TỔNG QUAN
Giới thiệu về cây sen
Loài: Nelumbo nucifera Gaertn (cây sen)
Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn
Tên tiếng anh: Sacred lotus, Chinese water-lily,…
Cây sen, một trong những thực vật hạt trần cổ xưa, có nguồn gốc từ Ấn Độ và đã lan rộng sang Trung Quốc cùng vùng đông bắc Úc Châu Là loại thủy sinh phổ biến, cây sen được tiêu thụ mạnh mẽ ở Châu Á.
Sen được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, đặc biệt là ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á, Nga và một số quốc gia châu Phi Mặc dù cũng có mặt ở châu Âu và châu Mỹ, nhưng ở đây, sen chủ yếu được trồng với mục đích trang trí Tại Việt Nam, cây sen phổ biến ở các tỉnh như Đồng Tháp, Vĩnh Long và Trà Vinh, trong đó Đồng Tháp dẫn đầu cả nước về diện tích trồng sen để lấy hạt.
Cây sen là loại thực vật sống lâu năm, mọc dưới nước với thân rễ hình trụ bò lan trong bùn Lá cây có hình tròn, mọc cao trên mặt nước với cuống dài có gai nhỏ và mép lá uốn lượn Hoa sen lớn, có màu hồng hoặc trắng và tỏa hương thơm Quá trình sinh sản của cây diễn ra qua nhiều lá noãn nằm trong đế hoa hình nón ngược, sau đó hình thành quả có vỏ cứng màu nâu đen Cây sen thường được trồng ở các ao, hồ trên khắp cả nước.
Dựa vào công dụng, cây sen được chia làm 3 loại:
Loại sen cho củ: thường cho hoa màu trắng, có một ít hoa màu đỏ Nhóm sen này ít bông và gương
Loại sen cho gương: giống này được trồng phổ biến ở Đồng Tháp
Loại sen cho hoa để trang trí: loại này bông có nhiều màu nhưng ít được trồng ở nước ta
2.1.4 Thời gian sinh trưởng và phát triển của sen:
Thời gian sinh trưởng và phát triển của sen từ 4 – 5 tháng, phụ thuộc vào từng loại giống:
Nếu sử dụng giống bằng cây con gieo từ hạt thì thời gian từ khi nẩy mầm đến khi thu hoạch là 5 tháng
Nếu sử dụng giống bằng ngó sen thì thời gian từ khi nẩy mầm đến khi thu hoạch là 4 tháng [7]
2.1.5 Thành phần hóa học của cây sen
Lotus leaves contain alkaloids (0.77 – 0.84%), including key compounds such as nuciferin, nor-nuciferin, and roemerin, among others Nuciferin is the primary alkaloid present Additionally, lotus leaves are rich in flavonoids like quercetin and isoquercitrin, as well as tannins, chlorophyll, and organic acids The alkaloid content in lotus leaves varies based on the age of the leaves and the season of harvest.
Hình 2.1: Cây sen và lá sen
Trong tâm sen có nhiều alkaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin [3]
2.1.6 Một số ứng dụng của cây sen
Cây sen đã được ứng dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý như mất ngủ và thần kinh suy nhược Thành phần alkaloid trong cây sen được chiết xuất và sử dụng trong các sản phẩm dược phẩm như Sevona, chứa cao lá sen và các dược liệu khác, và trà thuốc Seivo, với thành phần cao tâm sen, cao củ bình vôi và cao ích mẫu Ngoài ra, thuốc an thần Seroga cũng được sản xuất từ cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao nhân hạt táo và cao thiên ma, cho thấy sự đa dạng trong ứng dụng của cây sen trong ngành dược.
Cây sen cung cấp nhiều bộ phận có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm, bao gồm củ sen, ngó sen, hạt sen và nhụy hoa, đặc biệt nhụy hoa được dùng để ướp hương cho trà xanh.
Các hợp chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên
Trong tự nhiên, tồn tại nhiều hợp chất kháng oxy hóa từ thực vật như cây cối và trái cây, cũng như từ động vật như dầu cá chứa omega-3.
Nhiều hợp chất kháng oxy hóa như vitamin E, vitamin C, anthocyanin, catechin, tannin và omega (3, 6, 9) đã trở nên phổ biến trong việc bảo vệ sức khỏe con người Tuy nhiên, bài nghiên cứu này sẽ tập trung vào một số hợp chất kháng oxy hóa có hoạt tính có thể tìm thấy trong lá sen.
2.2.1 Gốc tự do và cơ chế tác động của chất kháng oxy hóa
2.2.1.1 Sự hình thành gốc tự do của oxy trong sinh học Định nghĩa gốc tự do: là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp điện tử ngoài cùng của chúng có chứa điện tử không cặp đôi Gốc tự do có thể mang điện tích dương, điện tích âm hoặc không mang điện tích Đặc tính của phản ứng oxy hóa – khử trong cơ thể là chỉ có thể trao đổi một điện tử, có nghĩa là oxy trong chuỗi hô hấp của tế bào cũng chỉ nhận từng điện tử một Sự chuyển hóa của oxy chủ yếu theo các phản ứng sau:
O2 và H2O2 luôn được sản sinh và phân hủy liên tục, do đó, ở điều kiện bình thường, chúng chỉ tồn tại ở nồng độ cân bằng rất thấp Tuy nhiên, quá trình chuyển hóa này có thể dẫn đến các phản ứng phụ.
Vì có chuyển động nhiệt nên chúng vẫn có thể tương tác với nhau mà không cần enzyme xúc tác, xảy ra phản ứng phụ như sau:
1 O 2 là một dạng oxy đơn bội có năng lượng cao và rất độc hại, có khả năng phản ứng rất mạnh mẽ
Phản ứng phụ đáng chú ý nữa là phản ứng Haber – Weiss, xảy ra giữa superoxide và hydrogen peroxide tạo nên gốc hydroxyl ˙OH và oxy đơn bội
O 2 ˙¯ + H 2 O 2 → 1 O 2 + C + OH¯ (1) Bình thường phản ứng (1) xảy ra chậm, nhưng nếu có ion kim loại chyển tiếp như sắt và đồng xúc tác, phản ứng xảy ra nhanh hơn
Oxy đơn bội và gốc hydroxyl có tính phản ứng mạnh và độc hại, đóng vai trò chính trong quá trình peroxi hóa các chất Gốc hydroxyl dễ dàng phản ứng với các phân tử xung quanh, dẫn đến hiện tượng polymer hóa.
Khi R1H là một cao phân tử sinh học như protein hoặc ADN, và R2H là một chất dị sinh (xenobiotic), sẽ xảy ra liên kết đồng hóa trị giữa hai chất này, dẫn đến sự hình thành các tế bào lạ trong cơ thể Đối với các lipid, sự hiện diện của một gốc ˙OH hoặc một gốc R˙ có thể gây ra những phản ứng hóa học quan trọng.
SOD và Catalase đóng vai trò quan trọng trong việc peroxi hóa hàng trăm phân tử acid béo chưa bão hòa với nhiều nối đôi (LH) thông qua cơ chế phản ứng dây chuyền trước khi bị dập tắt.
