BỘ YTẼ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI TRẦN THỊ MINH ĐỨC NGHỈÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA MYCOCIN ■ TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM ■ (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997-2002) Người hướng dẫn: TS. Vũ Nguyên Thành GVC. Nguyễn Lệ Phi Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Viện Công nghiệp Thực phẩm Thời gian thực hiện: 04/03 - 25/05/2002 Hà Nội, - 2002 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành biết ơn Ban giám hiệu, thầy giáo cô giáo, cán trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy năm học tập nhà trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Vũ Nguyên Thành, GVC. Nguyễn Lệ Phi - thày cô trực tiếp hướng dẫn làm khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên môn Vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm môn Vi sinh - Sinh học Trưòíng Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Từ Minh Koóng lời khuyên quý báu cho khoá luận. Tôi xin cảm ơn CN. Đào Anh Hải, sv. Dương Anh Tuấn hỗ trợ giúp đỡ hoàn thành khoá luận này. Tôi xin cảm ơn tất người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu. Hà Nội, tháng năm 2002 Sinh viên Trần Thị Minh Đức MỤC LỤC Đặt Vấn Đ ề . Phần 1- Tổng quan . . 1.1. Đại cương nấm m en . 1.2. Mycocin 1.2.1. Vài nét khái quát 1.2.2. Cấu tạo mycocin . 1.2.3 Cơ chế tác động mycocin lên tế bào chủng mẫn cảm . 1.2.4. Ý nghĩa việc nghiên cứu Mycocin . 1.3. Vài nét chủng sinh mycocin nghiên cứu . Phần 2- Thực nghiệm kết . 2.1. Nguyên vật liệu phương pháp thực nghiệm . 2.Ỉ.L Nguyên vật liệu 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu .9 2.2. Kết thực nghiệm nhận xét . 13 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào chủng sinh mycocin 13 2.2.2. Kết nghiên cứu đặc tính sinh hoá SS4.2 .13 2.2.3. Phổ chống nấm mycocin . 2.2.4. Kết thử độc tính cấp mycocin nghiên cứu 21 2.2.5. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính mycocin . 21 2.2.6. Kết nghiên cứu đặc tính hoá học mycocin 25 Phần - Kết luận đê xuất . 28 3.1. Kết luận 28 3.2. Đề xuất 28 Tài liệu tham khảo .29 ĐẶT VÂN ĐỂ Mycocin chất vi nấm tiết nhằm ức chế tiêu diệt chủng khác loài chủng có họ hàng gần. Nhiều nghiên cứu mycocin thời gian gần tập trung theo hướng ứng dụng mycocin thuốc chống nấm đặc hiệu làm chất bảo quản thực phẩm chống lại xâm nhập phá huỷ nấm men. Cho tới 80 loài nấm men có khả sinh mycocin biết tới. Trong số có vài mycocin thực có tiềm ứng dụng. Một hướng phát triển nhận nhiều quan tâm nhà khoa học tìm kiếm xác định đặc tính loài có khả sinh mycocin mới. Đa dạng sinh học tiềm ẩn giới nấm men thách thức đầy hứa hẹn. Tại Việt Nam, Viện Công nghiệp Thực phẩm - Bộ Công nghiệp nỗ lực tìm kiếm mycocin có khả ứng dụng phát số chủng nấm men có khả sinh mycocin. Đặc tính mycocin chủng tiết chưa nghiên cứu cách đầy đủ chi tiết. Vì vậy, tiến hành đề tài '"Nghiên cứu đặc tính mycocin từ số chủng vi nám'' với mục tiêu sau: 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng vi nấm sinh mycocin SS4.2, IFO-0895, N14.1. 2. Tách chiết mycocin, xác định đặc điểm hoá học, kích thước phân tử. 3. Khảo sát số đặc tính sinh học mycocin (phổ tác dụng, ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hoạt tính mycocin). 