Viện Đại Học Mở Hà Nội VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI NẤM CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MẪU TRẦM TÍCH THU THẬP Ở VÙNG BIỂN THANH HĨA-QUẢNG BÌNH-QUẢNG TRỊ Người hướng dẫn 1: TS Lê Thị Hồng Minh Người hướng dẫn 2: ThS Nguyễn Mai Anh Sinh viên thực hiện: Đỗ Thị Huệ Lớp : ĐH 13-01 HÀ NỘI-2017 Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn sâu sắc đến toàn Ban Giám Hiệu Trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học dạy dỗ em suốt năm học vừa qua tạo điều kiện cho em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn TS Lê Thị Hồng Minh- Trưởng phịng Cơng nghệ Sinh học-Viện Hóa sinh biểnViện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, ThS Nguyễn Mai Anh TS Vũ Thị Quyên – người truyền cho em phương pháp học tập, nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em thời gian thực tập em vừa qua Đồng thời, em gửi lời cảm ơn chú, anh chị Phịng Cơng nghê Sinh học - Viện Hóa Sinh Biển, đặc biệt bạn Thúy Ngân giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập vừa qua Cuối em xin gửi đến lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ủng hộ động viên em suốt thời gian em thực tập Sau cùng, em xin kính chúc thầy Viện Đại học mở Hà Nội nói chung khoa Cơng nghệ Sinh học nói riêng thật nhiều sức khỏe, niềm tin để thực nhiệm vụ cao truyền kiến thức cho mai sau Trân trọng ! Sinh viên Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội Đỗ Thị Huệ MỤC LỤC PHẦN 1:MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi nấm ( microfungi ) 2.1.1 Vị trí vi nấm vi sinh vật đặc điểm chung vi nấm 2.1.2 Hình thái cấu tạo vi nấm 2.1.2.1 Hình thái cấu tạo nấm men 2.1.2.2 Hình thái cấu tạo nấm sợi 2.1.3 Khả sinh tổng hợp kháng sinh vi nấm 2.1.4 Ứng dụng vi nấm chất kháng sinh từ vi nấm 2.2 Các đặc tính độc đáo mơi trường biển 10 2.3 biển Các nghiên cứu nước hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm 10 2.4 Tình hình nghiên cứu nước 13 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu hóa chất 17 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.1.2 Hóa chất thiết bị 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Thu thập mẫu trầm tích biển 20 3.2.2 Phương pháp phân lập nấm: Theo (Atlas et al,2004) để phân lập vi nấm từ trầm tích biển 20 3.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Nguyễn Lân Dũng cs 1997) 21 3.2.4 Phương pháp xác định khả sinh enzyme chủng nghiên cứu:(Nguyễn Lân Dũng cs 1997) 22 3.2.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 22 3.2.4.2 Khả thủy phân Casein 22 3.2.4.3 Khả thủy phân Cellulose (CMC) 22 Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.2.5 Phương pháp phân loại nấm kĩ thuật sinh học phân tử 23 3.2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ nấm biển 23 3.2.5.2 Phương pháp PCR 23 3.2.5.3 Giải trình tự 25 PHẦN 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết lấy mẫu trầm tích thu khu vực vùng biển Thanh Hóa-Quảng BìnhQuảng Trị 26 4.2 Phân lập nấm từ trầm tích biển 26 4.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 28 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 30 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 30 4.4.2 Khả thủy phân protein (casein) 31 4.4.3 Khả thủy phân cellulose (CMC) 32 4.5 Kết định danh sinh học phân tử chủng vi nấm nghiên cứu 33 4.5.1 Tách chiết ADN tổng số từ nấm 33 4.5.2 Nhân gen 18S ADN riboxom 34 4.5.3 Kết giải trình tự gene 18S chủng vi nấm 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ADN Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh LB Lauria Betani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope UV Ultraviolet VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm biển Bảng 3.1.Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.2 Chu trình chạy PCR Bảng 4.1 Danh sách mẫu trầm tích thu thập vùng biển Thanh HóaQuảng Bình-Quảng Trị Bảng 4.2 Danh sách 13 chủng nấm phân lập Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định Bảng 4.4 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ba chủng nấm có hoạt tính cao Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1 Một số hình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu Hình 4.2 Hình ảnh phân lập làm số chủng nấm Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ Hình 4.5 Kết thử khả phân giải tinh bột Hình 4.6 Kết thử khả phân giải casein Hình 4.7 Kết thử khả phân giải CMC Hình 4.8: Kết điện di đồ ADN tổng số ba chủng nấm Hình 4.9: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 18S rADN chủng Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 1:MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trầm tích biển bề mặt dồi dinh dưỡng, trở thành thuộc địa cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Ngồi ra, mơi trường biển với đặc điểm áp suất, độ mặn, nhiệt độ, độ sâu góp phần vào phát triển độc đáo cung cấp nguồn vi sinh vật phong phú Với độ đa dạng sinh học cao, vi sinh vật biển đóng vai trị quan trọng vịng tuần hồn sinh địa hóa ngun tố Những vi sinh vật tìm thấy nơi đại dương từ bề mặt đến thềm đáy biển, thể sinh vật biển hay dòng hải lưu Vi sinh vật biển từ lâu biết đến số nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh chất hữu với cấu trúc hóa học đa dạng có hoạt tính sinh học thú vị (Rahman et al.2010), nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống nhờ tính chất đặc hiệu chúng Thuốc kháng sinh đột phá lớn y học đại Do gia tăng bệnh mới, số nhóm vi sinh vật kháng thuốc độc tính số thuốc kháng sinh bán tổng hợp sử dụng, nhà khoa học chuyển hướng nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có giá trị dược học từ vi sinh vật biển Đến nay, với số lượng lớn hợp chất có hoạt tính sinh học phát hiện, vi sinh vật biển trở thành mục tiêu quan trọng ngành Sinh học, Hóa học Y dược đường tìm kiếm sản xuất loại thuốc mới, hoạt chất kháng khuẩn chống ung thư Môi trường biển Việt Nam, với nghiên cứu nhóm vi sinh vật vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam, nấm mốc có khả sinh chất kháng khuẩn ức chế tế bào ung thư chưa nhiều, kết đánh giá độ đa dạng sinh học mức độ chọn lọc thu cho thấy, vi sinh vật từ hệ sinh thái vùng biển Việt Nam nguồn nguyên liệu tiềm hứa hẹn nhiều triển vọng Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu sàng lọc chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh phân lập từ mẫu trầm tích thu thập vùng biển Thanh Hóa-Quảng Bình-Quảng Trị” Nhằm tạo tiền đề cho nghiên Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội cứu hợp chất thứ cấp từ vi nấm, từ xác định số chất có hoạt tính sinh học có khả ứng dụng y dược đời sống 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập nghiên cứu hoạt tính sinh học vi nấm (hoạt tính kháng sinh khả sinh enzyme) để từ tuyển chọn số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế 1.3 Ý nghĩa đề tài Bước đầu tiến hành nghiên cứu vi nấm từ trầm tích biển từ tiến tới khai thác nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật biển nói chung vi nấm từ trầm tích biển nói riêng Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi nấm ( microfungi ) 2.1.1 Vị trí vi nấm vi sinh vật đặc điểm chung vi nấm Vi nấm nhóm nấm có kích thước hiển vi Vi nấm khác với vi khuẩn xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, chúng xếp vào nhóm Eukaryotes Vi nấm gồm nhóm lớn: nấm men (Yeast) nấm sợi (Filamentous fungi), nấm men có cấu trúc đơn bào, nấm sợi có cấu trúc đa bào Nấm sợi gọi nấm mốc Vi nấm xếp loại giới nấm bao gồm nấm lớn Nấm có nhiều đặc điểm chung với vi sinh vật nhân thật cấu tạo Nấm khác hẳn nhiều mặt so với vi sinh vật thuộc nhóm nhân nguyên thủy vi khuẩn vi khuẩn lam Cơ thể tản (thallus) tức thể có máy