Anion superoxide O₂˙¯ là sản phẩm đầu tiên được sinh ra, sau đó tạo ra nhiều chất khác như H₂O₂, HO˙, ¹O₂, LOOH, LOO˙, L˙ và các gốc tự do khác Tất cả những chất này được gọi là các dạng oxy hoạt động và có liên quan đến nhiều bệnh lý ở con người.
2.2.1.2 Cơ chế tác động của chất kháng oxy hóa
Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các dạng oxy hóa hoạt động
Chất kháng oxy hóa có khả năng phân hủy peroxide, oxy đơn bội và các gốc tự do khác, giúp dập tắt gốc tự do hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa sinh học thông qua các cơ chế gián tiếp.
Các hợp chất polyphenol tồn tại dưới hai dạng: dạng khử và dạng oxy hóa Dạng khử có khả năng phản ứng với các gốc tự do, dẫn đến sự hình thành dạng oxy hóa (quinon) Dạng oxy hóa này có thể chuyển đổi thành dạng lưỡng gốc, có khả năng phản ứng với hai gốc tự do khác, mặc dù quá trình chuyển hóa này diễn ra yếu hơn.
Các polyphenol (dạng ortho) có khả năng tạo phức với ion sắt (hoặc đồng), làm mất khả năng xúc tác của các ion kim loại này
Một vài loại chất kháng oxy hóa (vitamin E) có khả năng dập tắt chuỗi phản ứng oxy hóa của các acid béo chưa bão hòa nhiều nối đôi
L˙ (hay LOO˙) + VE → LH (hay LOOH) + VE˙
L˙ (hay LOO˙) + VE˙ → LH (hay LOOH) + TQ Trong đó:
LH: acid béo chưa bão hòa có nhiều nối đôi
Một trong những tác dụng kháng oxy hóa của vitamin C là đưa vitamin E từ dạng từ dạng oxy hóa về dạng khử [2]
Flavonoid là hợp chất màu phenol thực vật với cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, bao gồm hai vòng benzen A và B nối nhau qua một chuỗi ba carbon, thường được gọi là C6-C3-C6 Các loại flavonoid bao gồm flavon, flavonol, isoflavon và chalcon, trong đó flavon và flavonol là phổ biến nhất trong tự nhiên.
Flavonoid là nhóm hợp chất dễ kết tinh và thường có màu sắc đa dạng Flavon thường có màu vàng nhạt hoặc cam, trong khi flavonol có màu vàng đến vàng nhạt Chalcon lại mang màu vàng đến cam đỏ, còn isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoantocyanidin và catechin thường không có màu Đặc biệt, antocyanidin thường tồn tại dưới dạng glycosid, tạo ra màu xanh dương, đỏ và tím cho hoa và trái cây.
Flavonoid có cơ chế kháng oxy hóa hiệu quả bằng cách loại bỏ các gốc tự do như anion superoxide, gốc peroxy và gốc hydroxyl Ngoài ra, chúng còn triệt tiêu oxy đơn bội, tạo phức với ion kim loại và ức chế enzyme lipoxygenase, góp phần bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa.
Flavonoid có các nhóm –OH quan trọng trong việc triệt tiêu gốc tự do, với vị trí và số lượng các nhóm này ảnh hưởng đến hoạt tính của flavonoid Mức độ nhường điện tử được điều chỉnh bởi hai nhóm –OH ở vị trí ortho trên vòng benzen B, và sự hiện diện của một nhóm –OH ở vị trí 5’ cũng làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa Ngoài ra, các nhóm –OH trên vòng A tại vị trí 5, 7 hoặc 7, 8 cũng góp phần nâng cao hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid.
Hình 2.2: Cấu trúc của flavonoid [6]
Khả năng tạo phức với ion kim loại của flavonoid cần phải có cấu trúc 3’,4’- dihydroxyl, quan trọng nhất là C 4 quinone và C 3 hoặc C 5 – OH
Tannin là các hợp chất polyphenol phổ biến trong thực vật, tạo ra vị chát ở nhiều loại cây và trái Với trọng lượng phân tử từ 500 đến 3000, tannin có khả năng hòa tan trong nước nhờ chứa nhiều nhóm -OH, dẫn đến sự hình thành dung dịch nhớt.
Tannin được chia làm 2 nhóm: Tannin thủy giải được và tannin hóa đặc
Các công trình nghiên cứu trước đây
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về việc tách chiết polyphenol và kiểm tra hoạt tính của chúng từ các bộ phận của cây sen, bao gồm lá, thân rễ và đài sen.
2.3.1 Nghiên cứu về lá sen
Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc tách chiết các thành phần từ lá sen và kiểm tra hoạt tính của cao chiết từ ethanol và methanol Cao lá sen được chiết xuất bằng ethanol 60% ở nhiệt độ 80°C cho hàm lượng tổng polyphenol đạt 374 ± 7,5 mg/g và flavonoid là 203 ± 7,0 mg/g Phân tích thành phần polyphenol bằng HPLC đã xác định một số hợp chất như catechin rhamnoside, miricitrin-3-O-glucoside, hyperin, isoquercitrin, quercetin-3-O-rhamnoside, astragalin, cùng một số thành phần chưa xác định Đặc biệt, hoạt tính bắt gốc tự do của cao lá sen rất cao với giá trị IC50 là 4,172 ± 0,23 µg/ml (Bo Huang và cộng sự, 2010).
Cao lá sen chiết xuất bằng methanol cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, với khả năng bắt gốc tự do DPPH đạt 95,1 ± 0,2 % ở nồng độ 50 µg/ml (Ming-Jiuan Wu và cộng sự, 2003) [20].
Một nghiên cứu đã điều tra ảnh hưởng của các điều kiện trích ly đến hàm lượng flavonoid Kết quả cho thấy dung môi ethanol 70% mang lại hiệu quả trích ly cao nhất Phương pháp trích ly sử dụng sóng siêu âm với thời gian tác động 25 phút cho hiệu suất trích ly vượt trội so với các thời gian khác.
Hình 2.3: Công thức cấu tạo của chlorophyll a và b sử dụng thì ở tỉ lệ 1:30, thu được hàm lượng flavonoid cao và hiệu quả nhất (Lan Zhang và cộng sự, 2009) [18]
Lá sen không chỉ chứa polyphenol và flavonoid mà còn có alkaloid, một thành phần quan trọng với hoạt tính sinh học, được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược Trong luận án Tiến sĩ của Hoàng Thị Tuyết Nhung tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2012, tác giả đã tách chiết được 0,89 ± 0,04 % alkaloid toàn phần từ 70,00g bột lá sen bằng phương pháp chiết nóng với ethanol 96 độ, và thành công trong việc tinh chế nuciferin từ alkaloid này.
2.3.1 Nghiên cứu về một số bộ phận khác của cây sen
Nghiên cứu về thân rễ cây sen cho thấy, dung môi methanol có hiệu quả trích ly cao nhất với hàm lượng hợp chất phenol đạt 20,1 mg catechin/100g chất khô Tuy nhiên, khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao trích bằng ethyl acetate lại vượt trội hơn so với các dung môi ethanol và methanol Điều này cho thấy trong thân rễ của cây sen, các hợp chất phenol chủ yếu là những chất có tính phân cực trung bình (Dongmei Yang ME và cộng sự, 2007).