4. Thử độc tính cấp mycocin. PHẦN 1- TỔNG QUAN 1.1. Đại cương nấm men Nấm men gồm loại nấm đoỉn bào thuộc giới Eucaryotes. Tuỳ loại nấm men mà chúng có hình thái kích thước khác nhau. Chúng có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình chanh, hình ống . Kích thước tế bào thay đổi tuỳ loài, tuỳ giống, tuỳ điều kiện sinh trưởng thay đổi khoảng - X - 30 I^m hay có dài thường kích thước tế bào loại nấm men vào khoảng - ịim. Nấm men phân bố rộng rãi tự nhiên (trên hoa, quả, thực phẩm, lương thực, đất v.v .). Nấm men sinh sản cách nảy chồi hay phân đôi. Khi tế bào nấm men bắt đầu trưởng thành nảy chồi nhỏ. Chồi lớn dần lên, phần nhân tế bào mẹ chuyển sang chồi, sau tách hẳn thành nhân mới. Đến lúc đó, tế bào sinh hình thành nên vách ngăn ngăn cách với tế bào mẹ đính tế bào mẹ tiếp tục nảy chồi mới. vài loài nấm men, thay cho hình thức sinh sản nảy chồi hình thức phân cắt tế bào mẹ thành hai tế bào giống hệt Schizosacharomyces. Nấm men nhóm vi sinh vật quan trọng ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong nông nghiệp thực phẩm, Saccharomyces cerevisiae sử dụng để sản xuất rượu vang, sản xuất bia, Kluyveromyces marxianus sản xuất sữa chua . Trong y học, Saccharomyces cerevisỉae ứng dụng điều trị số bệnh đưòfng tiêu hoá phối hợp với kháng sinh mà không bị tác dụng [4]. Bên cạnh đó, nấm men gây bệnh cho người làm hỏng thực phẩm. Ngày nay, vi nấm có nhiều hội gây bệnh hofn trước cấy ghép mô phổ biến, bệnh ung thư, bệnh suy giảm miễn dịch, đặc biệt lan tràn rộng khắp đại dịch AIDS. Đây yếu tố thuận lợi làm tăng khả xâm nhập vào thể gây bệnh vi nấm. Điển hình số nấm men gây bệnh Candida albicans (và số loài Candida khác) gây tưa miệng viêm âm đạo, Cryptococcus neoformans gây viêm não - màng não, Malasseizia furfur gây bệnh lang ben [5]. Điều trị bệnh vi nấm gặp tương đối nhiều khó khăn tính không ổn định với kháng sinh hay tái phát. Hiện có nhiều loại thuốc chống nấm, nhiên việc tìm thuốc kháng nấm tiếp tục [9]. Trên thực phẩm, Zygosaccharomyces bailii phát triển nồng độ đường cao, làm hư hỏng mật xirô, làm lên men số rượu vang nước đậu tương. Geotrichum candidum làm tăng pH sản phẩm đồ uống, tạo điều kiện cho vi khuẩn tạp nhiễm phát triển mọc tốt sản phẩm thức ăn mỡ, có khả phân huỷ lipid mạnh. Debaryomyces sp. Pichia sp. tạo màng bề mặt sản phẩm dưa chuột ướp chua [3]. Để bảo quản thực phẩm chống xâm nhiễm vi nấm vi khuẩn, có phương pháp bảo quản như: bảo quản nhiệt độ thấp, ướp đường ướp muối, bảo quản cách thay đổi thành phần không khí quanh sản phẩm . bảo quản hoá chất. Các hoá chất dùng để bảo quản thực phẩm bao gồm: chất chống oxy hoá (acid acetic, acid citric, acid ascorbic, acid sorbic, acid benzoic muối benzoat natri), chất sát khuẩn (anhydric sulíurơ SO2, natri sunfit NajSOj, natri nitrat NaNOg) chất kháng sinh. Các chất kháng sinh dùng nhiều biomixin, teramixin có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản. Việc dùng chất kháng sinh vào thực phẩm tới phổ biến rộng rãi, lẽ tạo dòng vi khuẩn nhờn với thuốc làm giảm tác dụng thuốc, dẫn tới điều trị số bệnh nhiễm khuẩn kháng sinh hiệu [3]. Ngày nay, người ta thường sử dụng chất kháng sinh không dùng cho y học vi khuẩn sinh ra, đặc biệt vi khuẩn lactic (gọi chung bacteriocin). Hai chế phẩm biết đến diplocoxin nizin. Nizin dùng chế biến phomát để diệt vi khuẩn kỵ khí Clostridium, nước ép đóng hộp, đồ hộp, rau tươi . Mycocin (zymocin, killer toxin) nhà khoa học tích cực nghiên cứu để trở thành kháng sinh bảo quản thực phẩm xa trở thành thuốc điều trị nấm gây bệnh [7, 6, 14, 10, 15]. 