dinh dưỡng chưa phân hóa thành quan riêng biệt Tản nấm đơn bào hay đa bào, đa số có dạng sợi gọi sợi nấm hay khuẩn ti (hypha) Sợi nấm có hay khơng có vách ngăn (sept) Sợi nấm có đường kính trung bình 510µm Có sợi nấm suốt khơng màu, có sợi có màu Một số sợi nấm tiết hợp chất hữu kết tinh bề mặt sợi nấm Đa số sợi nấm phân nhánh nhiều lần có sợi khơng phân nhánh Từ bào tử hay đoạn sợi nấm gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm phát triển theo ba chiều tạo thành hệ sợi nấm Ở số nấm sợi nấm quấn chặt với nhau, chí dính liền với tạo hình thái nấm đặc biệt nấm thể đệm (stroma), hạch nấm (aclerotium), rễ giả (synnema) Các vách ngang sợi nấm ngăn vách có lỗ thơng Tùy loại nấm mà vách ngang có lỗ thơng lớn giữa, có loại có nhiều lỗ thơng tương đối nhỏ, có loại có lỗ thơng mép lỗ dày lên bề ngồi có màng mỏng che phủ (màng parenthesome ) Qua lỗ thông chất nguyên sinh qua mà nhân tế bào thót nhỏ lại để chui qua Nhân tế bào sợi nấm thường di chuyển đến phần nấm sợi có hoạt động mạnh mẽ Như sợi nấm có vách ngăn hay khơng có vách ngăn thực chất ống dài có chứa nguyên sinh chất nhiều nhân tế bào Trừ nấm men đơn bào sợi nấm rõ ràng chưa có cấu tạo điển sinh vật nhân thật Đỗ Thị Huệ Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 4.3: Kết thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định STT Tên chủng Vi sinh vật kiểm định (D-d=mm) Escherichia Pseudomonas Salmonella aeruginosa coli enterica ATCC25922 ATCC27853 ATCC12228 Enterococcus Stapphylococcus faecalis aureus ATCC13124 ATCC25923 Bacillus cereus Candida albicans ATCC 13245 ATCC1023 M01 - - - - 10 - - M02 - - - - - - - M03 - - - - - 11 - M04 - - - - - - - M05 - 12 - - - - - M06 - - - - 25 - 26 M07 - - - - 13 - 14 M08 13 - - - - - M09 - - - - - - - 10 M13 - - - - - - - 11 M16 - - - - 12 12 M19 - - - - - - - 13 M21 - - - - Quan sát bảng kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng nấm nghiên cứu cho thấy, hầu hết chủng phân lập có hoạt tính kháng chủng gây bệnh, khả kháng chủng khác Chúng lựa chọn chủng nấm có khả kháng tác nhân gây bệnh mạnh: M06, M07 M16 Hình 4.4 số hình ảnh thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định khuyếch tán đĩa thạch Bảng 4.4 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ba chủng nấm có hoạt tính cao S T T Tên chủng Bacillus cereus ATCC1324 Candida albicans ATCC1023 Stapphylococcus aureus ATCC25923 (D-d=mm) (D-d=mm) (D-d=mm) M06 26 25 M07 14 13 M16 6 Đỗ Thị Huệ 12 29 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.4 :Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ A: Kết thử hoạt tính kháng Stapphylococcus aureus ATCC25923 chủng B: Kết thử hoạt tính kháng Candida albicans ATCC1023 chủng C: Kết thử hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC13245 chủng M16 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan Sau nuôi cấy nấm mơi trường có bổ sung 2% tinh bột tan Sau ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 2ml dung dịch thuốc thử lugol pha loãng 50% để thử Nếu nấm có enzyme có khả thủy phân tinh bột tan chúng tạo thành vịng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển có màu trong, phía bên ngồi có màu xanh tím Kết cho thấy chủng nấm có khả sinh enzyme amylase M06, M07 M16 Môi trường xung quanh nấm màu suốt, phía bên ngồi màu xanh tím Ba chủng nấm M06, M07 M16 có khả sinh enzyme với đường kính vịng phân giải lượt 16mm (A), 12mm (B), 7mm (C) Đỗ Thị Huệ 30 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.5 Kết thử khả phân giải tinh bột A: Kết thử khả thủy phân tinh bột tan chủng M06 (16mm) B: Kết thử khả thủy phân tinh bột tan chủng M07 (12mm) C: Kết thử khả thủy phân tinh bột tan chủng M16 (7mm) Từ kết trên, ta thấy chủng chủng M06 có vịng phân giải rộng rõ (16mm), điều chứng tỏ khả sinh enzyme amylase chủng M06 tốt 4.4.2 Khả thủy phân protein (casein) Sau nuôi