Cao trích ly bằng cồn của đài sen được chia thành bốn phân đoạn: cao ether petroleum (PEF), cao ethyl acetate (EAF), cao n-butanol (BF) và cao nước (AF) Trong đó, cao n-butanol (BF) có hàm lượng phenolic cao nhất với 607,6 mg/g, hàm lượng flavonoid đạt 862,7 mg/g và tổng số proanthocyanidin là 331,0 mg/g Các thành phần flavonoid trong đài sen được xác định bao gồm hyperoside, isoquercitrin, quercetin-3-O-β-D-glucuronide, isorhamnetin-3-O-β-D-galactoside và syringetin-3-O-β-D-glucoside.
Phân đoạn BF cho thấy khả năng bắt gốc tự do cao nhất với giá trị IC 50 là 5,4 ± 0,3 àg/ml, trong khi phân đoạn PEF có hoạt tính thấp nhất với IC 50 cao nhất là 103,4 ± 0,4 àg/ml Trong số 5 hợp chất được xác định, 3 hợp chất đầu tiên (1 – 3) có hoạt tính kháng oxy hóa cao với giá trị IC 50 lần lượt là 8.9 ± 0.2, 5.2 ± 0.2, và 7.5 ± 0.1 àg/ml, thấp hơn so với 2 hợp chất còn lại (Yan-Bin Wu và cộng sự, 2012) [19].
Nghiên cứu cho thấy cây sen, đặc biệt là lá sen, chứa nhiều hợp chất kháng oxy hóa Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích thành phần và chứng minh hoạt tính bằng cách sử dụng dung môi như ethanol hoặc methanol để trích ly Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng trong ngành thực phẩm vì các loại cao này không tan hoàn toàn trong nước.
Mục tiêu của nghiên cứu là tách chiết các hợp chất bằng dung môi nước và kiểm tra hoạt tính của cao nước, nhằm ứng dụng vào ngành công nghiệp nước giải khát và sản xuất nước uống có lợi cho sức khỏe.
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Khảo sát thành phần của lá sen
2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu
4 Kiểm tra khả năng kháng oxy hóa của cao lá sen
3.1 Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 3.2 Nhiệt độ nước trích ly
3 Khảo sát điều kiện trích ly hợp chất kháng oxy hóa trong lá sen
2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy
2.2 Khảo sát thời gian sấy
4.1 Khảo sát năng lực khử 4.2 Khả năng bắt gốc tự do (DPPH)
5 Khảo sát tách phân đoạn từ cao nước của lá sen bằng sắc ký cột
Sơ đồ 3.1: Quy trình thực nghiệm, tiến hành các khảo sát
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu dùng trong nghiên cứu
Lá sen dùng trong nghiên cứu có đường kính lá trong khoảng từ 15 – 20 cm, được thu hái tại huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang
Thời điểm thu hái lá sen lý tưởng là vào buổi sáng sớm từ 6h00 đến 6h30 hoặc buổi chiều tối từ 17h30 đến 18h00 Ngay sau khi thu hái, lá sen cần được sấy khô để đảm bảo chất lượng, trong khi đó, trong quá trình vận chuyển, lá sen được bảo quản trong hộp giấy carton và đã được làm khô lượng nước còn lại trên lá trước khi xếp vào hộp.
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ
- Một số loại hóa chất khác dùng trong các khảo sát
Dụng cụ và thiết bị:
- Cột thủy tinh dùng cho sắc ký có đường kính trong: 1 cm, 2,5 cm
- Bản silica gel 60 F 254 dùng trong sắc ký lớp mỏng
- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng
- Ống đong có thể tích 50 ml, 100 ml
- Bình định mức 10 ml, 25 ml, 100 ml
- Cân sấy ẩm hiệu MB 23 OHAUS của Mỹ
- Máy cô quay chân không
- Một số thiết bị khác có trong phòng thí nghiệm.
Các phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp trích ly các hợp chất kháng oxy hóa từ lá sen
Sử dụng phương pháp ngâm dầm theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) để trích ly các chất có khả năng kháng oxy hóa từ lá sen
Lá sen tươi được cắt nhỏ và sấy khô, sau đó bảo quản với độ ẩm ≤ 7,5% theo tiêu chuẩn TCVN 1455 – 1993 của trà xanh Để tiến hành nghiên cứu, cân 10,0 g lá sen khô cho vào bình Erlen 250 ml, sử dụng nước làm dung môi trích ly, đảm bảo dung môi ngập hoàn toàn phần lá sen Các khảo sát có thể được thực hiện để tìm ra các điều kiện tối ưu nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình trích ly.
3.2.2 Các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa
1,1-Diphenyl-2-picrylhyrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền màu tím, có độ hấp thu cực đại tại 517 nm Khi tiếp xúc với chất kháng oxy hóa, DPPH sẽ được khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng Việc đo độ giảm hấp thu ở bước sóng 517 nm cho phép xác định khả năng khử gốc DPPH của chất kháng oxy hóa.
Hình 3.1: Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hóa
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm bằng cách pha loãng 1 ml mẫu trích với methanol 80% ở các nồng độ khác nhau, sau đó trộn thêm 1,5 ml dung dịch DDPH nồng độ 200 µg/ml Hỗn hợp này được ủ trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, đo độ giảm hấp thu tại bước sóng 517 nm và thực hiện tương tự với mẫu đối chứng, thay thế 1 ml mẫu bằng dung môi.
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được tính theo phương trình sau:
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH (%) Ac = độ hấp thu của mẫu đối chứng ngay sau 30 phút ủ
A s = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ
Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với 50% DPPH được gọi là lượng tương đối Trolox phản ứng, cho phép xác định hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu Hoạt tính này có thể được biểu diễn bằng micromole Trolox trên 100g mẫu, đơn vị Trolox trên 100g, hoặc TE/100g (TE: trolox equivalent) và IC50 (µg/ml).
3.2.2.2 Khảo sát năng lực khử
Nguyên tắc khử Fe 3+ thành Fe 2+ thường được sử dụng như một chỉ số quan trọng để đánh giá hoạt tính điện tử của các hợp chất kháng oxy hóa.
Khả năng khử của cao chiết được xác định theo phương pháp của Ferreira và cộng sự (2007) bằng cách sử dụng 2,5 ml mẫu dịch chiết (10 mg/ml) kết hợp với 2,5 ml dung dịch đệm phosphate (0,2 M, pH 6,6) và 2,5 ml kali ferricyanide 1% Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 50 oC trong 20 phút, sau đó làm lạnh nhanh và thêm 2,5 ml acid trichloroacetic 10% trước khi ly tâm ở 6500 vòng trong 10 phút Cuối cùng, lấy 2,5 ml dịch nổi, thêm 2,5 ml nước cất và 0,5 ml clorua sắt 0,1%, rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm bằng máy đo OD.