1.2. Mycocin 1.2.1. Vài nét khái quát Gần 40 năm trước, Makower Bevan (Mỹ) phát số chủng Saccharomyces cerevisiae có khả sinh tổng hợp protein (killer toxin) diệt chủng khác loài. Những chủng kháng killer toxin thân chúng sinh ra. Một số chủng khác không sinh killer toxin không mẫn cảm với killer toxin. Những nghiên cứu phát chủng killer s. cerevisiae sinh killer toxin dsARN mạch thẳng. Một dsARN khác mã hoá protein vỏ bao bọc hai dsARN thể hạt virus (VLP). Những thể hạt virus không lây nhiễm mà lan truyền thông qua trình phân chia tế bào tiếp hợp hữu tính [14]. Hiện tượng killer trở thành đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu tương tác tế bào nhân thật (Eucaryotes) với virus khảo sát trình tiết protein. Để hiểu tượng killer cần nhấn mạnh tượng không đặc thù cho nấm men. Quá trình tổng hợp protein mang đặc tính đặc hiệu cá thể thuộc họ hàng gần khả đề kháng tương ứng biết nấm than (smut fungi), trùng đế giày (paramecium), nấm nhày (slime mold) vi khuẩn. Các protein có tính chất kháng sinh vi khuẩn gọi bacteriocin để nhấn mạnh chất chung tương tác đối kháng kiểu này, tốt hết gọi killer toxin nấm men mycocin. Các kiểu killer dựa dsARN Saccharomyces cerevisiae gặp thấy Hanseniaspora uvarum, Sporỉdiobolus johnsonii (S. salmonicolor) Cystofilobasidium bisporidii. Mycocin sinh Kluyveromyces lactis, Pichỉa acaciae p. inositovora gắn liền với plasmid dsADN mạch thẳng. Đặc tính killer Candida glabrata số chủng s. cerevisiae mã hoá gen chromosom. Trong nhiều trường hợp đặc tính killer chưa đánh giá cụ thể mặt di truyền tạm cho có nguồn gốc chromosom [7, 14, 12], Bảng 1. Những loài nấm men mà hoạt tính mycocin công bố. Giống Loài Candida C. dattila, C. glabrata, C. guilliermondii, C. holmii, C. krusei, C. maltosa, C. neodendra, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C. sonorensis, C. sphaerica, C. valida, C. versatilis. Cryptococcus Cr. albidus, Cr. laurentii, Cr. podzolicus Cystofîlobasidium Cys. bisporidii Debaryomyces D. hansenii, D. polymorphus, D. vanrijiae Filobasidium F. capsuligenum Hanseniaspora H. uvarum Kloeckera K. apiculata, K. japónica Kluyveromyces Kl. aestuarii, Kl. dobzhanskii. Kl. lactis. Kl. lodderae. Kl. marxianus. Kl. phaffii. Kl. wickerhamii, Kl. wikenii Metschnikowia M. pulcherrima Pichia P. acaciae, P. amethionina, P. anómala, P. antillensis, P. bimundalis, P. cactophila, P. canadensis, P. ciferrii, P.fabianii, P. farinosa, P. guilliermondii, P. holstii, P. inositovora, P. jadinii, P. kluyverii, P. membranifaciens, P. mexicana, P. minuta var. nonfermentans, P. ohmeri, P. opuntiae, P. petersonii, P. pini, P. quercuum, P. spartinae, P. subpelliculosa, P. thermotolerans Rhodotorula R. fujisanensis, R. glutinis, R. mucilaginosa, R. pallida Saccharomyces S. cerevisiae, S. paradoxus, S. unisporus Sporỉdiobolus Sp. johnsonii, Sp. pararoseus Trichosporon T. capitatum Williopsis W. californica, W. pratensis, W. saturnus, W. saturnus (W. beijerinckii), W. saturnus var. mrakii, W. saturnus