cấy nấm mơi trường nấm có bổ sung 2% casein Sau ngày ni cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 2ml dung dịch thử lugol pha loãng 50% để thử Nếu nấm sinh enzyme có khả phân giải casein chúng tạo thành vịng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển suốt, phía bên ngồi màu nâu đỏ Kết cho thấy chủng nấm M06, M07 M16 có phản ứng dương tính Mơi trường nấm xung quanh khơng màu, suốt Phía bên ngồi có màu nâu đỏ Ba chủng M06, M07 M16 có khả sinh enzyme protease với đường kính vịng phân giải 13mm (A), 11mm (B) 13mm (C) Đỗ Thị Huệ 31 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.6 :Kết thử khả phân giải casein A: Kết thử khả phân giải casein chủng M06 (13mm) B: Kết thử khả phân giải casein chủng M07 (11mm) C: Kết thử khả phân giải casein chủng M16 (13mm) Từ kết trên, ta thấy chủng chủng M06 M16 có vịng phân giải to rõ (13mm), điều chứng tỏ khả sinh enzyme protease chủng M06 M16 tốt 4.4.3 Khả thủy phân cellulose (CMC) Nuôi cấy nấm mơi trường nấm có bổ sung 2% CMC Sau ngày ni điều kiện thích hợp lấy nhỏ 2ml lugol pha loãng 50% để thử Nếu nấm có enzyme có khả phân hủy CMC chúng tạo vịng phân giải xung quanh vị trí nấm phát triển có màu trong, phía bên màu nâu đỏ Kết cho thấy chủng nấm M06, M07 M16 có phản ứng dương tính: Mơi trường xung quanh khơng màu, suốt Phía bên ngồi cịn có màu đỏ Ba chủng nấm M06, M07 M16 có khả sinh enzyme khả phân hủy CMC với đường kính vịng phân giải 9mm (A), 10mm (B), 11mm (C) Đỗ Thị Huệ 32 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.7:Kết thử khả phân giải cenllulose A: Kết thửkhả phân giải cellulose chủng M06 (9mm) B: Kết thử khả phân giải cellulose chủng M07 (10mm) C: Kết thử khả phân giải cellulose chủng M16 (11mm) Từ kết trên, ta thấy chủng chủng M16 có vịng phân giải rộng rõ (11mm), điều chứng tỏ khả sinh enzyme cellulase M16 tốt 4.5 Kết định danh sinh học phân tử chủng vi nấm nghiên cứu 4.5.1 Tách chiết ADN tổng số từ nấm Để khẳng định chắn định danh đến lồi chủng nghiên cứu, chúng tơi tiến hành giải trình tự gen 18S ADN riboxom M06, M07 M16 để hỗ trợ cho việc định danh chủng Từ dịch nuôi cấy chủng nấm chọn, qua nhiều bước xử lý thu ADN genome Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agarose 0,8% Hình ảnh điện di (Hình 4.8) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gẫy, sử dụng làm khn cho phản ứng PCR Đỗ Thị Huệ 33 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.8: Kết điện di đồ ADN tổng số ba chủng nấm Đường chạy số ADN tổng số chủng M06 Đường chạy số ADN tổng số chủng M07 Đường chạy số ADN tổng số chủng M16 4.5.2 Nhân gen 18S ADN riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi NS3F NS8R tiến hành PCR nhân đoạn gen 18S với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Hình 4.9: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 18S rADN chủng 1500 bp 1000 bp 1239 bp Giếng 3,4,5: Sản phẩm PCR chủng tương ứng M06, M16 M07 Giếng 1: thang ADN chuẩn 1Kb Invitrogen Đỗ Thị Huệ 34 Viện Đại Học Mở Hà Nội Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ 18S ADN riboxom nấm khn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1239 bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (hình 4.9) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng nằm hai băng 1000 bp 1500 bp thang ADN chuẩn Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hồn tồn phù hợp với mục đích nhân dịng đoạn gen 18S chủng nghiên cứu Để khẳng định chắn khuyếch đại đoạn gen 18S ADN riboxom chủng nấm có hoạt tính cao, tiến hành tinh lượng lớn sản phẩm PCR để tiến hành đọc trình tự nucleotit 4.5.3 Kết giải trình tự gene 18S chủng vi nấm Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger&đtg Sau xử lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, chúng tơi nhận trình tự hồn chỉnh gen 18S ARN riboxom chủng sau: * Trình tự đoạn gen 18S ARN