (2005) có tỷ lệ hư hại phổi phải 38,31%, phổi trái 20,09% và cả phổi 31,27% Lâm Chí Hiếu (2004) báo cáo tỷ lệ hư hại phổi phải là 28,27%, phổi trái 25,87% và cả phổi 27,31%.
Nếu chia theo mức độ hư hại (%) thì tần số xuất hiện các phổi tính điểm theo Rice (2000) được biểu hiện qua bảng 4.3
Bảng 4.3 Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae ở các mức độ Điểm Mức độ hư hại (%) Số lượng mẫu hư hại
Tiếp tục đánh giá các bệnh tích phổi nghi ngờ theo tiêu chí của Rice (2000) cho từng thùy phổi, bao gồm cả phổi trái và phổi phải, cũng như tổng thể phổi Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 4.4.
Bảng 4.4 Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ do M hyopneumoniae trên phổi
Số mẫu phổi (n = 129) Điểm trung bình (%)
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ hư hại của phổi nghi nhiễm MH ở các mức độ
Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ MH phổi phải (2,2) cao hơn điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ MH phổi trái (2,09) Trung bình bệnh tích nghi ngờ MH trên cả hai phổi đạt 2,16, tương ứng với tỷ lệ bệnh tích bao phủ bề mặt phổi khoảng 25 – 50%.
Theo bảng 4.3 và sơ đồ 4.4, tỷ lệ hư hại ở mức 25-50% (điểm 2) đạt 48,06%, cho thấy bệnh tích chủ yếu tập trung tại mức điểm này.
Tỷ lệ hư hại phổi ở các mức độ khác nhau cho thấy sự khác biệt rõ rệt và có ý nghĩa thống kê Cụ thể, tỷ lệ hư hại dưới 25% là 24,03%, trong khi tỷ lệ hư hại từ 50-75% là 20,93% Tỷ lệ thấp nhất, trên 75%, chỉ đạt 6,98% Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P < 0,001.
Từ bảng 4.3 và biểu đồ 4.4 cho thấy bệnh tích đại thể trên phổi định hướng do
Mặc dù mức độ MH rất cao, nhưng hư hại phổi chỉ ở mức trung bình, đạt 2,16 điểm Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị và tiêm phòng vaccine có thể giúp hạn chế diện tích hư hại trên phổi.
Hình 4.1 Phổi có bệnh tích nhục hóa trên thùy tim (định hướng do MH)
Hình 4.2 Phổi có bệnh tích nhục hóa (định hướng MH)
Kết quả phân lập MH trên môi trường thạch Friis từ mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ
Tiến hành phân lập Mycoplasma hyopneumoniae (MH) trên 22 mẫu phổi có bệnh tích định hướng, với mức độ hư hại từ 10 đến 30% Theo nghiên cứu của Quinn (1994), việc thu thập mẫu phổi nên được thực hiện từ những con heo ở giai đoạn sớm của bệnh, khi mà kháng thể chưa hình thành hoặc đã có nhưng với hàm lượng thấp.
Bảng 4.5 Kết quả phân lập MH từ môi trường thạch Friis đã định danh bằng kỹ thuật
Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ nuôi cấy MH trên thạch
Trong quá trình phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch, khuẩn lạc nghi ngờ của M hyopneumoniae xuất hiện với hình dạng tròn, lồi trên bề mặt thạch, không có dạng hình trứng chiên sau 8 - 10 ngày nuôi cấy Quan sát này phù hợp với nhận định của Ross và Whitlestone (1983) về sự phát triển của khuẩn lạc M hyopneumoniae và M flocculare.
Kết quả phân lập MH (n = 22)
M hyopneumoniae có đặc điểm là phát triển chậm trên thạch, với kích thước nhỏ và không có hình trứng chiên, đồng thời không xuyên qua bề mặt thạch, điều này dễ dẫn đến nhầm lẫn với M flocculare Tuy nhiên, theo Carter (1990), có thể phân biệt giữa hai khuẩn lạc này nhờ vào vòng sáng xung quanh khuẩn lạc của M hyopneumoniae, trong khi M flocculare không có đặc điểm này (trích dẫn bởi Vân Minh Tâm, 2005).
Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định MH trên môi trường thạch Friis, cho thấy 4 mẫu dương tính với sự hiện diện của khuẩn lạc tròn, lồi, mọc trên bề mặt thạch.
Tỷ lệ dương tính MH nuôi cấy trên môi trường thạch đạt 18,18%, theo bảng 4.5 và biểu đồ 4.5 Mặc dù tỷ lệ này thấp hơn so với kết quả của Nguyễn Thị Thanh Trúc (76,09%) và Võ Thị Hoàng Sang (25%), nhưng vẫn cao hơn so với nghiên cứu của Vân Minh Tâm (3,4%) Nguyên nhân có thể do trong quá trình lấy mẫu, chúng tôi đã thu thập mẫu phổi từ những con heo đã tiêm phòng vaccine hoặc được điều trị bằng kháng sinh, dẫn đến sự ức chế tăng trưởng của MH.
MH trong quá trình phân lập
Hình 4.3 Khuẩn lạc MH sau 7 ngày nuôi cấy
Hình 4.4 Kết quả chạy PCR mẫu thạch
(Mẫu 5 và 10 đối chứng dương, mẫu 1, 2, 3, 4 dương tính)
Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR trên mẫu phổi
Từ 22 mẫu phổi được phân lập trên thạch chúng tôi đồng thời tiến hành làm kỹ thuật PCR để xác định sự hiện diện của MH trên phổi heo nghi ngờ Kết quả được trình bày qua bảng 4.6
Bảng 4.6 Kết quả xác định MH trên mẫu phổi bằng kỹ thuật PCR
Sơ đồ 4.6 Tỷ lệ phổi dương tính với MH qua kiểm tra PCR
Theo bảng 4.6, tỷ lệ dương tính khi chẩn đoán Mycobacterium hypphila (MH) qua mẫu phổi thấp hơn so với khi phân lập trên thạch Friis Kỹ thuật PCR có độ nhạy và chính xác cao, nhưng yêu cầu kỹ năng và kinh nghiệm của kỹ thuật viên, cùng với độ chính xác của thiết bị Quá trình ly trích nucleic acid có thể làm giảm độ nguyên vẹn do nghiền lắc mạnh hoặc enzyme nội bào giải phóng khi tế bào bị phá vỡ Ngoài ra, tỷ lệ đoạn mồi trong quá trình mix PCR cũng ảnh hưởng lớn đến kết quả, với tỷ lệ cao có thể dẫn đến hiện tượng primer-dimers, trong khi tỷ lệ thấp sẽ tạo ra ít sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và ctv 1999; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003).
Kết quả xác định Mycobacterium H trên mẫu phổi bằng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây, cụ thể là 50% so với 65,2% của Quách Tuyết Anh (2003), 70% của Vân Minh Tâm (2005), 60% của Nguyễn Thoại Thức (2005), và 88,89% của Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006).
D ươ ng tính Âm tính
Hình 4.5 Kết quả chạy PCR mẫu phổi
(Mẫu 9 đối chứng dương, mẫu: 2, 7, 16 dương tính)