Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (sulfate reducing bacteria SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt

Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt. Đặc điểm của nước bị nhiễm phèn sắt: + Có hàm lượng ion Fe2+ cao+ pH thấp+ Nước có mùi trứng thối+ Có nhiều cặn bẩn màu vàng. Nguyên nhân: Do các khoáng sulfide (như pyrite, FeS2 ) trong quặng tiếp xúc với oxy và nước.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu, thiết bị và hóa chất sử dụng

Hình 2.1: Mẫu phân bò Hình 2.2: Mẫu nước thải Hình 2.3: Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt

- Phân bò thu nhận tại trang trại nuôi bò của anh Đạt, ngụ tại Hòa Vang - Đà Nẵng.

- Mẫu nước thải để làm giàu vi khuẩn SRB được thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc-Hòa Minh-Đà Nẵng.

- Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt tại xã Hòa Nhơn-Hòa Vang-Đà Nẵng.

2.1.2 Thiết bị và hóa chất sử dụng

Trong nghiên cứu này em sử dụng một số thiết bị chính sau:

Bảng 2.1 Các loại biết bị sử dụng chính

T Tên thiết bị Model Nhà sản xuất Xuất xứ

01 Cân phân tích AUY220 Shimadu Nhật

02 Máy đo pH MP220 pH Metter Thụy sỹ

03 Bếp đun HP-2100 Gali electric Trung Quốc

04 Tủ cấy vô trùng ESCO SMART

05 Tủ ấm INB500 Memmert Đức

06 Kính hiển vi quang học CX31RTSS Olympus Phillipine

07 Nồi hấp (Autoclave) CL-40L ALP Nhật

08 Nồi lên men để bàn BF-115 New Brunswick Mỹ

09 Máy ấm lắc SI500 Stuart Anh

10 Máy cất nước một lần 2104 GFL Đức

11 Tủ mát LC-300D Alaska Nhật

Và các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học.

- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, lọ penicillin, lọ serum, ống đong 100ml và 200 ml, cốc thủy tinh 100ml và 250ml.

- Bình tia chứa nước vô trùng, bình xịt chứa cồn 90 0

- Que cấy: que cấy vòng, que trang…

- Đèn cồn, bật lửa, eppendorf.

- Bông thấm nước và bông không thấm nước.

- Giấy báo, giấy kít nylon, găng tay, khẩu trang, viết.

• Hóa chất Để thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu em sử dụng các hóa chất chính như:

- Nước cất vô trùng, cồn 70 0 và cồn 90 0

- Thuốc nhuộm Gram: gồm dung dịch tím kết tinh (Crystal violet), dung dịch Iốt, dung dịch tẩy màu Etanol, dung dịch nhuộm bổ sung Safranin.

- Các hóa chất như: BaCl2, KI, Na2S2O3, NaOH, HCl, hồ tinh bột,…

- Thành phần môi trường N92M1 dùng để phân lập vi khuẩn SRB [34].

Bảng 2.2 Thành phần môi trường N92M 1

STT Thành phần Số lượng Đơn vị

NH4Cl NaCl CaCl2x2H2O KCl MgSO4x7H2O

Na2Sx9H2O Chiết xuất nấm men Axit lactic (40%) Nước cất Agar

Tiệt trùng môi trường ở 121 0 C trong thời gian 2 giờ.

- Thành phần môi trường N92M2 dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn SRB [34].

Bảng 2.3 Thành phần môi trường N92M 2

STT Thành phần Số lượng Đơn vị

NH4Cl NaCl CaCl2x2H2O KCl MgSO4x7H2O

Na2Sx9H2O FeSO4x7H2O Chiết xuất nấm men Axit lactic (40%) Nước cất

Tiệt trùng môi trường ở 121 0 C trong thời gian 2 giờ.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn SRB trong phân bò

- Hòa tan 10g phân bò vào bình serum chứa 90ml nước thải giàu chất hữu cơ (thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc) [16].

- Ủ trong tủ ấm ở 30 0 C trong vòng 5÷7 ngày.

• Thí nghiệm nhận biết sự xuất hiện của khí H 2 S

- Nhận biết bằng cảm quan thông qua mùi của khí thoát ra.

- Nhận biết bằng hóa chất dùng dung dịch SO2 [17].

+ Lấy 10ml dung dịch trong bình serum (sau ngày ủ thứ 7) cho vào ống nghiệm.