var. sargentensis, W. saturnus var. subsujficiens 1.2.2. Cấu tạo mycocỉn Tất mycocin biết đến có chất protein. Chúng protein glycoprotein chứa từ hai tới ba cấu tử (Subunit). Đối với hầu hết nấm men, trọng lượng phân tử mycocin có kích thước khoảng từ 10 đến 20 KDa (kilo dalton). Trọng lượng phân tử mycocin Kluyveromyces lactis Pichia anómala lại lớn nhiều (100 KDa nữa). Mycocin KI (20548 Da) s. cerevisiae tiết cấu tạo từ a (3polypeptid liên kết cầu sulfit đôi có chứa nhiều acid amin kỵ nước acid amin mang điện tích. Tiền chất KI tổng hợp tế bào phân tử polypeptid mạch đơn kích thước lớn với hai cấu tử a p tách riêng vùng Y có độ glycoside hoá cao [14]. 1.2.3 Cơ chế tác động mycocỉn lên tế bào chủng mẫn cảm Mycocin gây giảm pH nội bào thất thoát K^, ATP số chất trung gian nội bào. Chúng ức chế vận chuyển acid amin ngoại bào. Các trình thể gia tăng độ dẫn proton qua màng tế bào mẫn cảm. Như vậy, mycocin tương tác với màng tế bào chủng mẫn cảm, tạo nên kênh cho ion lọt qua. Những lỗ thủng phá huỷ hiệu điện hoá màng dẫn tới tiêu diệt tế bào. Một số trường hợp đặc biệt mycocin Kluyveromyces lactis ngăn chặn chu trình phân chia tế bào pha Gl. Mycocin Williopsis saturnus var. mrakii (IFO 0895) ức chế trình tổng hợp P-l,3-glucan, toxin KT 28 s. cerevisiae ức chế trình tổng hợp ADN [14], 1.2.4. Ý nghĩa việc nghiên cứu Mycocỉn Những nghiên cứu ban đầu tượng killer nấm men tập trung vào s. cerevisiae chủ yếu liên quan tới đặc tính di truyền, sinh hoá sinh học phân tử tượng. Đến nay, tượng killer biết tới khoảng 80 loài nấm men đại diện cho gần 20 họ thuộc Ascomycetes Basidỉomycetes. Ngoài ý nghĩa để tìm hiểu giới tự nhiên đa dạng, việc nghiên cứu mycocin mang nhiều ý nghĩa thực tiễn. Các mycocin không thích hợp để dùng làm kháng sinh chống nấm y học (dùng đường uống tiêm) chúng có chất protein thường bền với nhiệt độ pH. Chúng dùng cho nhiễm trùng nấm da, miệng âm đạo. Một số nấm men sinh độc tố bền số độc tố có tác dụng chống nấm men gây bệnh. Do vậy, tương lai, hy vọng mycocin có ứng dụng y học. Các mycocin dùng điều trị bệnh nhân AIDS bị nhiễm trùng nấm hội [14]. Mycocin hứa hẹn nhiều triển vọng kháng sinh an toàn việc bảo quản thực phẩm chống phá huỷ nấm men, đặc biệt loại nước hoa quả. Những sản phẩm thường có hàm lượng đường cao, pH thấp, điều kiện thuận lợi cho sinh trưcmg phát triển nấm men. Sự xâm nhập không kiểm soát nấm men từ môi trường làm hỏng hương vị chất lượng nước hoa quả. Trong số điều kiện, trình lên men không lưòỉng trước làm nổ bao gói, bình chứa gây thất thoát ảnh hưởng tới an toàn sản xuất. Người ta thành công việc chuyển gen mang đặc tính killer vào chủng công nghiệp phục vụ lên men. Điều không làm thay đổi hương vị sản phẩm, độc tố chúng sinh tác dụng đặc hiệu lên chủng mẫn cảm mà không gây độc cho người [1]. 1.3. Vài nét chủng sinh mycocin nghiên cứu Trong số chủng có khả sinh mycocin phát lưu giữ Sưu tập giống Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm, chọn chủng nấm có khả sinh mycocin mạnh để nghiên cứu. Đó chủng: Nấm men Williopsis sartunus yãĩ.mrakii IFO-0895. Mycocin IF0-0895 sinh có phổ tác dụng rộng. Bản chất polypeptid gồm 88 acid amin, Kích thước phân tử khoảng 10,7 kDa. Đặc biệt, có độ ổn định cao, giữ hoạt tính khoảng pH rộng (pH từ 2-11) 100 10 phút [10]. Cơ chế tác dụng lên chủng mẫn cảm ức chế tổng hợp l,3-í3-glucan thành tế bào. Những ưu điểm khiến mycocin IPO-0895 trở thành chất lý tưởng bảo quản thực phẩm [10, 13]. Chủng IPO-0895 đề cập nhiều nghiên cứu ứng dụng mycocin. SS4.2 (nấm men) N I4.1 (nấm mốc) hai chủng nấm sinh mycocin phân lập Việt Nam. SS4.2 phân lập từ tương N14.1 từ cây. Hai chủng đại diện cho hai loài chưa biết tới. Sau giải trình tự gen 26S rRNA miền D1/D2, gen SS4.2 khác biệt 100 nucleotid tổng số 535 nucleotid đọc so với loài biết gần nhất. Chủng N14.1 tương tự vậy, có 19 nucleotid khác biệt tổng số 538 nucleotid so với loài gần Microstroma juglandis. Theo lý thuyết, cần khác biệt từ 5-7 nucleotid miền D1/D2 coi khác loài. Chính vậy, SS4.2 N14.1 coi loài mới'*\ - Kết chưa công bố Viện Công nghiệp Thực phẩm. a o I i ( ( / ) Hình 2. Hình thái tế bào chủng SS4.2 nuôi cấy môi trường agar chứa Malt-Glucose 2'’ Bx. (a, b): SS4.2 độ phóng đại 1000 lần. ịc, d): SS4.2 độ phóng đại 400 lần. Kí hiệu Nguồn Cac bon Kết Kí hiệu Nguồn Cac bon Kết C1 D-Glucose + C22 Starch - C2 D-Galactose - C23 Glycerol + C3 L-Sorbose - C24 Erythritol + C4 D-Glucosamine - C25 Ribitol - C5 D-Ribose + C26 Xylitol - C6 D-Xylose - C28 D- Glucitol - C7 L-Arabinose - C29 D- Mannitol + C8 D-Arabinose - C30 Galactitol - C9 L-Rhamnose - C31 myo- Inositol - CIO Sucrose + C32 D- Glucono-l,5-lactone - CU Maltose + C33 2-Keto-D-gluconate - C12 a- Trehalose - C34 5-Keto- D-gluconate - C13 Methyl a-D glucopyranoside - C35 D-gluconate - C14 Cellobiose + C37 D-Galacturonate - C15 Salicin - C38 DL- Lactate - C16 Arbutin + C40 Citrate - C17 Melibiose - C41 Methanol - C18 Lactose - C42 Ethanol H- C19 Raffinose - C43 Propane 1,2 diol - C20 Melezitose - C44 Butane 2,3 diol - C21 Inulin - Bảng 3. Khả mọc môi trường chứa số chất độc hại SS4.2 Kí hiệu Khả mọc môi trường chứa Kết 01 0,01%(w/v) cycloheximid D 03 1% Acetic acid - Ghi chú: - có mọc; - không mọc; "D" (Delay) - mọc chậm 2.2.3. Phổ chống nấm mycocin Kết thử nghiệm khả mycocin ức chế chủng thử trình bày bảng 4. Trong tổng số 44 chủng nấm men đem thử, IPO-0895 chống lại 20 chủng, SS4.2 chống lại chủng N14.1 chống lại chủng. Trong chủng mẫn cảm, có chủng sinh mycocin Saccharomyces cerevisiae K7, có Debaryomyces - giống nấm men hình thành màng sản phẩm dưa chuột ướp chua. Cả ba mycocin không tác dụng chủng Candỉda thử (trong có Candỉda albicans), trừ mycocin IFO0895, SS4.2 tác dụng yếu lên Candida quercuum. Nhìn chung, IPO-0895 chủng sinh mycocin có phổ chống nấm mạnh số chủng nghiên cứu. Hình 3. Khả ức chế mycocin lên chủng mẫn cảm UWO 99.664.3 Việc thử nghiệm số chủng vi khuẩn nấm mốc E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Fusarium oxysporum thực hiện, kết cho thấy âm tính. Các mycocin không gây tác dụng lên chủng khuẩn nấm mốc đem thử. Điều phù họfp với chất mycocin - tác dụng lên chủng có họ hàng gần. Qua tìm hiểu tác dụng mycocin này, nhận thấy mycocin có tác dụng ức chế không làm chết tế bào chủng mẫn cảm. Cụ thể đưa tế bào chủng mẫn cảm (SBY-2576) vào dịch chứa mycocin ủ sau rửa tế bào nuôi cấy môi truờng dinh dưỡng kết cho thấy thay đổi đáng kể tron^khljiäng phát triển tế bào. Riêng với trường hợp mycocin Nlj ệ nhẹ (2 lần) số tế bào sống sót. Tuy nhiên so với chất làm chết tế bào thuyên giảm không đáng kể. Bảng 4. Khả mycocin ức chế chủng mẫn cảm. Chủng thử s n ĐK ức chế chủng thử (mm) SS4.2 Issatchenkia orientalis 505/3 Myxozyma sp. nov. gần M. melibiosí UWO 91-124.5 Myxozyma sp. nov. gần M. geophila UWO 99-664.3 IFO -0895 N14.1 18 16 21.5 15 Myxozyma melibiosi NRRL Y 1781 18,75 15 Myxozyma melibiosi PEU 21,75 Myxozyma sp. (gần M. melibiosi) PSA 491 22 Myxozyma sp. (gần M. melibiosi) PVN 746 20 Candida quercuum CBS 6422 Candida tenuis CBS 7047 10 Candida vartiovaarai G164 11 Candida saitoana G237 12 Candida albicans 13 Candida utilis JCM 9624 14 Candida glabrata G390 15 10 12,4 Saccharomyces cerevisiae K7 21,5 21,25 16 Saccharomyces cerevisiae CLIB 227 13,5 13.5 17 Saccharomyces cerevisiae VKM Y -1695 18 Saccharomyces carlsbergensis GLIB 176 19 Saccharomyces bayanus CLIB 181 . . . 20 Saccharomyces paradoxus CL IB 228 . 11,5 . 21 Saccharomycopsis fibuligera JCM 7609 _ 23,5 _ Chủng thử S TT ĐK ức chế chủng thử (mm) SS4.2 22 Saccharomycopsis fibuligera KHE 23 Saccharomyces uvarum CLIB 251 24 Schizoblastosporion starkeyi-henricii DSM 70569 25 Zygowilliopsis californicus G207 26 Debaryomyces hansenii G210 27 Debaryomyces hansenii G225 28 Debaryomyces hansenii G377 29 Debaryomyces maramus CBS 1958 30 Pacchytiospora transvaalensis G286 31 Torulaspora delbrueckii G316 32 Torulaspora delbrueckii G 361.7 33 Citeromyces matritensis G376 34 Pichia onychis G387 35 Pichia anómala G229 36 Pichia anómala (HAN ANOM) 37 Geotríchum canơidum G400 38 Yarrowia lipolytica JCM 2320 39 Lipomyces lipoferJCM 3769 40 Lipomyces tetrasporus JCM 6000 41 Arthroascus schoenii KBP 3099 42 Yarrowia lipolitica KBP 3364 43 Metschnikowia pulcherrima MPUE NEW 44 Hanseniaspora uvarum MW 28 IFO-0895 N14.1 10 10 16 13 27,5 14 25,5 11 12 19,75 17,25 22 17 21,5 15 . . . . . _ Sau cô đặc mycocin, thu dịch đậm đặc mycocin nồng độ xác định. Dịch đậm đặc mycocin SS4.2 đạt 75 lần. Dịch đậm đặc mycocin IFO 0895 đạt 75 lần. Dịch đậm đặc mycocin N14.1 đạt 100 lần. Chúng tiến hành pha loãng dịch đậm đặc nồng độ dịch mycocin ban đầu, với mục đích tìm hiểu mycocin sau đông khô thẩm tách có bị giảm hoạt tính hay không (sử dụng phương pháp đục lỗ thạch, chủng mẫn cảm SBY 2576). Kết cho thấy thật khả quan, mycocin SS4.2, IFO 0895 N14.1 không bị giảm hoạt tính. X 10 x5 x3 xl SS4.2thô(xl) Hình 4. Đường kính vòng ức chế chủng mẫn cảm CBS-6422 (Candida quercuum) mycocin SS4.2 nồng độ pha loãng khác nhau. Ghi chú: X 10: nồng độ mycocin gấp 10 lần nồng độ ban đầu. X 5; nồng độ mycocin gấp lần nồng độ ban đầu. X 3: nồng độ mycocin gấp lần nồng độ ban đầu. X 1: nồng độ mycocin n n g độ ban đầu. 2.1.4. Kết thử độc tính cấp mycocin nghiên cứu Sau chuột uống thuốc, theo dõi chuột suốt 72 giờ. Kết cho thấy chuột chết. Tất chuột ăn uống, hoạt động bình thường. Như vậy, liều thử cao gấp hàng chục lần liều có tác dụng chống nấm (liều ban đầu), mycocin không gây độc tính cấp (Bảng '5). Bảng 5. Kết thử độc tính cấp chuột. Mycocin Lô thí nghiệm Sô chuột đem thử SS4.2 IFO 0895 N14.1 Liều /lần Sô chuột chết 0,5 ml dịch đặc 75 lần 0,5 ml dịch đặc 65 lần 0,5 ml dịch đặc 75 lần 0,5 ml dịch đặc 65 lần 0,5 ml dịch đặc lOOlần 0,5 ml dịch đặc 90 lần 2.2.5. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính mycocỉn Để khảo sát mối liên quan thời gian nuôi cấy hoạt tính mycocin canh trường, chủng sinh mycocin nuôi cấy môi trường tối thích (Malt-Glucose 3°Bx với N14.1 YEPD với SS4.2 IFO-0895). Canh trường lấy hàng ngày kiểm tra đồng loạt sau kết thúc nuôi cấy (sau ngày). Kết thí nghiệm trình bày bảng 6. Bảng 6. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới sinh trưởng tế bào hoạt tính mycocin canh trường chủng khảo cứu. SS4.2 IFO 0895 N14.1 Ngày OD BK OD BK OD BK 11.4 0.0 0.9 0.0 1.7 0.0 21.1 1.0 10.8 5.5 12.0 5.5 22.4 1.0 11.9 6.0 17.9 6.0 4.4 1.0 15.7 8.0 21.6 8.0 22.8 ' 1.0 17.2 8.0 23.8 7.0 20.2 1.0 14.5 7.0 23.6 6.5 17.2 1.5 14.1 7.0 24.3 6.0 Ghi chú: OD - Mật độ tế bào biểu diễn thông qua mật độ quang (độ đục) thời điểm khác nhau; BK - bán kính ức chế (bán kính đường vành khuyên) canh trường lên chủng mẫn cảm. Việc đánh giá kết đạt dựa vào số liệu đo đạc thực tế trình bày bảng nhiên có nhiều điểm không phản ánh trực quan thực chất tượng. Một điểm yếu phương pháp đánh giá hoạt lực mycocin dựa bán kính ức chế liên quan đến chất tượng khuếch tán. Về mặt lý thuyết, bán kính khuếch tán tỉ lệ logarit với nồng độ chất tan tâm khuếch tán. Giá trị độ đục mặt khác lại tỉ lệ tuyến tính với mật độ tế bào. Do việc kết hợp hai giá trị đo đạc (OD bán kính) gây nhiều khó khăn đánh giá. Chúng đề xuất việc dùng giá trị ảo, tỉ lệ tuyến tính với nồng độ thực mycocin. Theo kết tính toán rút từ thí nghiệm khác, giá trị tỉ lệ thuận với luỹ thừa bậc hai bán kính ức chế. Vì vậy, đồ thị hình 5, sử dụng giá trị OD để so sánh với giá trị luỹ thừa bậc hai bán kính ức chế. (ngày) Thời gian . o OD Hình 5. Đồ thị biểu mối tương quan sinh trưởng hoạt tính mycocin canh trường N 14.1 Q o Thời gian(ngày) o OD -a Hình 6. Đồ thị biểu mối tương quan sinh trưởng hoạt tính mycocin canh trường SS4.2 ^3 < o < 1> [...]... 3 chủng sinh mycocin IFO-0895, SS4.2, N14.1 (đặc điểm hình thái tế bào, khả năng đồng hoá các nguồn carbon, thời điểm thích hợp tạo mycocin) • Làm sạch sơ bộ các mycocin và thu được nồng độ đậm đặc của chúng có hoạt tính tăng từ 75-100 lần • Khảo sát phổ tác dụng của các mycocin trên 44 chủng nấm men, 1 chủng nấm mốc và 3 chủng vi khuẩn Mycocin của IFO-0895 tác dụng trên 20 chủng mẫn cảm Mycocin của. .. 2.1.1 Nguyên vật liệu a Chủng giống Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là 3 chủng vi nấm: nấm men IFO0895 (Williopsis sartunus ysiĩ.mrakiỉ), nấm men SS4.2 và nấm mốc N14.1 Các chủng này được lấy từ Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp, Vi n Công nghiệp Thực phẩm Để phục vụ nghiên cứu tương tác đối kháng, chúng tôi sử dụng 44 chủng nấm men từ Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp, Vi n Công nghiệp Thực... cả trong số 3 chủng nghiên cứu Hình 3 Khả năng ức chế của các mycocin lên chủng mẫn cảm UWO 99.664.3 Vi c thử nghiệm trên một số chủng vi khuẩn và nấm mốc như E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Fusarium oxysporum cũng đã được thực hiện, nhưng kết quả cho thấy âm tính Các mycocin không gây tác dụng lên các chủng khuẩn và nấm mốc đem thử Điều này cũng phù họfp với bản chất của mycocin -... 15 _ Sau khi cô đặc các mycocin, chúng tôi thu được các dịch đậm đặc mycocin ở nồng độ xác định Dịch đậm đặc mycocin SS4.2 đạt 75 lần Dịch đậm đặc mycocin IFO 0895 đạt 75 lần Dịch đậm đặc mycocin N14.1 đạt 100 lần Chúng tôi đã tiến hành pha loãng các dịch đậm đặc này về nồng độ của dịch mycocin ban đầu, với mục đích tìm hiểu mycocin sau đông khô và thẩm tách có bị giảm hoạt tính hay không (sử dụng... 6 chủng Trong những chủng mẫn cảm, có cả những chủng sinh mycocin như Saccharomyces cerevisiae K7, có cả các Debaryomyces - giống nấm men hình thành màng trên sản phẩm dưa chuột ướp chua Cả ba mycocin đều không tác dụng trên các chủng Candỉda thử (trong đó có Candỉda albicans), trừ mycocin của IFO0895, SS4.2 tác dụng yếu lên Candida quercuum Nhìn chung, IPO-0895 là chủng sinh mycocin có phổ chống nấm. .. chứa một số chất độc hại của SS4.2 Kí hiệu Khả năng mọc trên môi trường chứa Kết quả 01 0,01%(w/v) cycloheximid D 03 1% Acetic acid - Ghi chú: - có mọc; - không mọc; "D" (Delay) - mọc chậm 2.2.3 Phổ chống nấm của các mycocin Kết quả thử nghiệm về khả năng mycocin ức chế các chủng thử được trình bày trong bảng 4 Trong tổng số 44 chủng nấm men đem thử, IPO-0895 chống lại 20 chủng, SS4.2 chống lại 7 chủng. .. 7 chủng mẫn cảm Mycocin của N14.1 có tác dụng trên 6 chủng mẫn cảm Chúng ức chế sự phát triển của chủng mẫn cảm chứ không tiêu diệt Cả ba loại mycocin đều không có tác dụng trên vi khuẩn thử • Các mycocin IFO-0895, SS4.2, NI4.1 không gây độc tính cấp trên chuột nhắt trắng ở các nồng độ gấp 75-100 lần so với nồng độ ban đầu • Mycocin SS4.2 có kích thước phân tử của khoảng 11 KDa 3.2 Đề xuất Đề tài của. .. quan giữa sinh trưởng và hoạt tính mycocin trong canh trường của IFO-0895 Hoạt tính mycocin trong canh trường của SS4.2 cao nhất ở ngày nuôi cấy thứ 4 Tương tự như vậy, N I4.1 cũng thể hiện hoạt tính mycocin cao nhất vào ngày thứ 4 Trong thí nghiệm với IPO-0895, hoạt tính mycocin đạt mức tối đa tại thời điểm cuối cùng (sau 7 ngày) Tuy nhiên cũng trong thí nghiệm này hoạt tính của IPO-0895 yếu bất thường... nghiệp Thực phẩm Ngoài ra còn có 3 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm mốc từ Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội được dùng cho khảo cứu Danh sách các chủng cũng như tên loài được liệt kê cùng kết quả b Các môi trường - Môi trường YEPD Cao nấm men 1% (Difco), Pepton 2% (Difco), D-glucose 2% (Trung Quốc), Nước cất 1000 ml Hấp ở 121°c/ 30 phút - Môi trường thử hoạt tính của mycocin Môi trường Malt-Glucose... phosphate-citrate Sau đó mycocin N I4.1 được tách chiết bằng ethylacetat Ethylacetat được loại bỏ bằng phương pháp cô quay Cặn còn lại được hoà tan trong 10 ml nước, ta thu được dịch mycocin đậm đặc của N14.1 Các dịch đậm đặc này được dùng để thử độc tính cấp trên chuột Với những phương thức trên, dịch mycocin có độ đậm đặc từ 75-100 lần so với ban đầu được thu nhận c Tìm hiểu đặc điểm của các mycocin - Khảo . đề tài '" ;Nghiên cứu đặc tính của mycocin từ một số chủng vi nám'' với các mục tiêu sau: 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi nấm sinh mycocin SS4.2, IFO-0895,. sinh mycocin có phổ chống nấm mạnh hơn cả trong số 3 chủng nghiên cứu. Hình 3. Khả năng ức chế của các mycocin lên chủng mẫn cảm UWO 99.664.3 Vi c thử nghiệm trên một số chủng vi khuẩn và nấm. tế bào các chủng sinh mycocin 13 2.2.2. Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh hoá của SS4.2 13 2.2.3. Phổ chống nấm của các mycocin 2.2.4. Kết quả thử độc tính cấp các mycocin nghiên cứu 21 2.2.5.