riboxom chủng M6 có độ dài 1185 bp Tỷ lệ: A(24% 291); T(27% 303); G(28% 333); C(21% 258) TTGCCATCGC GGGTCTGGCT GGGAACCTCA AGAGTGTTCA GTGGTTCTAT GTCAGTATTC AGCATTCGCC CAGATACCGT AATGACCCGT CGCAAGGCTG TTAATTTGAC GAGAGCTCTT TTTGTCTGCT TTGCGGGCCG TAACAGGTCT AGCGAGTACA GGATAGAGCA GCTCGTGCCG TGGCTCAGTG AACTTGGTCA TCATAGCGTA GGCCGGTCCG TGGCCTTCAC AAGCAGGCCT TTTGTTGGTT AGCTGTCAGA AAGGATGTTT CGTAGTCTTA TCGGCACCTT AAACTTAAAG TCAACACGGG TCTTGATCTT TAATTGCGAT CTGGCTTCTT GTGATGCCCT TCACCTTAAC TTGCAATTAT ATTACGTCCC AGGCCTTGGG AACTCGGTCA TATTAAGTTG CCTCACCGCG TGGCTGTGGG TTGCTCGAAT TCTAGGACCG GGTGAAATTC TCATTAATCA ACCATAAACT ACGAGAAATC AAATTGACGG GAAACTCACC TTGGATGGTG AACGAACGAG AGGGGGACTA TAGATGTTCT CGAGAGGTTT TGCTCTTCAA TGCCCTTTGT ATTGGCTTAG TTAGAGAAGT TTGCAGTTAA AGTACTGGTC GGGAACCAGG ACATTAGCAT CCGTAATGAT TTGGATTTGC GGGAACGAAA ATGCCGACTA AAAGTTTTTG AAGGGCACCA AGGTCCAGAC GTGCATGGCC ACCTCGGCCC TCGGCTCAAG GGGCCGCACG GGGTAATCTT CGAGGAATGC ACACACCGCC GAGGGTTGGC AAAGTAGGAA AAAGCTCGTA CGGCTGGACC ACTTTTACTG GGAATAATAG TAATAGGGAT TGAAGACTAA GTTAGGGGAT GGGATCGGAC GGTTCTGGGG CAAGGCGTGG AAAATAAGGA GTTCTTAGTT TTAAATAGCC CCGATGGAAG CGCGCTACAC GTTAAACCCT CTAGTAGGCA CGTCGCTACT AACGACCCCC ACCTG GTTGAACCTT TTTCCTTCTG TGAAAAAATT AATAGGACGT AGTCGGGGGC CTACTGCGAA CGAAGACGAT GGGATTCTAT GGAGTATGGT AGCCTGCGGC TTGACAGATT GGTGGAGTGA CGGTCCGCAT TGCGCGGCAA TGACAGGGCC GTCGTGCTGG CGAGTCATCA ACCGATTGAA CAGAGCCGAA Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng M6 với trình tự gen 18S ARN riboxom nấm khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) với gen 18S ARN riboxom Penicillium chrysogenum ZJ-T2 (HQ882177) phân lập vùng biển Trung Quốc năm 2011 * Trình tự đoạn gen 18S ARN riboxom chủng M7 có độ dài 1183 bp Tỷ lệ: A(23% 277); T(27% 296); G(28% 343); C(22% 267) Đỗ Thị Huệ 35 Viện Đại Học Mở Hà Nội GGGGTTCCTC GTCTGGCTGG GAATCCCATG AGTGTTCAAA GGTTCTATTT CAGTATTCAG CATTCGCCAA GATACCGTCG ATGACCCGCT GCAAGGCTGA TAATTTGACT AGAGCTCTTT TTGTCTGCTT CGCGGGCCGC AACAGGTCTG GCGAGTACAT GATAGAGCAT CTCGTGCCGA GGCTCGGTGA AGTTGGTCAA ATAGCGTATA CCGGTCCGCC GCCTTCACTG GCAGGCCTTT TGTTGGTTTC CTGTCAGAGG GGATGTTTTC TAGTCTTAAC CGGCACCTTA AACTTAAAGA CAACACGGGG CTTGATCTTT AATTGCGATA TGGCTTCTTA TGATGCCCTT CACCTTGGCC TGCAATTATT TTACGTCCCT GGCCTTCGGA ACCCGGTCAT TTAAGTTGTT TCACCGCGAG GCTGTGGGTG GCTCGAATAC TAGGACCGCC TGAAATTCTT ATTAATCAGG CATAAACTAT CGAGAAATCA AATTGACGGA AAACTCACCA TGGATGGTGG ACGAACGAGA GGGGGACTAT AGATGTTCTG GAGAGGCCCG GCTCTTCAAC GCCCTTTGTA CTGGCGCAGG TAGAGAAGAA GCAGTTAAAA TACTGGTCCG GAACCAGGAC ATTAGCATGG GTAATGATTA GGATTTGCTG GAACGAAAGT GCCGACTAGG AAGTTTTTGG AGGGCACCAC GGTCCAGACA TGCATGGCCG CCTCGGCCCT CGGCTCAAGC GGCCGCACGC GGTAATCTTG GAGGAATGCC CACACCGCCC AGGGTTGGCA AAGTTGTTTT AGCTCGTAGT GCTGGACCTT TTTTACTGTG AATAATAGAA ATAGGGATAG AAGACTAACT TAGGGGATCG GATCGGGCGG GTTCTGGGGG AAGGCGTGGA AAATAAGGAT TTCTTAGTTG TAAATAGCCC CGATGGAAGT GCGCTACACT TTAAACCCTG TAGTAGGCAC GTCGCTACTA ACGACCCCCC GGG TGAACCTTGG TCCTTCTGGG AAAAAATTAG TAGGACGTGC TCGGGGGCGT ACTGCGAAAG AAGACGATCA CGTTTCTATG GAGTATGGTC GCCTGCGGCT TGACAGATTG GTGGAGTGAT GGTCCGCGTC GCGCGGCAAT GACAGGGCCA TCGTGCTGGG GAGTCATCAG CCGATTGAAT CGCGCCGGAA Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng M7 với trình tự gen 18S ARN riboxom nấm khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) với gen 18S ARN riboxom chủng Aspegillus sp Y38-1 (KP872505) phân lập từ nước biển Ấn Độ Dương Trung Quốc công bố năm 2015 * Trình tự đoạn gen 18S ARN riboxom chủng M16 có độ dài 1185 bp Tỷ lệ: A(23% 283); T(28% 302); G(28% 341); C(21% 259) ATGCATCGCT GGTCTGGCTG GGAACCTCAT GAGTGTTCAA CGGTTCTATT TCAGTATTCA GCATTCGCCA AGATACCGTT GATGACCCGC CGCAAGGCTG TTAATTTGAC GAGAGCTCTT TTTGTCTGCT TTGCGGGCCG TAACAGGTCT AGCGAGTACA GGATAGAGCA GCTCGTGCCG TGGCTCGGTG AAGTTGGTCA Đỗ Thị Huệ CATAGCGTAT GCCGGTCCGC GGCCTTCACT AGCAGGCCTT TTGTTGGTTT GCTGTCAGAG AGGATGTTTT