3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng bằng Folin- Ciocalteau
Để xác định nồng độ acid gallic (10 – 160 mg/l), thực hiện pha trộn 0,4 ml dịch chiết mẫu với 3,6 ml nước cất và 0,4 ml thuốc thử Folin, sau đó ủ trong 5 phút Tiếp theo, thêm 4 ml Na2CO3 7%, định mức lên 10 ml bằng nước cất và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 90 phút Cuối cùng, đo độ hấp thu tại bước sóng 750 nm.
Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu được tính như sau:
- PP: Hàm lượng polyphenol tổng trong nguyên liệu (mg/g chất khô)
- M: Hàm lượng polyphenol trong mẫu đo quang học (mg/l)
- V: Thể tích dung môi dùng trích ly polyphenol (ml)
- m: Khối lượng mẫu đem trích ly (g)
3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng bằng so màu quang học
Flavonoid tổng được xác định qua phương pháp so màu bằng cách pha loãng 1ml dịch chiết mẫu (0,1 mg/ml) với 4 ml nước cất trong bình định mức 10 ml Sau đó, thêm 0,3 ml NaNO2 5% và chờ 5 phút, tiếp theo là 0,3 ml AlCl3 10% sau 6 phút Cuối cùng, thêm 2 ml NaOH 1M và định mức bằng nước cất lên 10 ml, trộn đều và đo quang phổ ở bước sóng 510 nm.
Flavonoid tổng số được xác định tương đương với số mg catechin/100g mẫu khô, dựa theo đường chuẩn với catechin là chất chuẩn (với nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 mg/l) [8]
Hàm lượng flavonoid trong nguyên liệu được tính như sau:
- TF: Hàm lượng flavonoid tổng trong nguyên liệu (mg/g chất khô)
- M: Hàm lượng flavonoid trong mẫu đo quang học ở bước sóng 510 nm (mg/l)
- V: Thể tích dung môi dùng trích ly mẫu (ml)
- m: Khối lượng mẫu đem trích ly (g)
3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng khoáng
Nguyên tắc xác định phần trăm khoáng có trong nguyên liệu là nung cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ ở nhiệt độ cao từ 550 đến 600 độ C Sau khi nung, phần còn lại sẽ được cân và tính toán để xác định tỷ lệ khoáng chất, chủ yếu là các khoáng chất ở dạng oxit hoặc muối.
Tính kết quả bằng công thức:
- X: Hàm lượng khoáng trong mẫu (%)
- m 1 : Khối lượng chén đã sấy ở 550 – 600 o C (g)
- m 2 : Khối lượng của chén và tro trắng sau khi nung (g)
3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng lipid
Nguyên tắc của quá trình này là làm khô nguyên liệu trước, sau đó sử dụng máy Soxhlet để trích ly lipid từ nguyên liệu bằng eter hoặc eter dầu hỏa, và cuối cùng xác định khối lượng lipid thu được.
Để thực hiện thí nghiệm, cân chính xác từ 2,00 đến 3,00 g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ Tiếp theo, gói kín các nguyên liệu này trong giấy lọc và tiến hành sấy ở nhiệt độ 105 độ C cho đến khi khối lượng ổn định Cuối cùng, ghi lại khối lượng của gói nguyên liệu sau khi sấy.
Để tiến hành trích ly lipid, đầu tiên xếp gói giấy chứa nguyên liệu vào ống thủy tinh hình trụ của máy Soxhlet Sau đó, ráp máy lại và cho eter vào trích ly cho đến khi không còn lipid, điều này được xác định khi dung môi trong ống hình trụ không có màu Một cách khác để kiểm tra là nhỏ một ít dung môi từ ống hình trụ lên giấy lọc; nếu vết loang không phân biệt trên nền giấy lọc, thì quá trình trích ly lipid đã hoàn tất.
- Lấy gói giấy lọc ra và sấy khô ở 105 o C cho đến khối lượng không đổi, cân lại gói giấy lọc này
- Lượng lipid trong mẫu được tính bằng công thức:
m 1 : Khối lượng gói nguyên liệu chưa trích lipid m 2 : Khối lượng gói nguyên liệu sau khi trích lipid m: Khối lượng nguyên liệu
3.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng – phương pháp phenol
Nguyên tắc của phản ứng màu đặc trưng là dựa vào sự tương tác giữa đường và các chất hữu cơ trong môi trường có mặt acid sulfuric H2SO4 đậm đặc Phản ứng này tạo ra màu sắc đặc trưng trong dung dịch đường khi sử dụng phenol.
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên, cho 1 ml dung dịch đường có khoảng 10 – 70 µg đường vào ống nghiệm, sau đó thêm 1 ml dung dịch phenol 5% Tiếp theo, cho vào ống nghiệm 5 ml H2SO4 đậm đặc, để hỗn hợp này trong 10 phút, rồi lắc đều và giữ trên nồi cách thủy trong 10 phút.
20 phút ở 25 – 30 o C để xuất hiện màu Đo cường độ màu ở bước sóng 490 nm
Xây dựng đồ thị mẫu: Dùng saccarose 0,1% pha thành một dãy nồng độ từ
Để thực hiện thí nghiệm, chuẩn bị một mẫu thử có nồng độ từ 10 đến 70 àg/ml Thay thế 1 ml dung dịch đường bằng nước cất, sau đó tiến hành đo màu ở bước sóng 490 nm bằng máy đo OD.
Quy trình điều chế cao lá sen dự kiến
Cao lá sen được chiết xuất bằng nước, dễ dàng hòa tan và có thể ứng dụng trong thực phẩm Quy trình này cần nhiều khảo sát để xác định các thông số phù hợp cho từng giai đoạn Ngoài ra, cao lá sen còn được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký cột để tách phân đoạn, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về thành phần flavonoid, polyphenol và tách các đơn chất.
3.4 Tiến hành các khảo sát
3.4.1 Khảo sát thành phần của lá sen
Mục đích: Xác định hàm lượng các chất có trong lá sen và sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng một số chất trong lá sen
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế cao tổng bằng nước dự kiến
- Hàm ẩm trong lá sen
- Hàm lượng khoáng của lá sen
- Hàm lượng flavonoid và polyphenol
- Hàm lượng đường tổng bằng phương pháp phenol
- Hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet
- Cân 1 – 2 g lá sen tươi, sử dụng cân sấy ẩm (hiệu MB 23 OHAUS của Mỹ) sấy đến khối lượng không đổi để xác định hàm ẩm
- Cân 5,00 g lá sen tươi, nung ở nhiệt độ 550 – 600 o C sau đó cân để tính hàm lượng khoáng
- Cân mỗi mẫu lá sen 10,00 g, sau đó nghiền nhỏ rồi trích ly bằng nước trong
24 giờ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng
- Dung dịch sau trích ly đem đi xác định hàm lượng polyphenol, hàm lượng flavonoid tổng số
3.4.2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu
Mục đích: Tìm ra điều kiện sấy thích hợp để sấy lá sen về độ ẩm phù hợp cho việc bảo quản lá sen dùng trong nghiên cứu
Bố trí thí nghiệm: Khảo sát nhiệt độ và thời gian sấy lá sen về độ ẩm thích hợp để bảo quản
- Khảo sát nhiệt độ: 60 o C, 70 o C, 80 o C, 90 o C, 100 o C Cố định thời gian trong
- Khảo sát thời gian: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút Cố định nhiệt độ sấy được chọn từ thí nghiệm trước
Chỉ tiêu theo dõi: Độ ẩm nguyên liệu, hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
Lá sen được cắt nhỏ với trọng lượng 20,0 g cho mỗi mẫu, sau đó được sấy trong điều kiện khảo sát với độ dày lớp lá sen trong khay dưới 0,50 cm Độ ẩm của nguyên liệu sau khi sấy được đo bằng cân sấy ẩm MB 23 OHAUS của Mỹ.
