Nghiên cứu thu nhận chất có khả năng kháng oxy hóa từ cây tía tô (perilla frutescens)

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Rau quả không chỉ là nguồn thực phẩm bổ dưỡng, giàu chất xơ, mà còn cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất thiết yếu cho sức khỏe Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong các bài thuốc dân gian, như rau Hẹ giúp sát trùng và giải độc, rau Cần hỗ trợ giảm huyết áp, Bí Đao có tác dụng thanh nhiệt và lợi tiểu, và Tía Tô được dùng để trị cảm mạo, ho hen, cũng như rối loạn tiêu hóa.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành phần có hoạt tính sinh học trong rau quả có thể nâng cao giá trị dinh dưỡng, kéo dài thời gian bảo quản và hỗ trợ điều trị một số bệnh lý Đặc biệt, các chất kháng oxy hóa được chiết xuất từ rau quả không chỉ được sử dụng trong bảo quản thực phẩm giàu lipid mà còn giúp giảm nguy cơ ung thư, bệnh tim mạch và lão hóa nhờ khả năng trung hòa gốc tự do.

Hiện nay, khoa học đang tìm kiếm các chất kháng oxy hóa tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật để thay thế cho các chất tổng hợp, nhằm giảm thiểu tác dụng phụ cho người sử dụng Trong đó, nguồn từ thực vật được đặc biệt chú trọng.

Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Tía Tô chứa nhiều chất kháng oxy hóa Mục tiêu của đề tài là tìm ra phương pháp hiệu quả để trích ly các hợp chất này, tạo ra cao chiết có thể sử dụng trực tiếp hoặc làm nền tảng cho các nghiên cứu ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm Việc này không chỉ đa dạng hóa các sản phẩm từ Tía Tô mà còn nâng cao giá trị sức khỏe của nó đối với con người.

Cơ sở khoa học, tính thực tiễn và ý nghĩa của đề tài

Tía Tô là một loại rau quen thuộc trong ẩm thực Việt Nam, thường được sử dụng để ăn sống hoặc làm gia vị tăng hương vị cho các món ăn Ngoài ra, Tía Tô còn được biết đến như một bài thuốc dân gian hiệu quả trong việc chữa trị các bệnh như cảm cúm, sốt, ho, ngộ độc thực phẩm và mẩn ngứa.

Nghiên cứu của Mohammad Asif (2011-2012), Norihiro Banno và cộng sự (2004), cùng Noami Oskabe và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng Tía Tô chứa nhiều hợp chất kháng oxy hóa đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh do gốc tự do gây ra như lão hóa, ung thư và viêm da So với các hợp chất kháng oxy hóa tổng hợp, các hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thảo mộc mang lại lợi ích vượt trội do ít tác dụng phụ Do đó, việc tách chiết các hợp chất kháng oxy hóa tự nhiên từ thực vật đang trở thành xu hướng phát triển trong khoa học hiện đại.

Vì những lý do trên, nghiên cứu đã được thực hiện để trích ly các hợp chất kháng oxy hóa có giá trị, nhằm chứng minh đặc tính dược liệu và khả năng ứng dụng thực tiễn của sản phẩm.

Mục tiêu của đề tài

Nhằm tách chiết và xác định một số phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa trong Tía Tô

Nội dung đề tài

– Khảo sát một số thành phần của Tía Tô

– Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu

– Khảo sát điều kiện trích ly

 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi

 Khảo sát nhiệt độ trích ly

 Khảo sát thời gian trích ly

– Đánh giá hiệu quả trích ly của dung môi nước

 So sánh trích ly một lần và trích ly kiệt

 So sánh hiệu quả trích ly của dung môi nước với các dung môi khác

– Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết sau cùng

HVTH: Hà Thị Mỹ Chi GVHD: TS Ngô Đại Nghiệp

 Khảo sát năng lực khử

 Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH

– Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết

– Phân tách phân đoạn trong cao chiết.

TỔNG QUAN4 2.1 Tổng quan về nguyên liệu

Đặc điểm và nguồn gốc

Tên khoa học: Perilla frutescens

Bộ (odor) : Hoa môi (Lamiales)

Họ (family) : Bạc hà (Lamiaceae)

Loài (species): Perilla frutescens (L.) Britt

Tên tiếng anh: Perilla, Purple common perrilla

Tía Tô là loại cây thân thảo ưa sáng và ẩm, cao từ 0,5 đến 1,5 m, có mùi thơm đặc trưng Thân cây hình vuông với lông thẳng mọc đứng, trong khi lá mọc đối, phiến lá hình trái xoan nhọn có răng cưa ở mép, với mặt trên màu xanh lục hoặc phớt tím và mặt dưới màu tím hoặc xanh tía Hoa của cây có màu trắng hoặc tím nhạt, mọc thành chùm ở kẽ lá và đầu cành Quả tía tô là quả hạch nhỏ, hình cầu, đường kính khoảng 1mm, màu nâu nhạt, có nguồn gốc từ châu Á và phổ biến ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan.

Tía tô không chỉ có mùi thơm dễ chịu mà còn được sử dụng như một loại rau sống và gia vị trong nhiều món ăn Thân, lá và hạt của tía tô là thành phần quan trọng trong nhiều bài thuốc dân gian, giúp giảm đau, điều trị hen suyễn, hạ sốt, hỗ trợ chức năng dạ dày, sát trùng, trị ho, tiêu đờm, và làm mềm Đặc biệt, tía tô còn nổi bật với khả năng chống viêm, chống dị ứng và ngăn ngừa sự phát triển của khối u.

Dầu từ hạt Tía Tô không chỉ giúp điều trị chứng ốm nghén mà còn được ứng dụng rộng rãi trong sơn, vecni, lót vải sơn, mực in và lớp phủ chống thấm nước bảo vệ trên quần áo.

Phân loại

Dựa vào đặc điểm hình thái và cách sử dụng của chúng ta có thể phân tía tô thành 2 loại: [7]

Perilla frustesen var.frustesen dùng để lấy dầu

Perilla frustesen var.cripsa dùng làm rau ăn sống và dược liệu gồm 2 loại:

 Tía tô đỏ (P.frustesen (L.) Britton var Acuta Kudo): cho lá màu đỏ hoặc tím

 Tía tô đỏ - xanh (P.frustesen (L.) Britton var Acuta Kudo forma Viridus

Makino): cho lá màu xanh mặt trong và đỏ ở mặt ngoài

Dựa vào hình dạng bên ngoài của lá người ta phân Tía Tô thành 3 loại: [2, 15]

Tía Tô mép phẳng (Perilla frutescens var acuta) là một loại cây có thân nhiều lông và đài hoa nhỏ Lá của cây có màu tím nhạt, hình trứng dài từ 4,5 đến 7,5 cm và rộng từ 2,8 đến 5,5 cm Quả của cây có màu vàng sáng, đường kính từ 1 đến 1,5 mm Loài cây này thường mọc hoang dại bên đường, trên sườn đồi và trong rừng.

Tía Tô mép quăn, hay còn gọi là Perilla frutescens var auriculatodentata, nổi bật với lá màu tím sẫm, hình tròn hoặc hình tim, có các thùy ở mép lá tạo thành những nếp gấp giống như tai Loài cây này thường mọc trên sườn đồi, ven đường hoặc trong rừng.

 Tía Tô răng khía: P.frutescens var crispa (Thumb) có khía sâu, mép lá răng cưa, được trồng phổ biến như một loại dược liệu hoặc làm gia vị

Cần lưu ý phân biệt giữa cây Tía Tô và cây cọc giậu (giả tô, cây nhâm), vì mặc dù chúng có bề ngoài tương tự nhau, nhưng cây cọc giậu không có mùi thơm đặc trưng của Tía Tô.

Hình 2.1 Mẫu lá Tía Tô đỏ Hình 2.2 Mẫu lá Tía Tô đỏ - xanh

Hình 2.3 Mẫu lá Tía Tô xanh

Thành phần hóa học

The chemical composition of Vietnamese perilla (Tía Tô) is diverse, containing compounds such as apigenin, ascorbic acid, β-carotene, caffeic acid, citral, dillapiol, elemicin, limonene, luteolin, myristicin, perillaldehyde, protocatechuic acid, quercetin, rosmarinic acid, and various ketones Notably, Tía Tô includes rosefurane, a compound that can substitute rose oil in perfume production, primarily composed of perillaldehyde along with limonene, linalool, β-caryophyllene, l-menthol, α-pinene, perillene, and elemicin Perillaldehyde is significant in the flavor and fragrance industries and serves as an important source of simple phenylpropanoids in pharmaceuticals.

Tía tô chứa 0,3-0,5% tinh dầu, trong đó có 20% citral, với các thành phần chính bao gồm perillaldehyd, L-perrilla alcohol, limonen, α-pinen, hydrocumin, cùng với elsholtziaceton, β-cargophylen, bergamoten và linalool Nghiên cứu đã phát hiện các hợp chất polyphenol có khả năng kháng oxy hóa, đặc biệt là ở Tía Tô đỏ, với các hoạt động kháng oxy hóa được xác định và so sánh với thành phần polyphenolic của các mẫu khác nhau.

Bảng 2.1 Khả năng kháng oxy hóa (mol TE/100ml) và hàm lƣợng polyphenol

(mol/100ml) có trong dịch chiết Tía Tô [16]

Mẫu Màu lá AA Anthocyanins

Dẫn xuất cinnamic Dẫn xuất Flavon

8 Đỏ Đỏ Đỏ-xanh Đỏ -xanh xanh

Trong đó: AA: hoạt tính kháng oxy hóa, n.d: Không phát hiện

Dịch chiết lá Tía Tô được phân tích bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 325 nm, cho thấy sự hiện diện của 9 hợp chất, bao gồm 3 acid phenolic (acid tartaric, acid caffeic và acid rosmarinic) cùng với 6 flavone (apigenin 7-O-caffeoylglucoside, scutellarein 7-O-diglucuronide, luteolin 7-O-diglucuronide, apigenin 7-O-diglucuronide, luteolin 7-O-glucuronide và scutellarein 7-O-glucuronide).

Dẫn xuất của Cinnamic acid

Dẫn xuất của Benzoic acid

Hình 2.4.Cấu trúc hóa học của các hợp chất phenolic acid trong Tía Tô [18]

Hình 2.5 cấu trúc hóa học của Axit Rosmarinic [18]

Flavan – 3 – ols ( (+)-cathechin) Isoflavon(Genistein) Hình 2.6 Cấu Trúc hóa học của các flavonoid có trong Tía Tô [18]

Tổng quan về gốc tự do

2.2.1 Định nghĩa về gốc tự do

Gốc tự do là các nhóm nguyên tử hoặc phân tử có lớp điện tử ngoài cùng chứa điện tử không cặp đôi, và chúng có thể mang điện tích dương, âm hoặc không mang điện tích.

2.2.2 Quá trình hình thành gốc tự do

Có 4 quá trình dẫn đến sự hình thành gốc tự do:

Sự đồng ly của các phân tử với liên kết yếu là quá trình phân giải lipid hydroperoxid (LHP), một sản phẩm của oxy hóa acid béo không bão hòa nhiều nối đôi (PUFA) Trong quá trình này, lipid bị phân hủy thông qua sự đồng ly giữa các phân tử, dẫn đến hình thành các gốc tự do.

Phân ly bởi phóng xạ xảy ra khi bức xạ ion hóa tạo ra các gốc cation và điện tử Những gốc này tiếp tục phân hủy và tham gia vào các phản ứng hóa học, dẫn đến sự hình thành một lượng lớn các gốc tự do trung tính và gốc tự do mang điện.

Ánh sáng có thể gây ra sự phân ly các liên kết hóa học, dẫn đến sự hình thành các gốc tự do, từ đó góp phần vào quá trình lão hóa.

Quá trình oxy hóa ion kim loại có vai trò quan trọng trong việc sản sinh gốc tự do Một ví dụ tiêu biểu là phản ứng Fenton, trong đó gốc tự do HO• được tạo ra từ H2O2 dưới sự xúc tác của ion sắt, minh chứng cho phản ứng oxy hóa khử một điện tử.

2.2.3 Nguồn gốc sự hình thành các gốc tự do trong cơ thể

2.2.3.1 Trong chỗi hô hấp tế bào

Oxy là yếu tố thiết yếu cho sự sống, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cho tế bào Khi tế bào và ty thể sử dụng oxy, quá trình hô hấp tạo ra Superoxide (O2•ˉ), dẫn đến sự hình thành các gốc tự do khác Những gốc tự do này, bao gồm các dạng oxy hoạt động (ROS) và nitơ hoạt động (RNS), như hydroxyl (OH•), nitric oxide (NO•), nitơ đioxit (NO2•), peroxyl (ROO•) và lipid peroxyl, được xem là sản phẩm phụ trong quá trình hình thành ATP (adenosine triphosphate).

LOO được hình thành khi các liên kết hóa học trong tế bào bị vỡ Các chất như hydrogen peroxide (H2O2), ôzôn (O3), oxy singlet (O2), acid hypochlorous (HOCl), acid nitrous (HNO2), peroxynitrite (ONOOˉ), dinitơ trioxit (N2O3) và lipid peroxide (LOOH) không phải là gốc tự do, mà thường được gọi là các dạng oxy hóa (oxidants) Những chất này có khả năng gây ra các phản ứng gốc tự do trong cơ thể sống.

2.2.3.2 Tác dụng của tia phóng xạ

Dưới tác động của tia phóng xạ, các dạng oxy hoạt động được hình thành cả bên trong và bên ngoài tế bào, dẫn đến sự hình thành gốc tự do mạnh mẽ Ví dụ, khi các phân tử nước tiếp xúc với bức xạ năng lượng cao, chúng sẽ phân hủy thành các tiểu phần gốc có khả năng phản ứng rất mạnh.

Tia cực tím và bức xạ mặt trời trong tự nhiên có khả năng tạo ra các gốc tự do với cường độ thấp, nhưng sự tổn hại mà chúng gây ra sẽ tích lũy theo thời gian.

Khi vi khuẩn hoặc dị vật xâm nhập vào cơ thể, bạch cầu đa nhân trung tính sẽ bao kín và tiến hành thực bào Enzyme NADPH oxidase được kích hoạt, xúc tác phản ứng giữa oxy và NADPH để tạo ra superoxide, giúp tiêu diệt vi khuẩn và phân hủy dị vật Tuy nhiên, một phần oxy hoạt động có thể thoát ra ngoài bạch cầu, gây ra tình trạng viêm.

2.2.3.4 Trong hiện tượng thiếu máu cục bộ và tái tưới máu

Thiếu máu cục bộ xảy ra khi quá trình tưới máu bị gián đoạn, dẫn đến giảm oxy trong tế bào và mô Tình trạng này có thể xảy ra tạm thời trong các trường hợp như nhồi máu, phẫu thuật tim mạch hoặc các ca phẫu thuật liên quan đến kẹp cuống mạch Khi máu được cung cấp lại bình thường, điều này có thể tạo ra các gốc tự do trong cơ thể.

Khi thiếu máu cục bộ, hợp chất xanthin tích lũy do thoái hóa ATP và enzyme xanthin oxidase được kích hoạt, chuyển đổi hypoxanthin thành xanthin và sau đó thành acid uric Khi máu được tưới trở lại với oxy, enzyme này xúc tác phản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthin và xanthin sang superoxide và H2O2 Hoạt động thể chất mạnh mẽ có thể kích thích phản ứng của xanthin oxidase, dẫn đến sự hình thành nhiều gốc tự do trong cơ bắp và tim.

Gốc tự do không chỉ hình thành từ các nguyên nhân tự nhiên mà còn do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm môi trường, khói thuốc, rượu và một số loại thuốc như kháng sinh quinoid và thuốc chống ung thư như bleomycin, anthracyclin, adriamycin Các hợp chất như penicillamin, phenylbutazon, acid fenamic và aminosalicylat, cùng với sulphasalazin, có thể ức chế protease, làm giảm acid ascorbic và tăng cường quá trình peroxid hóa lipid Với hoạt tính sinh học mạnh, gốc tự do có khả năng gây ra các phản ứng hóa học phá hủy tế bào, dẫn đến nguy cơ mắc các bệnh như ung thư, nhồi máu cơ tim và lão hóa.

2.2.4 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể Ở nồng độ thấp các ROS và RNS cần thiết cho quá trình hoàn thiện cấu trúc tế bào và có thể hoạt động như một vũ khí trong hệ thống bảo vệ của tế bào chủ, phát huy tác dụng có lợi đối với chức năng miễn dịch của tế bào Các tế bào thực bào (bạch cầu trung tính, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân) sẽ giải phóng ra các gốc tự do nhằm ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh Đặc biệt, các ROS giữ vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể mà ví dụ điển hình là ở các bệnh nhân bị u hạt Những bệnh nhân này có sự khiếm khuyết trong hệ thống oxy hóa NADPH liên kết màng, làm cho cơ thể không thể tự sản xuất ra superoxide (O 2 •ˉ ) gây ra sự nhiễm trùng đa Do đó, sự có mặt của các ROS trong trường hợp này là rất cần thiết nhằm bổ sung các gốc tự do, hạn chế sự nhiễm trùng Ngoài ra, các gốc tự do còn góp phần tiêu diệt các tế bào già, tế bào chết trong cơ thể, tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi và phát triển hoặc tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư.[3, 15]

Sự hiện diện của các acid béo chưa bão hòa nhiều nối đôi và oxy tạo điều kiện cho quá trình peroxide hóa lipid diễn ra, một quá trình chuyển hóa bình thường trong tế bào ở mọi cơ quan Quá trình này giúp điều hòa tính thấm của màng tế bào, sinh ra prostaglandin và hydroperoxid cholesterin cần thiết cho việc tạo hormone steroid, đồng thời điều hòa hoạt động của các enzyme liên kết với màng tế bào và lưới nội bào Tuy nhiên, nếu quá trình này diễn ra mạnh mẽ và kéo dài, nó có thể gây ra những ảnh hưởng bất lợi cho cơ thể.

2.2.5 Tác hại của gốc tự do

Tổng quan về chất kháng oxy hóa

2.3.1 Giới thiệu chung về chất kháng oxy hóa

Hầu hết các sinh vật có khả năng bảo vệ và sửa chữa tổn hại do oxy hóa, đặc biệt là lipid tế bào, nhờ lớp áo protein và nồng độ cao các chất kháng oxy hóa như vitamin E và glutathione Tuy nhiên, sự bảo vệ này không hoàn toàn, vì vậy cần bổ sung thêm chất kháng oxy hóa để tăng cường hiệu quả bảo vệ.

Chất kháng oxy hóa là những hợp chất có khả năng ngăn ngừa và loại bỏ tác hại của gốc tự do Chúng có thể phản ứng trực tiếp với gốc tự do để tạo ra những gốc kém hoạt động hơn, từ đó ngăn chặn chuỗi phản ứng dây chuyền do gốc tự do gây ra Ngoài ra, chất kháng oxy hóa còn có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại trong phản ứng Fenton hoặc ức chế enzym xúc tác cho quá trình sinh ra gốc tự do, giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể.

2.3.2 Phân loại chất kháng oxy hóa

Có nhiều cách để phân loại chất kháng oxy hóa:[1]

 Phân loại theo bản chất: enzyme hoặc không enzyme

 Phân loại theo nhiệm vụ ưu tiên: loại bỏ superoxide, peroxide hay gốc tự do

 Phân loại theo nơi có mặt: trong tế bào, ngoài tế bào, khu vực ái nước, khu vực kỵ nước

2.3.2.1 Chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme

Tồn tại chủ yếu trong tế bào, huyết tương, dịch các mô, dịch tủy sống….hoạt độ các enzyme kháng oxy hóa thấp Gồm :[1]

 Superoxide dismutase: (SOD EC.1.15.1.1): xúc tác quá trình phân hủy superoxide

Superoxide dismutase (SOD) là enzyme quan trọng giúp phân hủy superoxide, với hoạt tính tỉ lệ nghịch với nồng độ của superoxide trong tế bào Có bốn dạng SOD, bao gồm hai loại có cofactor là Cu và Zn, tồn tại trong bào tương và khoảng giữa màng của ty thể; một loại có cofactor là Mn, hiện diện trong ty thể; và một loại có cofactor là Fe, được tìm thấy trong bào tương của E.coli.

 Catalase: xúc tác phản ứng phân hủy hydrogen peoxide và chỉ được hoạt hóa khi H 2 O 2 ở nồng độ cao

 Glutathion peroxidase (EC.1.11.1.9): xúc tác phản ứng loại bỏ các peroxide hữu cơ và vô cơ

Trong đó: GSH: glutathione dạng khử

GSSG: gltathion dạng oxy hóa

The glutathione peroxidase system in the body, which includes glutathione peroxidase, glutathione reductase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, serves as a crucial enzymatic defense against damage caused by oxidative processes.

2.3.2.2 Chất kháng oxy hóa có bản chất không enzyme

Nhiều chất hóa học có khả năng kháng oxy hóa nhờ vào khả năng phân hủy peroxide, oxy đơn bội và gốc tự do, hoặc bằng cách dập tắt gốc tự do và ngăn chặn quá trình oxy hóa sinh học thông qua các cơ chế gián tiếp Những chất này được chia thành ba nhóm chính.

Thiol có tính khử mạnh, cho phép chúng kết hợp với vitamin C để chuyển đổi vitamin E từ dạng oxy hóa sang dạng khử, phục hồi khả năng dập tắt gốc peroxide của vitamin E Bên cạnh đó, thiol cũng có khả năng trung hòa các gốc tự do.

HO tạo các gốc thiyl

Các thiyl này có thể kết hợp với nhau tạo thành hợp chất disulfit (RSSR) hoặc tham gia phản ứng trung hòa với một gốc khác

Các hợp chất thiol thường gặp gồm: glutathione, mercaptopropionyl- glycin,

 Nhóm các phối tử sắt và đồng

Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton, tạo nên 2 dạng oxy hoạt động rất độc hại cho cơ thể là gốc hydroxyl và oxy đơn bội

Ion sắt nếu được tạo phức qua đủ 6 liên kết phối trí như trong hemoglobin, myoglobin thì không còn có khả năng xúc tác phản ứng trên nữa

Trong cơ thể, nhiều protein tạo hợp chất chelat với sắt thông qua 6 liên kết phối trí, bao gồm transferin trong huyết tương, lactoferin có trong dịch sữa, nước mắt, nước bọt, và ceruloplasmin, một protein chứa đồng.

Polyphenol là nhóm chất phổ biến trong thực vật có hoa, xuất hiện ở tất cả các bộ phận như hoa và trái Chúng chứa ít nhất một vòng nhân thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl –OH và các nhóm thế khác Polyphenol có tính tan trong nước và phản ứng với FeCl3 tạo ra màu xanh lục hoặc tím đen.

Thuộc nhóm này có các vitamin A, E, C, coenzyme Q, các bioflavonoid… Chúng có một số tính chất sau: [1]

 Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do tạo dạng oxy hóa (quinon)

Dạng oxy hóa của các chất có thể chuyển đổi thành dạng lưỡng gốc, cho phép chúng phản ứng với hai gốc tự do khác Tuy nhiên, sự chuyển đổi này diễn ra với xu hướng yếu.

Dạng oxy hóa và dạng khử có khả năng phản ứng thuận nghịch để tạo ra gốc semiquinon Mặc dù một số semiquinon có tính độc, nhưng semiquinon của vitamin A, E, C và coenzyme Q10 lại không độc và có khả năng trung hòa các chất rất hiệu quả.

Các polyphenol dạng ortho có khả năng chelat hóa với ion sắt hoặc đồng, làm giảm khả năng xúc tác của các ion này trong quá trình tạo phản ứng Fenton.

Tổng quan về polyphenol

Polyphenol là chất chuyển hóa trung gian quan trọng trong đời sống thực vật, giúp bảo vệ mô và truyền tín hiệu, đồng thời tham gia vào sự tương tác giữa thực vật và môi trường Đối với sức khỏe con người, polyphenol có tác dụng tích cực trong việc phòng ngừa ung thư và chống viêm, chẳng hạn như ức chế enzyme sao chép của vi khuẩn.

Quá trình tự hủy của tế bào ung thư có thể kích thích các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào sản xuất cytokine, giúp kháng khuẩn, vô hiệu hóa độc tố vi khuẩn và chống lại sự lây nhiễm của các mầm bệnh kháng thuốc kháng sinh.

Polyphenol, với cấu trúc chứa nhiều nhóm chức phenol, có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền do gốc tự do gây ra Chúng có thể phản ứng trực tiếp với gốc tự do, tạo thành gốc tự do mới bền hơn, hoặc tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp, từ đó ngăn cản quá trình tạo ra gốc tự do Một ví dụ điển hình là khả năng chelat hóa với ion sắt, làm mất khả năng xúc tác của ion này trong phản ứng Fenton.

Thuật ngữ “polyphenol” bao gồm hơn 8000 hợp chất và tùy vào tính chất hóa học của chúng ta có thể phân chia chúng thành 10 loại khác nhau.[5]

Số lƣợng carbon Lớp Cấu trúc cơ bản Nguồn

Acid Benzoic Acetophenones Acid Phenylacetic Acid Cinnamic

Xanthones Stilbenes Anthraquinones Flavonoids Lignans, neolignans

Hydrolysable tannins Lignins Polime của acid phenolic và đường đơn

Nam việt quất, ngũ cốc Táo, Mơ, Chuối, hoa Súp lơ

Cà rốt, cam quýt, cà chua Cải bina, quả đào, ngũ cốc, lê, cà tím

Cà rốt, cần tây, cam quýt, cây mùi tây Quả hạch

Vừng, lúa mạch, lúa mì, lanh Quả lựu, quả mâm xôi

Bảng 2.2 phân loại các polyphenol

Ví dụ: Trans resveratrol Nguồn : rượu đỏ, quả mâm xôi

Nhóm chất màu tan trong nước có nhiều trong trái cây, rau và các loại hoa (quả mộng, dịch chiết hạt nho, cải dầu)

Ví dụ: Epicatechin gallate Nguồn: Trà xanh

Ví dụ: catechin nguồn: chocolate

Ví dụ: luteolin Nguồn: ớt xanh, cà rốt, dầu olive, cam

Coumaric acid: R=R 1 =H R 2 =OH Cafeic acid: R=H R 1 =R 2 =OH Ferulic acid: R=H R 1 =OCH 2 R 2 =OH

Polyphenols là một nhóm hợp chất quan trọng trong thực vật, có mặt trong nhiều loại thực phẩm như chocolate, rượu, nho và hành tây Chúng không chỉ đóng vai trò là chất phụ gia trong công nghệ thực phẩm mà còn được sử dụng trong ngành mỹ phẩm.

Sơ đồ 2.1 Phân loại các hợp chất polyphenol

Athocyanin Flavonol Flavones Chalcones Khác

These compounds are formed through β-oxidation, which shortens the branched chain of cinnamate and its derivatives containing OH and OCH3 groups Hydrolyzable tannins, characterized by the ester structure of glucose and gallic acid, also belong to this category The carboxyl group of polyphenolic compounds can be reduced to produce aldehydes and alcohols Typically, these substances are found in the form of esters or glycosides, including cinnamic acid, caffeic acid, ferulic acid, trihydroxycinnamic acid, and sinapic acid.

Trong phân tử, thường có 2 mono-trihydroxyphenyl, được coi là tiền chất cho oligo hoặc polymer phenolic Các phenylpropanoid chuyển hóa thường tạo ra acid hydroxycinnamic, bao gồm nhiều nhóm khác nhau.

 Nhóm trực tiếp: là thành phần chủ yếu của các loại tinh dầu, ethanol, safrol…

 Nhóm được ester hóa: rất thường gặp trong thực vật, acid clorogenic có tính chất gần giống tannin, acid rosmarinic được xem là tannin của họ Lamiaceae

Nhóm đóng vòng của dẫn xuất o-hydroxycinamat tạo ra coumarin, trong khi coumarin kết hợp với đơn phân isopropen tạo thành furocoumarin, thường gặp trong họ Apiaceae và Rutaceae Các mạch isopropen rất hoạt tính, có khả năng trải qua các phản ứng oxy epoxy hóa, hydroxyl hóa và đóng vòng, dẫn đến sự hình thành nhiều hợp chất khác nhau.

Nhóm lignin được hình thành từ hai đơn vị phenylpropanoid liên kết với nhau qua liên kết carbon-carbon Tương tự như các acid hydroxycinnamic, este và rượu, lignan và neolignan nhị trùng hợp (C6-C3)2, cùng với polymer lignin trong vách tế bào thực vật [(C6-C3)n], được tạo ra thông qua quá trình oxy hóa Resveratrol và các dẫn xuất hydroxystilbenoid của nó cũng có khả năng phản ứng tương tự, tạo ra các polyphenolic oligomer.

Từ dẫn xuất cinamat, quá trình sinh tổng hợp tiếp tục tạo các xanthon, pyron, flavonoid…[13]

Tanin là hợp chất polyphenol phổ biến trong thực vật, có phân tử lượng từ 500 đến 3000Da Chúng chứa nhiều nhóm OH, làm tăng độ nhớt của dung dịch khi hòa tan trong nước, tùy thuộc vào số lượng nhóm OH Tannin được chia thành hai nhóm chính.

Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glucose với acid galic, bao gồm tannin galic và tannin ellagic Tannin galic được hình thành khi các nhóm OH tại các vị trí C-1, 2, 3, 4 hoặc 6 của glucose tạo ester với từ một đến n acid galic Trong khi đó, tannin ellagic xuất hiện với liên kết C-C giữa nhân glucose và hai nhân benzene của acid galic.

 Tannin hóa đặc: không thủy giải được dưới tác dụng của acid loãng, tạo ra từ sự polymer hóa của một vài flavonoid như catechol hoặc epicatechol

Quá trình trao đổi hydro giữa phenylpropanoid và acetate tạo các polyhydroxystilbenes (C 6 -C 2 -C 6 ) đặc biệt là các phytoalexin trans – resveratrol (3,5,4 '-trihydroxy-trans-stilbene) [13]

Trong các hợp chất polyphenol thì chất chiếm tỉ lệ nhiều nhất là các acid phenolic (30%) và flavonoide (60%)

Acid phenolic tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau trong thực vật, bao gồm aglycones, ester, glycosides, hoặc phức hợp Hàm lượng hợp chất phenolic có sự khác biệt rõ rệt giữa các loại thực vật và cấu trúc của chúng, thường xuất hiện trong trái cây, rau quả, cây họ đậu, ngũ cốc, hạt, cây dược liệu và gia vị Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cho thấy hàm lượng phenolic có mối tương quan nghịch với nguy cơ bệnh tim mạch vành Cấu trúc phenolic chứa nhóm phenolic hydroxyl, có khả năng phản ứng với ROS và RNS, giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể Ngoài ra, phenolic tương tác mạnh mẽ với protein nhờ cấu trúc vòng benzenoid kỵ nước và lực liên kết hydro, có khả năng bất hoạt một số enzyme xúc tác phản ứng hình thành gốc tự do như cytochrome P450 isoforms, lipoxygenases, cyclooxygenase và xanthine oxidase, đồng thời hỗ trợ các chất kháng oxy hóa khác như ascorbic acid, β-carotene và α-tocopherol.

Flavonoid là hợp chất thực vật có cấu trúc bao gồm hai vòng thơm liên kết với ba nguyên tử cacbon, tạo thành một heterocycle oxy hóa Chúng tồn tại ở dạng tự do hoặc glycosid và đã được mô tả với hơn 5000 hợp chất, chia thành 13 lớp như chalcones, flavon, flavonol, và anthocyanidins Flavonoid thường dễ kết tinh và có màu sắc đa dạng: flavon có màu vàng nhạt đến vàng cam, flavonol có màu vàng, và anthocyanidin tạo ra màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái cây Cấu trúc chung của flavonoid là mạch 15-carbon (C6-C3-C6) với hai vòng benzen gắn với chuỗi ba carbon Các flavonoid có tính kháng oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ cơ thể chống lại tổn thương do gốc tự do.

 Trung hòa các gốc tự do và làm chậm đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxid hóa lipid

 Tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp giúp ngăn chặn sự peroxid hóa lipid

 Ức chế một số enzym như: xanthin oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase…Đây là các enzyme xúc tác các phản ứng hình thành gốc tự do

Các phytochemical trong cơ thể con người được coi là có lợi cho sức khỏe nhờ vào khả năng bắt gốc tự do, bảo vệ và tái sinh các chất kháng oxy hóa như vitamin E, cũng như chelat hóa các ion kim loại gây hại.

Bên cạnh những thuộc tính chung của các hợp chất, một số hợp chất polyphenolic, đặc biệt là catechin có tiềm năng kháng oxy hóa giúp ngăn ngừa ung

Tannin được biết đến với khả năng phát huy nhiều tác dụng sinh lý, bao gồm giảm huyết áp, tăng tốc độ đông máu, và giảm mức lipid huyết thanh, đồng thời có thể gây hoại tử gan Cấu trúc của các hợp chất phenolic đóng vai trò quan trọng trong khả năng bắt gốc tự do của chúng Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn thiếu các tiêu chuẩn thích hợp để xác định thành phần phenolic trong thực vật.

Các công trình nghiên cứu trước đây

2.5.1 Nghiên cứu thành phần hóa thực vật của polyphenol trong Tía Tô

Polyphenols present in Perilla leaves exhibit diverse structures and biological activities, significantly influencing the quality and functional components of the plant The extract of Perilla leaves in water contains a mixture of compounds, including phenolic acids, derivatives of cinnamic acid, flavonoids, and lignans The primary phenolic acids are gallic acid, hydroxytyrosol (3,4-DHPEA), and derivatives of cinnamic acid such as tartaric coumaroyl acid, caffeic acid, and rosmarinic acid The flavonoids identified include scutellarein 7-O-diglucuronide, luteolin-7-O-diglucuronide, apigenin 7-O-diglucuronide, luteolin 7-O-glucuronide, and anthocyanins, primarily cis-shisonin, shisonin, malonylshisonin, and cyanidin 3-O-(E)-caffeoylglucoside-5-O-malonylglucoside.

2.5.2 Ảnh hưởng có lợi của các acid béo omega-3, 6, 9 đối với sức khỏe mà hạt Tía Tô là một nguồn dầu thực vật điển hình

Hạt Tía Tô là nguồn cung cấp phong phú acid béo chưa bão hòa đa nối đôi (PUFAs), với hàm lượng dầu chiếm từ 35 đến 45% Trong đó, omega-3 (acid alpha-linoleic) chiếm từ 54 đến 64%, trong khi omega-6 (acid linoleic) chiếm từ 11 đến 14%.

Hạt Tía Tô chứa 14-23% acid oleic và 6,7-7,6% acid béo không bão hòa, cùng với các polyphenol như acid rosemarinic, luteolin, chrysoeriol, quercetin, catechin, apegenin và shishonin Những acid béo chưa bão hòa này mang lại lợi ích sức khỏe, giúp phòng ngừa nhiều bệnh lý như rối loạn tim mạch, ung thư, viêm và viêm khớp dạng thấp.

2.5.3 Acid Triterpen từ lá Tía Tô và khả năng chống viêm, giảm sự phát triển khôi u

This study identifies nine types of triterpenoid acids, including six from the ursane group—ursolic acid, corosolic acid, 3-epicorosolic acid, pomolic acid, tormentic acid, and hytadienic acid—and three from the oleanane group—oleanolic acid, augustic acid, and epimaslinic acid These compounds were extracted and identified from the methanol extract of red perilla (Perilla frutescens (L.) Britton Var acuta Kudo) and green perilla (Perilla frutescens (L.) Britton Var acuta Kudo former viridis Makino) The ursolic, corosolic, pomolic, tormentic, hytadienic, oleanolic, augustic, and epimaslinic acids were evaluated for their inhibitory effects against 1-2-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), an inflammatory agent Most tests demonstrated significant anti-inflammatory effects in mice, with an ID 50 ranging from 0.09 to 0.3 mg per mouse ear Additionally, ursolic acid, 3-epicorosolic acid, tormentic acid, and epimaslinic acid were found to inhibit tumor growth in mice when tested with 7,12-dimethylbenz(α)anthracene (DMBA) and TPA.

2.5.4 Acid Rosmarinic ức chế viêm biểu bì: hiệu quả chống ung thƣ của dịch chiết Tía Tô ( Perilla frutescens ) trong mô hình da chuột hai giai đoạn

Dịch chiết Tía Tô đã cho thấy khả năng giảm khối u ở chuột trong các thử nghiệm với chất sinh ung thư Thí nghiệm được thực hiện qua hai giai đoạn, bắt đầu với 7,12-dimetylbenz(α)anthracene (DMBA) và được thúc đẩy bởi 12-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate (TPA) Sau khi khởi phát khối u bằng DMBA, việc bôi dịch chiết Tía Tô với liều 2 mg/chuột đã cho thấy sự ức chế đáng kể khối u Acid Rosmarinic được xác định là yếu tố quyết định, tác động đến khối u thông qua hai cơ chế độc lập: ức chế phản ứng viêm và bắt giữ các gốc oxy hóa.

Các phương pháp phân tách phân đoạn cao chiết

2.6.1 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật chiết bằng dung môi (solvent extraction) được sử dụng phổ biến để tách các hợp chất quan trọng từ dung dịch ban đầu.

HVTH: Hà Thị Mỹ Chi, GVHD: TS Ngô Đại Nghiệp, đề cập đến việc phân chia cao thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

Phương pháp này dựa vào sự phân bố của chất tan trong hai pha lỏng không hòa tan vào nhau Để tách chất, cần chọn dung môi phù hợp dựa trên độ phân cực của chất cần tách Dung môi không phân cực như eter dầu hỏa hiệu quả trong việc hòa tan các hợp chất không phân cực như alcol béo và ester béo Dung môi phân cực trung bình như dietyl eter và cloroform thích hợp cho các hợp chất có tính phân cực trung bình, bao gồm các hợp chất chứa nhóm ester, aldehyde và ceton Cuối cùng, dung môi phân cực mạnh như methanol hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh, chẳng hạn như các hợp chất chứa nhóm –OH và –COOH.

Chiết lỏng - lỏng sử dụng bình lóng, trong đó cao thô được hòa tan trong nước và chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ không hòa tan với nước hoặc có thể hòa trộn với nước Các dung môi này, từ kém phân cực đến phân cực như eter dầu hỏa, eter etyl, cloroform, etyl acetat và n-butanol, giúp tách các hợp chất có tính phân cực khác nhau Tùy thuộc vào tỉ trọng giữa dung môi và nước, pha hữu cơ sẽ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước Quá trình chiết được thực hiện nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi cho đến khi không còn chất hòa tan, sau đó chuyển sang dung môi khác Chiết một dung môi được coi là hoàn tất khi sắc ký trên bản mỏng không còn vệt chất hoặc không để lại dấu vết trên lam kính sau khi bay hết dung môi.

Một số lưu ý khi sử dụng dung môi chiết lỏng - lỏng bằng bình lóng: [4]

Khi lắc bình lóng nhiều lần, dung môi trong bình có thể tạo thành nhũ tương Để nhanh chóng tách dung dịch thành hai lớp, cần phá bọt bằng cách khuấy nhẹ trên thành bình lóng bằng đũa.

Quá trình chiết lỏng - lỏng diễn ra ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ của dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan của nó.

2.6.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc của quá trình hấp phụ dựa trên hiện tượng pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua pha tĩnh, được tạo thành từ chất hấp phụ trơ như silica gel hoặc oxit alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đồng đều trên bề mặt phẳng của tấm kính, tấm nhôm hoặc plastic.

 Bình sắc ký là chậu, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng nhưng phải có nắp đậy kín

 Mẫu cần phân tích thường được chấm thành một điểm lên bảng mỏng nhờ một vi quản

Pha động có khả năng di chuyển chậm qua lớp mỏng nhờ vào tính mao quản, kéo theo mẫu chất theo hướng di chuyển của dung môi hoặc hỗn hợp dung môi Tốc độ di chuyển của từng thành phần trong mẫu phụ thuộc vào độ phân cực của các chất, dẫn đến sự phân tách rõ rệt giữa các thành phần.

Hệ số di chuyển Rf là tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của hợp chất từ điểm xuất phát đến tâm vệt và khoảng cách di chuyển của dung môi từ vạch xuất phát đến vạch kết thúc Giá trị Rf luôn nhỏ hơn một và có thể thay đổi tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau.

 Loại bản mỏng (silica gel hay alumina)

 Hoạt độ và độ dày của bản

 Thành phần dung môi giải ly

Công dụng của sắc ký lớp mỏng [4]

 Đánh giá độ tinh khiết của một hợp chất thông qua giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi ly giải xác định

 Kiểm tra mức độ tương đồng giữa hai hợp chất: nếu hai chất giống nhau thì

R f của hai chất cần phải tương đồng khi sử dụng các loại dung môi khác nhau, và màu sắc của hai vết cũng phải giống nhau khi thử nghiệm với cùng một loại thuốc thử.

Để xác định số lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu, cần thực hiện quá trình giải ly bản mỏng bằng nhiều hệ dung môi khác nhau Qua việc quan sát số lượng vệt hiện trên bản, chúng ta có thể dự đoán được số lượng hợp chất có trong mẫu ban đầu.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu

Tía Tô dùng trong nghiên cứu là Tía Tô đỏ (P.frustesen (L.) Britton var Acuta Kudo), mua ở chợ đầu mối Thủ Đức.

Quy trình trích ly dự kiến

Sơ đồ 3.1 Quy trình trích ly dự kiến

 Làm sạch: Tía tô sau khi thu hái sẽ được rửa sạch, để ráo nước

Sau khi được làm sạch, thân và lá cây Tía Tô sẽ được cắt nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với tác nhân sấy Điều này giúp đẩy nhanh quá trình bốc hơi nước trong nguyên liệu, hạn chế sự mất mát các hợp chất kháng oxy hóa và rút ngắn thời gian sấy.

Sau khi xử lý, lá Tía Tô sẽ được xếp lên khay và đưa vào tủ sấy với không khí nóng làm tác nhân gia nhiệt Quá trình sấy sẽ được thực hiện kết hợp với việc đảo trộn để tránh nguyên liệu bị chồng chất Nhiệt độ sấy dự kiến là 80 độ C trong 20 phút Sau khi hoàn tất, sản phẩm có thể sử dụng ngay hoặc được bao gói kín để bảo quản và dùng dần.

 Xay: nhằm chuẩn bị cho quá trình trích ly, tạo cho mẫu có kích thước phù hợp, tăng diện tích tiếp xúc của mẫu với dung môi

Quá trình trích ly involves soaking nguyên liệu trong dung môi như nước, ethanol hoặc methanol để hòa tan các chất kháng oxy hóa Các chất này có tính chất phân cực, do đó dung môi sử dụng cũng phải là phân cực Nhiệt độ lý tưởng cho quá trình trích ly là 80 độ C trong khoảng thời gian 30 phút để đạt hiệu quả tối ưu.

 Lọc: loại bã thô dựa trên khả năng của các vật liệu xốp chỉ cho đi qua những phần tử có kích thước nhất định

 Dịch chiết thu được, đem cô quay và đông khô ta thu được cao chiết

Sơ đồ nghiên cứu

1 Khảo sát thành phần nguyên liệu

2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu

3 Khảo sát điều kiện trích ly

4 Đánh giá hiệu quả trích ly của dung môi nước

5 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết

– Nhiệt độ sấy – Thời gian sấy

– Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi – Nhiệt độ trích ly

– So sánh giữa hiệu quả trích ly

1 lần với trích ly kiệt – So sánh hiệu quả trích ly của dung môi nước so với các dung môi khác

7 Xác định số phân đoạn có trong cao chiết

– Hiệu suất trích ly – Tổng phenolic – Tổng flavonoid – DPPH

6 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học cao chiết

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát một số thành phần của Tía Tô

Tía Tô tươi sau khi thu hái, sẽ được khảo sát:

Hàm ẩm: sử dụng cân sấy ẩm Ohaus MB23 Độ tro: bằng phương pháp vô cơ hóa mẫu

Tỉ lệ thân : lá: dùng cân phân tích Ohaus Pioneer (độ chính xác đến 0,0001)

Mười gram mẫu tươi sẽ được cắt nhỏ và ngâm trong 100 ml nước cất trong 24 giờ Sau đó, dịch trích sẽ được lọc và phần bả còn lại sẽ tiếp tục được trích với nước cất cho đến khi dịch trích không còn màu Cuối cùng, các dịch trích thu được từ các lần ngâm sẽ được hòa chung lại để xác định các chỉ tiêu cần thiết.

Tổng phenolic: phương pháp Folin-Ciocalteu.[6]

Tổng flavonoid: phương pháp so màu, dựa vào sự chuyển màu của

Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenolic

Tổng phenolic content (TFC) được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteau, trong đó 1ml dịch chiết mẫu được pha loãng với 9ml nước cất trong bình định mức 25ml Sau đó, thêm 1ml thuốc thử Folin và lắc đều trong 5 phút, tiếp theo là thêm 10ml Na2CO3 7% và định mức lên 25ml Hỗn hợp này được ủ trong 90 phút ở nhiệt độ phòng và đo quang phổ ở bước sóng 750 nm Kết quả cuối cùng được tính theo đơn vị mg đương lượng catechin (GAE) trên 100g chất khô.

Công thức tính như sau:

M: hàm lượng polyphenol trong mẫu đo quang học (suy ra từ đường chuẩn) (mg/l)

V: thể tích dung môi sử dụng (ml) f: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu đem trích ly (g) w: độ ẩm của mẫu (%)

Xác định thành phần flavonoid tổng số (TFC)

TFC được xác định thông qua phương pháp so màu, bắt đầu bằng cách pha loãng 1ml dịch chiết mẫu với 4ml nước trong bình định mức 10ml Sau đó, thêm 0,3ml NaNO2 5% và sau 5 phút, tiếp tục thêm 0,3ml AlCl3 10% Cuối cùng, sau 6 phút, cho thêm 2ml NaOH vào hỗn hợp.

Sau khi thêm 2,4 ml nước vào bình phản ứng, hãy trộn đều và tiến hành đo quang phổ tại bước sóng 510 nm Kết quả được biểu thị bằng mg đương lượng catechin (CE) trên 100g chất khô.

M’: hàm lượng flavonoid trong mẫu đo quang học (suy ra từ đường chuẩn) (mg/l)

V’: thể tích dung môi sử dụng (ml) f'’: hệ số pha loãng m’: khối lượng mẫu đem trích ly (g) w’: độ ẩm của mẫu (%)

3.3.2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu

3.3.2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy

Mục đích: Tìm ra nhiệt độ thích hợp sao cho hợp chất kháng oxy hóa hao hụt là ít nhất

Yếu tố khảo sát: nhiệt độ sấy: 50, 60, 70, 80 và 90 0 C

 Tỉ lệ mẫu : dung môi = 1:10

 Thời gian trích ly 30 phút

Để tiến hành, 5g mỗi mẫu cần được rửa sạch và để ráo nước Sau đó, mẫu sẽ được cắt nhỏ và sấy ở các nhiệt độ lần lượt là 50, 60, 70, 80 và 90 độ C trong khoảng thời gian quy định.

20 phút Sau đó, các mẫu này sẽ được giã nhuyễn, trích ly với 50ml nước cất (70 0 C)

Trong 30 phút, tiến hành lọc loại bã để thu được dịch chiết Dịch chiết này sẽ được cô đặc trong chân không, sau đó bao gói kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi tiến hành phân tích.

Chỉ tiêu theo dõi: tổng phenolic, tổng flavonoid (thí nghiệm 3.3.1), hàm ẩm

3.3.2.2 Khảo sát thời gian sấy

Mục đích: tìm ra thời gian sấy thích hợp cho nguyên liệu

Yếu tố khảo sát: thời gian sấy: 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút

 Nhiệt độ sấy: (kết quả thí nghiệm 3.3.2.1)

 Tỉ lệ mẫu: dung môi = 1:10

 Thời gian trích ly: 30 phút

Để tiến hành thí nghiệm, mỗi mẫu 5 gam sẽ được rửa sạch và để ráo nước, sau đó cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ đã xác định từ thí nghiệm 3.3.2.1 trong các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút Cuối cùng, các mẫu này sẽ được hòa tan trong dung môi và thực hiện theo quy trình của thí nghiệm 3.3.2.1.

Chỉ tiêu theo dõi: tổng phenolic, tổng flavonoid (thí nghiệm 3.3.1), độ ẩm

3.3.3 Khảo sát điều kiện trích ly

3.3.3.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi

Mục đích: nhằm tìm tỉ lệ phù hợp cho quá trình trích ly

Tỉ lệ khảo sát: 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 và 1:60

 Nhiệt đô sấy: thí nghiệm 3.3.2.1

 Thời gian sấy: thí nghiệm 3.3.2.2

 Thời gian trích ly: 30 phút

Cách tiến hành: mẫu và dung môi lần lượt được chuẩn bị theo các tỉ lệ

1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 và 1:60 Quá trình thực hiện như thí nghiệm 3.3.2.1

Chỉ tiêu theo dõi: tổng phenolic, tổng flavonoid (thí nghiệm 3.3.1)

3.3.3.2 Khảo sát nhiệt độ trích ly

Mục đích: nhằm tìm ra nhiệt độ phù hợp cho quá trình trích ly

Nhiệt độ khảo sát: 50, 60, 70, 80, 90 và 100 0 C

 Loại dung môi: Nước cất

 Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: thí nghiệm 3.3.2.3

 Thời gian trích ly 30 phút

Cách tiến hành: mẫu sau khi sấy sẽ được đem trích ly với nước cất ở các nhiệt độ 50, 60, 70, 80, 90 và 100 0 C Quá trình thực hiện như thí nghiệm 3.3.2.1

3.3.3.3 Khảo sát thời gian trích ly

Mục đích: nhằm tìm ra thời điểm thích hợp để kết thúc quá trình trích ly sao cho thu được hợp chất kháng oxy hóa cao nhất

Thời gian khảo sát: 20, 30, 40, 50 và 60 phút

 Loại dung môi: Nước cất

 Nhiệt độ trích ly: thí nghiệm 3.3.3.2

Cách tiến hành: mẫu sau khi sấy sẽ được đem trích ly với nước cất trong

20, 30, 40, 50 và 60 phút Quá trình thực hiện như thí nghiệm 3.3.2.1

3.3.4 Đánh giá hiệu quả trích ly của dung môi nước

3.3.4.1 So sánh giữa hiệu quả trích ly một lần với trích ly đến kiệt

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng thu hồi phenolic và flavonoid giữa phương pháp trích ly một lần và trích ly đến kiệt, từ đó đưa ra quyết định về công nghệ sản xuất sản phẩm hiệu quả nhất.

 Nhiệt độ sấy: thí nghiệm 3.3.2.1

 Thời gian sấy : thí nghiệm 3.3.2.2

 Nhiệt độ trích ly: thí nghiệm 3.3.3.2

 Thời gian trích ly: thí nghiệm 3.3.3.3

 Đối với mẫu trích ly một lần: quá trình trích ly sẽ được tiến hành theo các yếu tố cố định

Đối với mẫu trích ly đến kiệt, tiến hành tương tự như mẫu trích ly một lần Sau khi lọc thu dịch, phần bả còn lại sẽ được thêm dung môi và tiếp tục quá trình trích ly cho đến khi dịch trích hoàn toàn không màu.

3.3.4.2 So sánh với các loại dung môi khác

Mục đích: Đánh giá khả năng trích ly của dung môi nước thông qua việc so sánh với các dung môi khác ở cùng điều kiện trích ly

Yếu tố khảo sát: các loại dung môi: nước, ethanol, dung dịch ethanol

(ethanol : nước = 80:20), methanol, dung dịch ethanol (ethanol : nước = 80:20)

 Thời gian sấy : thí nghiệm 3.3.2.2

 Thời gian trích ly: thí nghiệm 3.3.3.3

Để tiến hành quá trình trích ly, mẫu sẽ được chuẩn bị dựa trên các yếu tố cố định và sử dụng ba loại dung môi khác nhau Quá trình này sẽ thực hiện theo phương pháp thí nghiệm 3.3.2.1 Sản phẩm cuối cùng sẽ được đánh giá về tổng phenolic và tổng flavonoid, từ đó rút ra kết luận về hiệu quả của việc trích ly bằng dung môi nước so với các dung môi khác.

3.3.5 Xác định khả năng kháng oxy hóa của cao chiết

Mẫu được lựa chọn từ các thí nghiệm 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3 và 3.3.4 sẽ được đánh giá in vitro về khả năng kháng oxy hóa, dựa trên các tiêu chí như tổng phenolic, tổng flavonoid, khả năng bắt gốc tự do (DPPH) và năng lực khử so với mẫu đối chứng như BHA và acid ascorbic.

Xác định tổng hàm lượng phenolic

TFC được xác định bằng phương pháp Folin – Ciocalteau thông qua quy trình pha loãng 1ml dịch chiết mẫu (0,1 mg/ml) với 9ml nước cất trong bình định mức 25ml Sau đó, thêm 1ml thuốc thử Folin và lắc đều trong 5 phút, tiếp theo là thêm 10ml Na2CO3 7% và định mức lên 25ml Hỗn hợp này được ủ trong 90 phút ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành đo quang phổ.

= 510 nm Kết quả được tính theo đơn vị mg đương lượng catechin (GAE) /100g mẫu khô [16]

Xác định thành phần flavonoid tổng số (TFC)

TFC được xác định qua phương pháp so màu, trong đó 1ml dịch chiết mẫu (0,1mg/ml) được pha loãng với 4ml nước trong bình định mức 10ml Sau đó, thêm 0,3ml NaNO2 5%, đợi 5 phút rồi thêm 0,3ml AlCl3 10%, và sau 6 phút tiếp tục thêm 2ml NaOH 1M Cuối cùng, thêm 2,4ml nước vào bình phản ứng và trộn đều trước khi đo quang phổ ở bước sóng 510nm Kết quả được tính theo đơn vị mg đương lượng catechin (CE) trên 100g mẫu khô.

Khảo sát năng lực khử

Năng lực khử của cao chiết được xác định qua quy trình sử dụng nồng độ cao chiết từ 0 đến 1000 µg/ml trong 500 µl dung dịch đệm 0,2M, pH 6,6, kết hợp với 500 µl potassium ferricyanide 1% và ủ ở 50°C trong 20 phút Sau đó, thêm 500 µl acid trichloroacetic (TCA) 10% và ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút để loại bỏ kết tủa Cuối cùng, 1 ml dịch nổi được trộn với 2,5 ml nước cất và 0,5 ml FeCl3 1% để đo ở bước sóng thích hợp.

Thử nghiệm khả năng kháng oxi hóa dùng DPPH [8]

Phương pháp này dựa trên việc cho dịch chiết tác dụng với gốc tự do DPPH, làm mất màu DPPH Sau đó, độ hấp thụ của hỗn hợp mẫu thử và mẫu đối chứng được xác định ở bước sóng 517nm Từ những thông số này, khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết được tính toán.

Định dạng
Số trang	89
Dung lượng	2,33 MB