GTAGTTTTAA TCGGCACCTT AAACTTAAAG TCAACACGGG TCTTGATCTT TAATTGCGAT CTGGCTTCTT GTGATGCCCT TCACCTTGGC TTGCAATTAT ATTACGTCCC AGGCCTTCGG AACTCGGTCA ATTAAGTTGT CTCACCGCGA GGCTGTGGGG TGCTCGAATA CTAGGACCGC GTGAAATTCT CATTAATCAG CCATTAACTA ACGAGAAATC AAATTGACGG GAAACTCACC TTGGATGGTG AACGAACGAG AGGGGGACTA TAGATGTTCT CGAGAGGTCT TGCTCTTCAA TGCCCTTTGT ACTGGCTCAG TTAGAGGAAG TGCAGTTAAA GTACTGGTCC GGAACCAGGA CATTAGCATG CGTAATGATT TGGATTTGCT GGAACGAAAG TGCCGACTAG AAAGTTTTTG AAGGGCACCA AGGTCCAGAC GTGCATGGCC ACCTCGGCCC TCGGCTCAAG GGGCCGCACG GGGTAATCTT CGAGGAATGC ACACACCGCC GGGAGTTGGC AAAAGTAGAA AAGCTCGTAG GGCTGGACCT CTTTTACTGT GAATAATAGA AATAGGGATA GAAGACTAAC TTAGGGGATT GGATTGGGCG GGTTCTGGGG CAAGGCGTGG AAAATAAGGA GTTCTTAGTT TTAAATAGCC CCGATGGAAG CGCGCTACAC GTTAAACCCT CTAGTAGGCA CGTCGCTACT AACGACCCCC CCCGG TTGAACCTTG TTCCTTCTGG GAAAAAATTA ATAGGACGTG GTCGGGGGCG TACTGCGAAA GAAGGCGATC GTGTTTCTAT GGAGTATGGT AGCCTGCGGC TTGACAGATT GGTGGAGTGA CGGTCCGCAT TGCGCGGCAA TGACAGGGCC GTCGTGCTGG CGAGTCATCA ACCGATTGAA CAGAGCCGGA 36 Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng M16 với trình tự gen 18S rARN riboxom nấm đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) với gen 18S ARN riboxom Aspegillus fumigatus MJ-X6 (HM590663) phân lập từ Trung Quốc năm 2013 Từ kết so sánh trình tự gene 18S rARN riboxom chủng phân lập Chúng tơi kết luận chủng M6 thuộc chi Penicillium, chủng M7 chủng M16 thuộc chi Aspegillus Để khẳng định chắn đến lồi, chúng tơi cần phải có nghiên cứu hình thái khuẩn lạc kính hiển điện tử, đặc điểm lý sinh hóa sinh chủng chọn Hiện công nghệ sinh học sử dụng số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu loài A niger, A oryzae, công nghệ sản xuất enzyme (amylaza, glucoamylaza, pectinaza, cellulaza, proteaza), công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghệ sản xuất acid hữu acid citric, acid gluconic Nhiều lồi thuộc chi nấm có hoạt tính biến đổi sinh học, số lồi tạo thành độc tố (mycotoxin), đặc biệt loài tạo thành độc tố gây ung thư gan loài A flavus, A parasiticus tạo thành aflatoxin Nghiên cứu chọn lọc chủng thuộc loài A awamori, A niger, A oryzae có hoạt tính amylaza glucoamylaza để phân giải tinh bột sắn Nghiên cứu thu nhận sử dụng proteaza từ A oryzae sản xuất nước chấm, để khử lông da súc vật Thu nhận sử dụng pectinaza, amylaza từ A niger để xử lý dược liệu nguồn gốc từ thực vật Nghiên cứu sử dụng số chủng thuộc loài A niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi Nghiên cứu lựa chọn chủng A niger TH3-19K Nhật Bản có hoạt tính glucoamylaza cao dùng để phân hủy tinh bột sống Nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphat khó tan cellulose A japonicus, khả phân giải cellulose chủng ưu nhiệt thuộc loài A unilateralis [3] Nhiều lồi thuộc chi Penicillium dùng cơng nghệ kháng sinh Trong công nghệ sản xuất kháng sinh nay, số chủng xử lý đột biến P chrysogenum dùng để sản xuất kháng sinh tự nhiên (penicillin G, penicillin V ) axit 6-aminopenicillamic (dùng để sản xuất penicillin bán tổng hợp ampicillin,oxacillin Ngoài số loài khác thuộc chi Penicillium dùng công nghệ chế biến thực phẩm công nghệ sản xuất phomat (P Đỗ Thị Huệ 37 Viện Đại Học Mở Hà Nội roqueforti) Nhiều loài nghiên cứu khả tạo thành acid hữu cơ, hoạt tính enzyme số sản phẩm trao đổi khác Trong chi Penicillium cần lưu ý số lồi có khả tạo thành mycotoxin, đặc biệt mycotoxin có khả gây ung thư gan loài P islandicum tạo thành độc tố islandotoxin luteoskirin, loài P urticae tạo thành palutin [3] Aspergillus Penicillium có vai trị to lớn thiên nhiên đời sống người Việc nghiên cứu hai chi góp phần đánh giá đa dạng thành phần loài số lượng loài Đồng thời góp phần quan trọng việc xác định lồi có khả sinh chất sinh học quý kháng sinh, enzyme chất có hoạt tính sinh học khác [3] Đỗ Thị Huệ 38 Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 - Kết luận Từ mẫu trầm tích biển thu vùng biển Thanh Hóa-Quảng Bình-Quảng Trị,đã tuyển chọn 13 chủng vi nấm thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Đã chọn chủng có khả kháng vi sinh vật kiểm định tốt Chủng M06,M07 M16 có đường kính kháng Candida albicansATCC1023 tương ứng 26mm, 14mm, 6mm ;kháng Stapphylococcus aureus ATCC25923 tương ứng 25mm, 13mm, 6mm;kháng Bacillus cereus ATCC13245 với đường kính 12mm - Cả chủng có khả sinh enzyme amylase, protease cellulase với độ mạnh yếu khác nhau: Chủng M06 có khả sinh enzyme cao với đường kính vịng phân giải với enzyme tương ứng 16mm, 13mm, 9mm; Chủng M07 có khả sinh enzyme với vòng phân giải tương ứng 12mm, 11mm, 10mm; Chủng M16 có khả sinh enzyme với vịng phân giải tương ứng 7mm, 13mm, 11mm - Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 18S rADN chủng phân lập Chúng tơi kết luận chủng M06 thuộc chi Penicillium,M07 M16 thuộc chi Aspergillus 5.2 Kiến nghị - Cần có chủng nghiên cứu thêm đặc điểm lý sinh hóa sinh để khẳng định đến loài chủng M06, M07 M16 - Tối ưu hóa điều kiện q trình lên men, tách chiết chất từ dịch lên men nghiên cứu cấu trúc hoạt chất chủng M06, M07 M16 Đỗ Thị Huệ 39 Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch Phạm Văn Ty (1977), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, NXB Khoa học Kỹ thuật [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi Sinh Vật Học, Nhà xuất giáo dục, 2007 [3] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật [4] Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội [5] Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghê lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 17, 2004 [6] Nguyễn Thị Thúy Bạch (2003), Nghiên cứu Streptomyces Rừng ngập mặn Thái Thụy-Thái Bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội [7] Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Nhà xuất Nông nghiệ-TPHCM) [8] Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định Thái Thụy,Thái BÌnh, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội [9] Mai Thị Hằng,Phan Nguyên Hồng (2002),Đánh giá vai trò vi sinh vật hệ sinh thái rừng ngập mặn,Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [10] Amira MGE, Ahmed AL, Tatsufumi O (2009) Modulation of carcinogen metabolizing enzymes by chromanone A; a new chromone derivative from Đỗ Thị Huệ 40 Viện Đại Học Mở Hà Nội algicolous marine fungus Penicillium sp Environ Toxicol Pharmacol 28:317322 [11] Jeffrey JC, Suman G, Ikechukwu O, Eleftherios M (2011) Antifungal [12] Hee C, Hyeon-Jin KK, Yeop J, Seong CH (2008) The isolation and characterisation of Pseudozyma sp JCC207 a novel producer of squalene Appl Microbiol Biotechnol 78:963-972 [13] Katia D, Teresa APRS, Ana CF, Armando CD (2012) Analytical techniques for discovery of bioactive compounds from marine fungi, Trends Analy Chem [14] Samuel P, Prince L, Prabakaran (2011) Antibacterial Activity of Marine derived Fungi Collected from South East Coast of Tamilnadu India PJ Microbiol Biotech Res [15] Swathi Jangala, Katta Meera Sowjanya, Kumara Narendra, Rathnakar Reddy KVN, Alapati Krishna Satya (2013) Isolation, identification and production of bioactive metabolites from marine fungi collected from coastal area of Andhra Pradesh India J Pharmacy Res [16] Lowell L.Black (1971) Vegetable Diseases A Practical Guide,Asian Vagetable Research and Development Center,Shanhua,Taiwan [17] Miriam H K, Stelamar R, Camila X,Marília C Milanetto M Z Valle, Eli F Pimenta, Raquel P M, Erica de C, Carolina M M, Fernando C C, Vinicius de M, Bruna V D, Javaroti C D., Mirna H R, Seleghim B C, Claudia P, Manoel O M, Bruna A L, Reginaldo G, Rafaella C Bonugli S, Lara D S, Roberto G S (2012) Evaluating methods for the isolation of marine-derived fungal strains and production of bioactive secondary metabolites Revista