- Cân 5,00 g lá sen sau sấy, nghiền nhỏ và trích ly bằng nước nóng (80 o C) trong bể điều nhiệt 20 phút
- Dung dịch sau trích ly đem đi xác định hàm lượng polyphenol, hàm lượng flavonoid tổng số
3.4.3 Khảo sát điều kiện trích ly hợp chất kháng oxy hóa trong lá sen
3.4.3.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly
Mục đích: Xác định tỉ lệ nguyên liệu : dung môi thích hợp cho quá trình trích ly Dung môi sử dụng trích ly là nước
Bố trí thí nghiệm: Tiến hành khảo sát ở các tỉ lệ nguyên liệu : dung môi:
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
- Cân mỗi mẫu lá sen 5,00 g trích ly bằng nước nóng (80 o C) với các tỉ lệ khảo sát trong 20 phút trong bể điều nhiệt
- Dung dịch sau trích ly, xác định hàm lượng polyphenol, hàm lượng flavonoid tổng số
3.4.3.2 Khảo sát nhiệt độ nước dùng trích ly
Mục đích: Xác định nhiệt độ nước thích hợp cho quá trình trích ly
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát thí nghiệm với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi được lựa chọn phù hợp từ các khảo sát trước Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiều nhiệt độ nước khác nhau, cụ thể là 60 độ C, nhằm đánh giá hiệu quả của quá trình.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
- Cân mỗi mẫu lá sen 5,00 g, rồi trích ly bằng nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau trong 20 phút trong bể điều nhiệt
- Dung dịch sau trích ly đem đi xác định hàm lượng polyphenol, hàm lượng flavonoid tổng số
3.4.3.3 Khảo sát thời gian trích ly
Mục đích: Xác định thời gian trích ly phù hợp nhất
Trong bài thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành trích ly mẫu dưới các điều kiện cố định đã được xác định từ các thí nghiệm trước Thời gian trích ly được thay đổi thành các mốc 10 phút và 20 phút để đánh giá ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số
Cân mỗi mẫu lá sen với trọng lượng 5,00 g, sau đó nghiền nhỏ và tiến hành trích ly bằng tỉ lệ dung môi cùng nhiệt độ đã được chọn từ các thí nghiệm trước, trong các khoảng thời gian khác nhau.
- Dung dịch sau trích ly đem đi xác định hàm lượng polyphenol, hàm lượng flavonoid tổng số
3.4.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao lá sen
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện trích ly, cao tổng được điều chế theo sơ đồ 3.3 Khi thu được bột cao thô, các khảo sát tiếp theo sẽ được tiến hành.
Mục đích: Kiểm tra khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá sen bằng phương pháp DPPH, khả năng khử Fe 3+
Cao chiết được thu nhận dưới các điều kiện trích ly tối ưu sẽ được đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua các phương pháp kiểm tra, so sánh với mẫu đối chứng là vitamin C và BHA.
3.4.5 Khảo sát tách phân đoạn từ cao nước của lá sen bằng sắc ký cột
Sắc ký cột hở được sử dụng để tách các phân đoạn từ cao nước của lá sen, và sau đó tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn này.
Chất hấp thu được sử dụng là silica gel 60 với đường kính lỗ trung bình của hạt silica là 60 Å
Hệ dung môi khởi đầu cột được sử dụng là clorofrom : methanol với tỉ lệ 9:1, sau đó tăng dần độ phân cực bằng cách điều chỉnh tỉ lệ clorofrom : methanol (7:3, 5:5, 3:7), tiếp theo là methanol và methanol : nước với các tỉ lệ 9:1, 7:3, 5:5, 3:7, 1:9, cuối cùng là nước.
Sơ đồ 3.3: Quy trình điều chế cao tổng
Cột sắc ký được sử dụng là cột thủy tinh cao 80 cm và đường kính 2,5 cm, với mẫu được thu thập trong chai thủy tinh 100 ml Thể tích dung môi chứa mẫu là 50 ml, và vận tốc giải ly cột dao động từ 20 đến 30 giọt mỗi phút.
Trong quá trình giải ly cột, việc thực hiện sắc ký lớp mỏng là cần thiết để xác định các phân đoạn Những lọ có kết quả giải ly tương tự khi sử dụng sắc ký lớp mỏng sẽ được gom lại thành một phân đoạn duy nhất.
Sau khi thu được phân đoạn, tiến hành cô quay chân không để thu hồi cao của phân đoạn đó Đồng thời, kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH.
Tiến hành khảo sát
4.1 Kết quả khảo sát một số thành phần cơ bản trong lá sen
Lá sen tươi được kiểm tra sơ bộ về các thành phần như độ ẩm, đường tổng, hàm lượng flavonoid và polyphenol, với kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Một số thành phần cơ bản trong lá sen
Khảo sát cho thấy lá sen chứa hàm lượng flavonoid là 14,85 mg/g chất khô và polyphenol là 115,50 mg/g chất khô, cao hơn so với trà lá sen với flavonoid 10,59 mg/g và polyphenol 33,16 mg/g (Chang-Ho Jeong và cộng sự, 2012) Cụ thể, hàm lượng flavonoid và polyphenol trong lá sen cao gấp 2,1 lần và 16,4 lần so với lá gừng (Zingiber officinale), có hàm lượng flavonoid 7,05 mg/g và polyphenol 39,10 mg/g (Ali Ghasemzadeh và cộng sự, 2010) Do đó, nghiên cứu trích ly các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen là cần thiết.
4.2 Kết quả khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu
4.2.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả khảo sát một số thành phần cơ bản trong lá sen
Lá sen tươi được kiểm tra sơ bộ các thành phần như độ ẩm, đường tổng, hàm lượng flavonoid và polyphenol, với kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Một số thành phần cơ bản trong lá sen
Kết quả khảo sát cho thấy lá sen chứa hàm lượng flavonoid là 14,85 mg/g chất khô và polyphenol là 115,50 mg/g chất khô, cao hơn nhiều so với trà lá sen với flavonoid 10,59 mg/g và polyphenol 33,16 mg/g (Chang-Ho Jeong và cộng sự, 2012) Cụ thể, hàm lượng flavonoid và polyphenol trong lá sen cao gấp 2,1 lần và 16,4 lần so với lá gừng (Zingiber officinale), trong đó flavonoid là 7,05 mg/g và polyphenol là 39,10 mg/g (Ali Ghasemzadeh và cộng sự, 2010) Do đó, việc nghiên cứu và trích ly các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen là rất hợp lý.
Kết quả khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu
4.2.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy
Thí nghiệm được thực hiện ở nhiều nhiệt độ khác nhau trong thời gian sấy cố định là 20 phút Lá sen được cắt nhỏ và được trải đều trên khay với độ dày lớp lá đồng nhất.
< 0,50 cm Các mẫu sau khi sấy sẽ được đo độ ẩm, trích ly và xác định hàm lượng flavonoid và polyphenol Kết quả được trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy lá sen
Nhiệt độ ( o C) Độ ẩm (%) Flavonoid (mg/g) Polyphenol (mg/g)
* Chữ in thường khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa với =5%
Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng flavonoid và polyphenol
Kết quả từ phần mềm Statgraphics 3.0 cho thấy hàm lượng flavonoid và polyphenol ở các mẫu với nhiệt độ sấy khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Cụ thể, khi nhiệt độ sấy tăng, hàm ẩm còn lại trong nguyên liệu giảm Điều này được minh chứng qua bảng 4.2 và hình 4.1, cho thấy với thời gian sấy 20 phút, độ ẩm của mẫu sấy ở 90 và 100 oC giảm xuống còn 5,5% và 4,8%, trong khi mẫu sấy ở 60 oC vẫn giữ được độ ẩm 18,0%.
Mẫu lá sen được sấy ở nhiệt độ 60°C cho hàm lượng flavonoid và polyphenol cao nhất, với flavonoid đạt 5,37 mg/g và polyphenol đạt 44,07 mg/g Kết quả cho thấy nhiệt độ này ít ảnh hưởng đến các thành phần polyphenol và flavonoid Tuy nhiên, do độ ẩm của mẫu sau khi sấy vẫn rất cao (18,0%), nên không thể chọn nhiệt độ này để sấy nguyên liệu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol trong mẫu sấy ở nhiệt độ 70 o C (flavonoid 4,04 mg/g và polyphenol 34,96 mg/g) thấp hơn so với mẫu sấy ở 80 o C (flavonoid 4,48 mg/g và polyphenol 37,02 mg/g) với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức =5% Nguyên nhân có thể do hoạt động của enzyme polyphenoloxydase, trong đó nhiệt độ 70 o C là mức tối ưu cho enzyme này, dẫn đến sự giảm đáng kể hàm lượng polyphenol.
Mặc dù các mẫu lá sen được sấy ở nhiệt độ 90 o C và 100 o C có độ ẩm thấp (5,5% và 4,8%) giúp bảo quản lâu dài, nhưng hàm lượng các thành phần hoạt tính kháng oxy hóa lại rất thấp, do đó không nên chọn nhiệt độ này để sấy mẫu.
Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ lý tưởng để sấy mẫu lá sen, nhằm bảo toàn các thành phần hoạt tính, là 80 độ C.
4.2.2 Kết quả khảo sát thời gian sấy
Các mẫu lá sen được sấy ở nhiệt độ 80 o C trong các khoảng thời gian khác nhau, với bề dày lớp lá trong khay sấy nhỏ hơn 0,50 cm Sau khi sấy, lá sen sẽ được đo độ ẩm, trích ly bằng nước nóng ở 80 o C và xác định hàm lượng flavonoid và polyphenol, với kết quả được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của thời gian sấy đến độ ẩm, hàm lượng flavonoid và polyphenol
Thời gian (phút) Độ ẩm (%) Flavonoid (mg/g) Polyphenol (mg/g)
* Chữ in thường khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa với =5%
Theo bảng 4.3 và hình 4.3, tại nhiệt độ sấy 80 o C, thời gian sấy kéo dài dẫn đến lượng ẩm mất đi tăng lên Trong quá trình sấy, ẩm trên bề mặt nguyên liệu bay hơi trước, trong khi ẩm tự do từ bên trong cần thời gian để di chuyển ra ngoài Do đó, thời gian sấy dài hơn giúp quá trình thoát hơi ẩm diễn ra triệt để Tuy nhiên, các hợp chất có hoạt tính sinh học nhạy cảm với nhiệt độ cao, nên sấy lâu sẽ làm gia tăng sự oxy hóa, dẫn đến hàm lượng các chất này giảm.
Nhiệt độ ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid và polyphenol trong lá sen tươi, trong khi sự oxy hóa do enzyme polyphenoloxydase cũng có vai trò quan trọng Các mẫu lá sen sấy trong 10 và 20 phút có hàm lượng hoạt chất kháng oxy hóa thấp hơn so với mẫu sấy ở 30 và 40 phút, do enzyme chưa bị vô hoạt hoàn toàn dẫn đến oxy hóa nhanh hơn Cụ thể, mẫu sấy 10 phút ghi nhận hàm lượng flavonoid là 4,22 mg/g và polyphenol là 30,26 mg/g, là mức thấp nhất trong các mẫu nghiên cứu.
Thời gian sấy có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng flavonoid và polyphenol trong mẫu khảo sát Sau 10 phút sấy, độ ẩm của mẫu vẫn còn cao (15,6%), điều này cho thấy mẫu này không phù hợp để bảo quản nguyên liệu.
20 phút có độ ẩm 6,4% tuy đủ tiêu chuẩn để bảo quản (tham khảo TCVN 1455 –
Vào năm 1993, trà xanh có độ ẩm không vượt quá 7,5%, nhưng hàm lượng flavonoid và polyphenol chỉ đạt 5,82 mg/g và 43,55 mg/g, do đó thời điểm này không phù hợp để sấy lá sen.
Thời gian sấy lý tưởng cho lá sen là 30 phút, vì sau thời gian này, hàm lượng flavonoid và polyphenol đạt mức cao nhất, lần lượt là 7,13 mg/g và 47,35 mg/g, trong khi độ ẩm chỉ còn 5,4%, đáp ứng tiêu chuẩn bảo quản lâu dài (theo TCVN 1455 – 1993, độ ẩm không lớn hơn 7,5%) Mặc dù sấy ở 50 và 60 phút giúp giảm độ ẩm xuống rất thấp (4,8% và 3,6%), nhưng lại làm mất nhiều flavonoid và polyphenol, ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa Sấy lâu hơn 30 phút không chỉ lãng phí năng lượng mà còn không mang lại sự giảm đáng kể về độ ẩm.
Kết quả khảo sát điều kiện trích ly hợp chất kháng oxy hóa trong lá sen
Thí nghiệm được thực hiện với các tỉ lệ khác nhau giữa lá sen khô và nước, cùng với nhiệt độ trích ly 80 o C trong 30 phút Sau quá trình trích ly, hàm lượng flavonoid và polyphenol của các mẫu đã được xác định Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly (w/v)
* Chữ in thường khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa với =5%
Theo kết quả khảo sát thì khi tăng tỉ lệ từ 1:20 (flavonoid là 13,11 mg/g và polyphenol là 54,55 mg/g) tăng lên 1:25 (flavonoid là 14,08 mg/g và polyphenol là
Hình 4.3: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : nước đến hàm lượng flavonoid và polyphenol trong dịch chiết
Hàm lượng flavonoid và polyphenol trong dịch chiết tăng lên khi tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (ethanol 70%) được điều chỉnh, nhưng có giới hạn nhất định mà tại đó hàm lượng không còn tăng nữa Kết quả khảo sát của Lan Zhang và cộng sự (2009) cho thấy khi tăng tỉ lệ từ 1:20 lên 1:25 và 1:30, hàm lượng các chất thu được tăng tuyến tính, nhưng khi tiếp tục tăng lên 1:35 và 1:40, hàm lượng gần như không thay đổi so với 1:30 Quá trình trích ly ở tỉ lệ 1:20 gặp khó khăn do lượng nước thấp, dẫn đến hàm lượng chất thu được thấp hơn Mặc dù tỉ lệ 1:30 và 1:35 có hàm lượng flavonoid và polyphenol cao hơn 1:25, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Tương tự, tỉ lệ 1:40 cũng không khác biệt so với 1:25 Việc tăng lượng nước không làm tăng hiệu suất thu hồi mà còn tăng chi phí năng lượng, vì vậy tỉ lệ 1:25 là tỉ lệ tối ưu cho quá trình trích ly.
4.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly
Thí nghiệm được thực hiện với các nhiệt độ nước trích ly khác nhau, giữ nguyên tỉ lệ nguyên liệu và nước là 1:25 trong thời gian 30 phút Sau khi trích ly, hàm lượng flavonoid và polyphenol trong các mẫu được xác định và kết quả được trình bày trong bảng 4.5.
Bảng 4.5: Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly
Nhiệt độ ( o C) Flavonoid (mg/g) Polyphenol (mg/g)
* Chữ in thường khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa với =5%
Khảo sát cho thấy, việc tăng nhiệt độ nước trích ly giúp thu hồi nhiều polyphenol và flavonoid hơn Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, hàm lượng các chất này sẽ giảm, do nhiệt độ cao có thể làm hỏng các hợp chất sinh học trong nguyên liệu.
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ nước trích ly đến hàm lượng flavonoid và polyphenol
Mẫu trích ly ở nhiệt độ 60 o C và 70 o C cho hàm lượng flavonoid và polyphenol thấp, lần lượt là 6,72 mg/g và 65,03 mg/g ở 60 o C, 4,95 mg/g và 59,34 mg/g ở 70 o C, do nhiệt độ này chưa đủ để tăng tốc độ phá vỡ thành tế bào và khuếch tán chất hòa tan Ngược lại, mẫu trích ly ở 80 o C đạt hàm lượng flavonoid và polyphenol cao nhất, với 10,01 mg/g và 81,50 mg/g, nhờ vào việc tăng nhiệt độ giúp giảm độ nhớt dịch trích ly và tăng tốc độ khuếch tán các chất hòa tan vào nước.
70 o C (kết quả hàm lượng thu được của mẫu trích ly ở 80 o C là khác nhau có ý nghĩa thống kê với mẫu trích ly ở 60 và 70 o C với α = 5%)
Mẫu trích ly ở nhiệt độ 90 o C cho hàm lượng flavonoid 8,02 mg/g và polyphenol 75,33 mg/g, trong khi ở 100 o C, hàm lượng flavonoid giảm xuống 5,71 mg/g và polyphenol còn 73,57 mg/g Mặc dù nhiệt độ cao làm tăng tốc độ hòa tan các chất, nhưng cũng gây ra sự phá hủy các hợp chất này, dẫn đến hàm lượng thu được sau trích ly giảm.
Theo bảng 4.5, nhiệt độ nước trích ly 80 o C mang lại hàm lượng polyphenol và flavonoid cao nhất Do đó, nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly là 80 o C.
4.3.3 Kết quả khảo sát thời gian trích ly
Các mẫu được trích ly ở nhiệt độ 80 độ C với tỉ lệ nguyên liệu và nước là 1:25, trong các khoảng thời gian trích ly khác nhau Tiếp theo, hàm lượng flavonoid và polyphenol sẽ được xác định.
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly
Thời gian (phút) Flavonoid (mg/g) Polyphenol (mg/g)
* Chữ in thường khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau giữa các giá trị trung bình là có ý nghĩa với =5%
Thời gian trích ly cần được kéo dài để tối ưu hóa sự khuếch tán của các chất hòa tan từ nguyên liệu Nhiệt độ trích ly nước lý tưởng là 80°C, giúp tăng cường hiệu quả chiết xuất.
Thời gian trích ly có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng flavonoid và polyphenol có hoạt tính sinh học, và điều này rất nhạy cảm với nhiệt độ Việc trích ly quá lâu có thể dẫn đến sự oxy hóa các hợp chất phenol, làm giảm chất lượng của chúng.
Kết quả khảo sát trong bảng 4.6 cho thấy khi thời gian chiết xuất tăng từ 10 phút đến 40 phút, hàm lượng polyphenol và flavonoid cũng tăng theo Tuy nhiên, mẫu chiết xuất ở 50 phút lại có hàm lượng flavonoid giảm xuống còn 12,21 mg/g và polyphenol là 79,57 mg/g, thấp hơn cả mẫu chiết xuất ở 30 phút với hàm lượng flavonoid 13,00 mg/g và polyphenol 86,45 mg/g.
Hàm lượng polyphenol đạt 105,78 mg/g chất khô sau 40 phút trích ly, là mức cao nhất trong các mẫu khảo sát Trong khi đó, hàm lượng flavonoid ở mẫu trích ly 30 phút là 13,00 mg/g chất khô, cao hơn so với 12,79 mg/g chất khô của mẫu trích ly 40 phút, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α = 5%) Tuy nhiên, polyphenol trong lá sen chiếm ưu thế, gấp 7,78 lần so với flavonoid Do đó, thời gian trích ly tối ưu được khuyến nghị là 40 phút.
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng
4.4.1 Kết quả kiểm tra hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao tổng
Sau khi lựa chọn điều kiện trích ly phù hợp, cao tổng sẽ được điều chế theo sơ đồ trong chương 3 (hình 3.2) Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao tổng sẽ được kiểm tra so với vitamin C và BHA, với nồng độ cao tổng tăng từ 10 – 50 µg/ml Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 4.7 và bảng 4.8.
Hình 4.6: Cao tổng của lá sen
Bảng 4.7: Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao tổng
Nồng độ mẫu (àg/ml) Khả năng bắt gốc tự do
Bảng 4.8: Nồng độ IC 50 của cao tổng, vitamin C và BHA
Mẫu Cao lá sen Vitamin C BHA
Nồng độ IC 50 (àg/ml) 13,98 4,58 3,51
Kết quả khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cho thấy cao lá sen có khả năng kháng oxy hóa đáng kể, với hoạt tính tăng tuyến tính theo nồng độ khảo sát Nồng độ IC50 của cao tổng là 13,98 µg/ml, cao hơn 2,8 lần so với vitamin C (4,58 µg/ml) và 3,5 lần so với BHA (3,51 µg/ml) Mặc dù cao lá sen chiết bằng nước có nồng độ IC50 cao hơn, nhưng so với các dung môi khác như hexane (231,91 µg/ml), acetone (390,54 µg/ml) và methanol (230,62 µg/ml) trong nghiên cứu của P Arjun và cộng sự (2012), cao lá sen vẫn cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa khá cao.
Nghiên cứu của Ming-Jiuan Wu (2003) cho thấy cao lá sen được chiết xuất bằng methanol có khả năng bắt gốc tự do DPPH rất cao, đạt 95,1 ± 0,2 % ở nồng độ 50 µg/ml.
4.4.2 Kết quả khảo sát năng lực khử của cao tổng
Cao tổng đã được kiểm tra khả năng khử Fe 3+ và so sánh với vitamin C và BHA ở nồng độ từ 20 – 100 µg/ml Năng lực khử của các mẫu thí nghiệm được đánh giá dựa trên giá trị ΔOD đo ở bước sóng 700nm Kết quả cho thấy
OD của các chất khảo sát được trình bày trong bảng 4.9
Bảng 4.9: Năng lực khử của cao tổng, vitamin C và BHA
(àg/ml) Cao lỏ sen Vitamin C BHA
Kết quả khảo sát cho thấy cao lá sen có khả năng khử oxy mạnh mẽ, với năng lực khử đạt 27,91% so với vitamin C và 20,69% so với BHA ở nồng độ 100 µg/ml.
Kết quả kiểm tra khả năng bắt gốc tự do DPPH cho thấy lá sen (trích ly bằng nước) có hoạt tính kháng oxy hóa cao Điều này chứng tỏ rằng lá sen có thể được sử dụng làm nguyên liệu trong chế biến thực phẩm.
Kết quả khảo sát tách phân đoạn của cao tổng (cao nước của lá sen)
Cao tổng được tách phân đoạn qua sắc ký cột hở sử dụng silica gel 60 (90g) với lượng mẫu nạp 0,5g Dung môi giải ly ban đầu là hỗn hợp Clorofrom và Methanol theo tỉ lệ 9:1, và độ phân cực của dung môi sẽ tăng dần trong quá trình sắc ký Kết quả giải ly cột được tóm tắt trong bảng 4.10.
Hình 4.7: Năng lực khử của cao tổng, vitamin C và BHA
Bảng 4.10: Kết quả sắc ký cột silica gel 60 trên cao nước (0,5g) của lá sen
Dung môi giải ly cột
Thuốc thử hợp chất phenol
Hoạt tính kháng oxy hóa
1 → 7 CS1 C:M (9:1) 0,0321 2 vết (*) dương tính dương tính
C:M (7:3) 0,0175 1 vết (*) dương tính dương tính
12 → 15 CS3 C:M (7:3) 0,0502 2 vết (*) dương tính dương tính
16 → 27 CS4 C:M (7:3) 0,0621 2 vết (*) dương tính dương tính
C:M (3:7) 0,091 2 vết (*) dương tính dương tính
CS: Viết tắt của cao nước của lá sen (cao tổng)
(*): Dung môi giải ly sắc ký bản mỏng là Methanol
Đến nay, quá trình giải ly cột đã tách được 5 phân đoạn, tất cả đều có hoạt tính kháng oxy hóa và cho kết quả dương tính với thuốc thử Benedic Các phân đoạn này được giải ly bằng hệ dung môi từ phân cực trung bình đến phân cực mạnh, với tổng khối lượng cao của các phân đoạn chiếm khoảng 50,6% so với khối lượng cao ban đầu là 0,5g.
Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy phân đoạn CS1 và CS2 có hàm lượng cao thu được thấp nhất, với hai vệt chạy trên bản mỏng (a) hiển thị màu vàng nhạt khi sử dụng thuốc thử Benedict Tuy nhiên, khi thử với thuốc thử FeCl 3 5%, hai vệt này không hiện rõ màu xanh dương đen như các vệt khác, nhưng vẫn cho kết quả dương tính với thuốc thử DPPH 0,05% Điều này có thể giải thích bởi vì cao lá sen được chiết xuất bằng dung môi nước, dẫn đến việc chứa chủ yếu các hợp chất có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, hoặc có khối lượng phân tử lớn, do đó ở giai đoạn đầu giải ly cột với hệ C : M (9:1) chỉ thu được lượng cao rất ít.
CS1 CS2 CS3 CS4 CS5 CT CS1 CS2 CS3 CS4 CS5 CT CS1 CS2 CS3 CS4 CS5 CT
Hình 4.8 trình bày kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC) của các phân đoạn và cao tổng, được sắp xếp từ trái qua phải theo thứ tự: CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 và CT (cao tổng) Dung môi sử dụng để giải ly là methanol.
(a): TLC với thuốc thử Benedic, (b): TLC với thuốc thử FeCl 3 5%, (c): TLC với thuốc thử DPPH 0,05%
Tại phân đoạn CS3, giá trị Rf nằm trong khoảng 0,65 – 0,76, cho thấy vệt màu vàng đậm trên nền thuốc thử Benedic và màu xanh dương đậm trên nền thuốc thử FeCl3 5% Phân đoạn này chứa nhiều hợp chất phenol nhất trong năm phân đoạn được tách, đồng thời có khả năng bắt gốc tự do cao, như thể hiện trong bảng 4.11 Đây là giai đoạn khởi đầu quan trọng cho quá trình phân tích các chất, với lượng thu được lớn (0,0502 g) và hoạt tính cao, cho phép lựa chọn phân đoạn này để tiếp tục phân tích.
Trong phân đoạn CS4, vết đậm nhất với Rf = 0,625 xuất hiện màu khi thử nghiệm với cả hai thuốc thử nhận biết hợp chất phenol, đồng thời cũng hiện rõ trên vệt chạy của cao tổng Ở phân đoạn CS5, vết chạy xa nhất có Rf trong khoảng 0,563 – 0,65 mờ hơn, trong khi vết thứ hai có màu sắc rõ hơn với Rf từ 0,313 – 0,438, vị trí này cũng được thể hiện rõ trong hình b và c trên vệt chạy của cao tổng.
Các phân đoạn ban đầu thu được chứa nhiều chất khác nhau Để phân tích thành phần phenol trong cao tổng, có thể lựa chọn phân đoạn có khối lượng lớn hoặc phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh để tiếp tục nghiên cứu.
Bảng 4.11: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các phân đoạn của cao chiết
Khả năng bắt gốc tự do DPPH (%) của các phân đoạn
Nồng độ IC 50 (àg/ml) 39,97 9,25 43,76 17,25
Kết quả kiểm tra khả năng bắt gốc tự do DPPH cho thấy phân đoạn CS1 không có hoạt tính do mức độ thấp, dẫn đến việc không bắt được gốc tự do khi so sánh với các phân đoạn khác Trong số 4 phân đoạn còn lại, phân đoạn CS3 thể hiện hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 là 9,25 µg/ml và có khối lượng thu được cao, cho thấy tiềm năng của phân đoạn này trong các nghiên cứu tiếp theo.
Hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn theo thứ tự giảm dần hoạt tính như sau: CS3 > CS5 > CS2 > CS4 > CS1.