+ Cho từ từ dung dịch SO2 vào ống nghiệm trên.

Trong ống nghiệm, dung dịch xuất hiện kết tủa màu trắng đục, sau đó chuyển thành màu vàng nhạt của tinh thể lưu huỳnh, cho thấy đã xảy ra một phản ứng hóa học.

2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn SRB

2.2.2.1 Phương pháp làm giàu kỵ khí vi khuẩn SRB [12].

- Mẫu phân bò có chứa vi khuẩn SRB được thu nhận và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C và phân tích trong vòng 24h.

- Mẫu nước thải giàu chất hữu cơ thu nhận từ trạm xử lý Phú Lộc –Đà Nẵng và phân tích ngay.

Vi khuẩn khử sulfate (SRB) trong mẫu phân bò được làm giàu bằng cách cấy vào bình serum chứa môi trường dịch thể kỵ khí giàu chất hữu cơ, với tỷ lệ cấy 10% và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C Các lần cấy truyền tiếp theo được thực hiện sau 5 đến 7 ngày với cùng tỷ lệ 10% thể tích, giúp tăng số lượng vi khuẩn SRB trong mẫu qua mỗi lần cấy truyền.

Hình 2.4: Qúa trình làm giàu vi khuẩn SRB.

2.2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn SRB a Nguyên tắc [12].

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật ban đầu, nhằm tạo ra các chủng thuần khiết Quá trình này rất quan trọng để khảo sát và định loại vi khuẩn, giúp nghiên cứu sâu hơn về tính chất và ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Sau khi gieo vi khuẩn lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc và ủ trong điều kiện thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển và tạo ra các khuẩn lạc trên môi trường rắn Hình thái của các khuẩn lạc này mang đặc trưng riêng của từng loài vi khuẩn Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời là rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hóa các tiêu chí mô tả như hình dáng, độ cao, bờ và rìa của khuẩn lạc.

Môi trường chọn lọc là công cụ quan trọng để phân lập các nhóm vi sinh vật riêng biệt từ quần thể vi sinh vật tự nhiên Bằng cách sử dụng các yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt và tính mẫn cảm với hóa chất hoặc kháng sinh, môi trường này được điều chỉnh để ức chế sự phát triển của các nhóm vi sinh vật không mong muốn, từ đó hỗ trợ việc phân lập nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu Các môi trường chọn lọc thường được thiết kế dựa trên nhu cầu dinh dưỡng đặc thù của từng nhóm vi sinh vật.

Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, việc tránh đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy là rất quan trọng Để đảm bảo điều này, tất cả các thao tác cần được thực hiện trong điều kiện vô trùng Ngoài ra, mọi yếu tố như môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy và các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp trước khi sử dụng.

Bước 1: Chuẩn bị môi trường

Để cấy trang vi sinh vật, cần chuẩn bị môi trường đặc biệt Đầu tiên, pha chế môi trường N92M1 với thể tích 100ml bằng cách cân từng thành phần và cho vào nước cất, sau đó lắc đều Tiến hành lần lượt cho đến khi hoàn tất tất cả các thành phần trong môi trường.

- Xác định pH của môi trường bằng máy đo pH và dùng dung dịch HCl 1% hoặc NaOH 1M để điều chỉnh đến khoảng pH=7,2÷7,4.

Cân agar với khối lượng từ 1,5 đến 2% thể tích môi trường, sau đó cho vào dung dịch đã pha chế Đối với môi trường lỏng N92M2, quá trình tăng sinh vi sinh vật thực hiện tương tự như pha chế môi trường đặc, nhưng không cần bổ sung agar.

Để đảm bảo an toàn trong quá trình pha chế, cần khử trùng môi trường và các dụng cụ thủy tinh như đĩa petri và ống nghiệm Phương pháp hiệu quả là hấp với hơi nước bão hòa ở áp suất cao, cụ thể là ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1 atm trong thời gian 2 giờ.

Để khử trùng buồng cấy, hãy sử dụng bông thấm cồn để vệ sinh toàn bộ bề mặt thao tác đổ đĩa và nuôi cấy vi sinh vật Đồng thời, cần che chắn buồng cấy cẩn thận và bật tia UV trong 15 phút để nâng cao hiệu quả khử trùng.

- Trong quá trình thao tác nuôi cấy vi sinh cần chú ý: các que cấy trải hay cấy ria cần được ngâm vào cồn 90 0 trong các ống nghiệm.

Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ.

Qúa trình được thực hiện trong tủ cấy vô trùng:

- Đốt đèn cồn, mở bao giấy gói các đĩa petri đã hấp khử trùng.

- Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn.

- Mở hé nắp đĩa Nghiêng bình, rót môi trường vào đĩa petri khoảng 15ml.

- Đậy nắp, xoay tròn đĩa để môi trường đông đặc trong phạm vi bán kính 20cm của ngọn lửa đèn cồn [12].

- Lật ngược đĩa lại, kít giấy nylon, gói giấy báo.

- Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.

Để hạn chế sự nhiễm khuẩn, thao tác đổ môi trường cần phải nhanh chóng và khéo léo Đối với ống nghiệm, để tối ưu hóa sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng, thể tích môi trường nên được phân phối là 5ml.

+ Đối với đĩa petri cho vào mỗi đĩa khoảng 15÷20ml môi trường đặc.

Hình 2.5: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri.

Tên môi trường………tên người pha……… khử trùng ngày……… tháng………năm………

Bước 4: Thu mẫu và pha loãng mẫu

- Mẫu làm giàu ở lần thứ 2 được dùng để phân lập vi khuẩn SRB.

- Hút 1ml mẫu làm giàu lần thứ 2, pha loãng với 9ml nước cất vô trùng Sau đó dùng dịch pha loãng này để cấy trang trên đĩa petri.

Bước 5: Cấy trang trên môi trường N92M 1 đặc.

Dùng pipetman P200 với đầu cụn vụ trụng để hút 100µl dịch vi sinh pha loãng từ mẫu làm giàu lần thứ hai, sau đó chuyển vào các đĩa petri chứa môi trường đặc vô trùng.

- Nhúng đầu que trang thủy tinh vào cồn 70 0 , hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

Mở đĩa petri và nhẹ nhàng đặt thanh gạt lên bề mặt thạch Sử dụng đầu thanh gạt để xoay và trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong quá trình trải, xoay đĩa vài lần quanh chu vi để đảm bảo dịch giống được phân bố đồng đều khắp bề mặt môi trường.

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy nylon.

- Nuôi trong bình hút chân không để hạn chế sự tiếp xúc với oxi không khí.Đảm bảo điều kiện nhiệt độ phòng 28÷30 0 C và nuôi trong 48 giờ [12].

Hình 2.6: Kỹ thuật trải đĩa.

A Que trải B Trải đĩa C.Các khuẩn lạc mọc lên trên đĩa thạch

Bước 6: Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch riêng biệt, ghi nhận hình thái và đặt ký hiệu cho từng khuẩn lạc riêng biệt.

2.2.2.3 Quan sát khuẩn lạc, mô tả đặc điểm khuẩn lạc trên đĩa thạch

- Hình dạng: tròn, bầu dục hay không có hình dạng xác định.

- Kích thước: to, nhỏ bằng cách đo đường kính khuẩn lạc.

- Bề mặt khuẩn lạc: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo.

- Mép khuẩn lạc phẳng đều hay lồi lõm, răng cưa.

- Độ chắc của khuẩn lạc: mềm, cứng hay dai, có khả năng bám chắc vào môi trường hay không.

- Màu sắc của khuẩn lạc [13].

Hình 2.7: Một số dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn.

Hàng 1: nhìn từ trên xuống, hàng 2: nhìn ngang, hàng 3: dạng rìa khuẩn lạc

2.2.2.4 Phương pháp làm thuần a Nguyên tắc

Sau khi phân lập sơ bộ, các khuẩn lạc đơn được chọn lọc và tăng sinh trong môi trường lỏng để tăng số lượng vi sinh vật đồng nhất về đặc điểm và hình thái, đảm bảo chúng có nguồn gốc từ một tế bào hoặc một cụm tế bào ban đầu Tiếp theo, vi khuẩn được làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần trên môi trường đặc.

Bước 1: Tăng sinh trên môi trường lỏng

Lần tăng sinh đầu tiên được thực hiện bằng cách cho vào ống nghiệm 5ml môi trường lỏng N92M2 Sử dụng que cấy vòng vô trùng, từng khuẩn lạc đặc trưng được chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng tương ứng Sau đó, ghi nhãn và chú thích cho các loại ống nghiệm Cuối cùng, nuôi cấy trong bình hút chân không ở nhiệt độ 30 độ C trong 48 giờ.