Brasileira da Farmacognosia Brazilian J Pharmacognosy p.222 [18] Sherif S Ebada and Peter Proksch (2012), The Chemistry of Marine Sponges Handbook of Marine Natural Products [19] Swathi J, Narendra K, K M Sowjanya and A Krishna Satya (2013), Marine fungal metabolites as a rich source of bioactive compounds Đỗ Thị Huệ 41 Viện Đại Học Mở Hà Nội [20] N.X.Nhiem, N.T.Cuc, D.T.T.Hang, D.T.Trang, N.H.Nam, P.H.Yen, D.C Thung, V.K.Thu, H.L.T.Anh, B.H.Tai, C.V.Minh, P.V.Kiem 1H and 13C NMR assignments of sesquiterpenes from Dysidea fragilis Mag Reson Chem,DOI 10.1002/mrc.4288 (2015) [21] N.T.Cuc, H.L.T.Anh, D.T.T.Hang, N.X.Nhiem, N.H.Dang, N.H.Nam, P.H Yen, D.C.Thung, V.K.Thu, C.V.Minh, P.V.Kiem Sesquiterpenes from the Vietnamese marine sponge Dysidea fragilis Nat Prod Commun, 1341-1342 (2015) [22] P.V.Kiem, N.T.V.Thanh, D.T.T.Hang, N.T.Cuc, N.X.Nhiem, P.H.Yen, H.L.T.Anh, B.H.Tai, D.T.Thao, C.V.Minh Cytotoxic constituents from Vietnamese marine sponge Haliclona oculata (Linnaeus, 1759) Lett Org Chem, 12 DOI: 10.2174/1570178612666150908230959 (2015) [23] B T Ngoan, T.T.Hanh, L.T.Vien, C.N.Diep, N.P.Thao, D.T.Thao, N.V.Thanh, N.X.Cuong, N.H.Nam, D.C.Thung, P.V.Kiem, Y.H.Kim, C.V.Minh.Asterosaponins and glycosylated polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae and their cytotoxic activities J Asian Nat Prod Res, DOI: 10.1080/10286020.10282015.11041930 (2015) [24] N.P.Thao, B.T.T.Luyen, E.J.Kim, J.I.Kang, H.K.Kang, N.X.Cuong, N.H.Nam, P.V.Kiem, C.V.Minh, Y.H.Kim Steroidal constituents from the edible sea urchin Diadema savignyi Michelin induce apoptosis in human cancer cells J Med Food, 18(1), 45-53 (2015) [25] N.P.Thao, B.T.T.Luyen, J.E.Koo, S.Kim, Y.S.Koh, N.X.Cuong, N.H.Nam, P.Van Kiem, Y.H.Kim, C.Van Minh Anti-inflammatory components of the Vietnamese starfish Protoreaster nodosus Biol Res, 48 12 (2015) [26] N.X.Cuong, L.T.Vien, T.T.H.Hanh, N.P.Thao, D.T.Thao, N.V.Thanh, N.H.Nam, D.C.Thung, P.V.Kiem, C.V.Minh Cytotoxic triterpene saponins from Cercodemas anceps Bioorg Med Chem Lett, 25(16), 3151-3156 (2015) [27] Raghukumar C (2008) Marine fungal biotechnology: an ecological perspective Fungal Divers Đỗ Thị Huệ 42 Viện Đại Học Mở Hà Nội [28] Atlas, R.M (2004) Handbook of Microbiological Media rd ed Boca Raton: CRC Press [29] Mathan S, Anton SA, Kumaran J, Prakash S (2011) Anticancer and Antimicrobial Activity of Aspergillus protuberus SP1 Isolated from Marine Sediments of South Indian Coast Chin J Nat Med 94:0286- 0292 [30] Mei-Yan W, Guang-Ying C, Yu W, Xiu-Li Z, Chang-Yun W, Chang-Lun S (2011) Isolation, 1H, 13C NMR Assignments, and crystal structure of Chrodrimanin B from a marine fungus Aspergillus sp Chem Nat Compound 47:4 [31] Swathi J, Narendra K, Sowjanya KM, Krishna Satya A (2013) Biological Characterisation of Secondary Metabolites from Marine Fungi Microascus sps Int J Res Pharm Biomed Sci 4(3):754-759 Các trang web tham khảo [32] http://www.doctorfungus.org/the fungi/Trichoderma spiecies.html [33] http://www.thuvienkhoahoc.com [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR [35] http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Đỗ Thị Huệ 43 ... tiến hành nghiên cứu đề tài:? ?Nghiên cứu sàng lọc chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh phân lập từ mẫu trầm tích thu thập vùng biển Thanh Hóa- Quảng Bình -Quảng Trị? ?? Nhằm tạo tiền đề cho nghiên Đỗ... 60b Quảng Trị Trầm tích 49d Quảng Bình Trầm tích 60f Quảng Trị Trầm tích 61a Thanh Hóa Hình 4.1 Một số hình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu 4.2 Phân lập nấm từ trầm tích biển Từ mẫu trầm tích thu thập, ... mẫu trầm tích thu thập vùng biển Thanh HóaQuảng Bình -Quảng Trị Bảng 4.2 Danh sách 13 chủng nấm phân lập Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định Bảng 4.4 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh