Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú

Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú.Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, các microRNA (miRNA) là một ứng cử viên tốt trong vai trò là chất chỉ điểm sinh học trong việc phát hiện và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú.

Ung thư vú và các vấn đề liên quan

Khái niệm ung thư vú

Ung thư vú là một loại u ác tính xuất hiện trong vú, phát sinh do sự rối loạn trong quá trình tái sản xuất tế bào.

Ung thư vú là bệnh lý trong đó các tế bào ung thư xuất hiện trong mô vú, thường bắt nguồn từ ống dẫn hoặc tiểu thùy.

SVTH: Trần Thị Bích Ngọc – Lớp: 10SH Nhiễm trùng có thể bắt đầu từ vú và sau đó lây lan sang các mô, cơ quan và bộ phận khác của cơ thể, bao gồm xương, phổi và gan.

Hình 1.1 : Các loại ung thư vú [41].

Tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới và trong nước

Ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với Việt Nam có tỉ lệ tử vong cao Tính đến đầu năm 2002, có 24.570.000 người sống trên 5 năm sau chẩn đoán ung thư, trong đó ung thư vú chiếm 4,4 triệu, đại trực tràng 2,83 triệu và tiền liệt tuyến 2,36 triệu Tỷ lệ mắc bệnh này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa lý, mức sống và loại ung thư.

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ, chiếm khoảng 23% tổng số các loại ung thư, đặc biệt tại các nước đang phát triển Tỷ lệ mắc ung thư vú tăng cao ở độ tuổi 50 và 60, đạt đỉnh ở độ tuổi 70 Dự báo tần suất mắc bệnh sẽ là 111 trên 100.000 dân trong những năm đầu của thế kỷ 21.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xv

Hình 1.2 : Tỉ lệ các loại ung thư của Việt Nam [42].

Theo Bộ Y tế, tỷ lệ phụ nữ Việt Nam có nguy cơ mắc ung thư vú là 10%, con số này được coi là rất cao Chỉ 39,6% bệnh nhân được phát hiện sớm, trong khi 60,4% đến bệnh viện khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, gây khó khăn trong điều trị Điều này càng nghiêm trọng hơn khi nền y tế nước ta chưa có nhiều tiến bộ trong việc điều trị ung thư.

Vấn đề chẩn đoán ung thư vú

Hình 1.3 : Các triệu chứng của bệnh ung thư vú [58].

Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư vú vẫn chưa được xác định rõ ràng, liên quan đến cả yếu tố môi trường và di truyền Các yếu tố nguy cơ bao gồm tiền sử gia đình mắc ung thư vú, thời gian bắt đầu có kinh nguyệt sớm và nhiều yếu tố khác.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xvi

- Lượng thể tích phản ứng:

- Cài đặt chu trình nhiệt xác định, nên bất kỳ ai cũng có nguy cơ mắc bệnh, đặc biệt là khi chúng ta đang ở độ tuổi 40 trở lên [43].

Chẩn đoán lâm sàng dựa vào các dấu hiệu và triệu chứng sau : [43]

 Một cục cứng không đau ở vú

 Liên tục ngứa và phát ban xung quanh núm vú

 Chảy máu hoặc tiết dịch bất thường từ núm vú

 Da trên vú bị sưng và dày lên

 Da trên vú bị trũng hay nhăn nheo

 Núm vú bị kéo vào hoặc thụt vào

Với tỷ lệ tử vong cao và chi phí điều trị phức tạp, bệnh ung thư gây ra tác động nghiêm trọng đến đời sống xã hội toàn cầu.

1.1.3.2 Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng hiện nay

Chẩn đoán xác định ung thư vú chủ yếu dựa vào bộ ba kinh điển: triệu chứng lâm sàng, chụp X quang tuyến vú và xét nghiệm tế bào học [43].

Triệu chứng lâm sàng của khối u vú thường không gây đau, nhưng có thể kèm theo chảy dịch đầu vú (dịch máu hoặc dịch vàng chanh) Khối u thường có mật độ cứng, mặt gồ ghề và ranh giới có thể rõ hoặc không Trong những trường hợp muộn, u có thể xâm lấn vào thành ngực, hạn chế di động hoặc xâm nhiễm da, tạo hình ảnh "sần da cam" hoặc vỡ loét Đôi khi, ung thư vú cũng có thể biểu hiện như viêm tấy lan tỏa (ung thư vú thể viêm) Ngoài ra, bệnh nhân thường có hạch nách cùng bên, với các mức độ tổn thương từ mềm đến cứng, có thể xâm nhiễm dính vào xung quanh tùy theo mức độ tiến triển bệnh Cần lưu ý khám hạch thượng đòn và tuyến vú đối bên trong mọi trường hợp.

Chụp X quang tuyến vú có thể phát hiện những tổn thương điển hình với hình dạng sao nhiều chân, kèm theo sự co kéo của tổ chức tuyến vú và sự xuất hiện của nhiều chấm vi canxi hóa tập hợp thành đám.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xvii

Xét nghiệm tế bào học cho thấy các tế bào ung thư thường mất đi sự kết dính, xuất hiện đa hình thái và có tỷ lệ nhân/nguyên sinh chất tăng cao Ngoài ra, có nhiều nhân quái và hiện tượng chia nhân, đồng thời bào tương có tính kiềm.

Khi cả ba phương pháp trong bộ ba kinh điển đều cho kết quả dương tính, việc chẩn đoán xác định có thể được thực hiện Nếu có nghi ngờ từ một trong ba phương pháp này, bác sĩ lâm sàng có thể chỉ định sinh thiết kim, sinh thiết tức thì hoặc sinh thiết mở thường quy để xác nhận chẩn đoán.

Các xét nghiệm đánh giá chung và đánh giá tình trạng di căn xa: xét nghiệm máu, sinh hoá, siêu âm, X-quang…

Các phương pháp phát hiện ung thư truyền thống thường chỉ nhận diện được các khối u đã phát triển, dẫn đến kết quả không kịp thời và gây khó khăn về mặt tâm lý cho bệnh nhân Những phương pháp này không phù hợp cho việc tầm soát ung thư định kỳ do gây đau đớn và có thể kích thích di căn Để khắc phục vấn đề này, việc nghiên cứu và phát triển các chỉ điểm sinh học (bio-markers) liên quan đến sự phát sinh và phát triển của ung thư là rất cần thiết Các chỉ điểm sinh học lý tưởng cần dễ lấy mẫu, đo chính xác, nhạy cảm cao và chi phí thấp, nhằm nâng cao hiệu quả trong phòng chống, phát hiện và điều trị ung thư Nghiên cứu về các chỉ điểm sinh học đã được triển khai mạnh mẽ trên toàn thế giới.

Chỉ điểm sinh học ung thư và microRNA

Chỉ điểm sinh học ( bio-maker) – chỉ điểm sinh học ung thư

1.2.1.1.Chỉ điểm sinh học ( bio-maker)

Dấu ấn sinh học, hay còn gọi là bio-marker, là những phân tử phản ánh các dữ kiện sinh học Chúng có thể là các hóa chất đơn giản, ví dụ như glucose, được xem là một loại dấu ấn sinh học quan trọng.

SVTH: Trần Thị Bích Ngọc – Lớp: 10SH Các dấu ấn của bệnh tiểu đường có thể bao gồm phân tử protein như kháng thể, phản ánh tình trạng nhiễm trùng, trong khi gene hoặc DNA marker đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các bệnh di truyền.

Biomarker, hay còn gọi là “chữ ký” sinh học, được các nhà nghiên cứu tin tưởng rằng chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý Việc truy tìm chữ ký sinh học có thể mang lại những kết quả ứng dụng hiệu quả trong y học, bao gồm chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp như ung thư, tiểu đường, bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, cũng như các bệnh miễn dịch, di truyền, nhiễm trùng và bệnh do yếu tố môi trường Ngoài ra, biomarker còn hứa hẹn trong việc đo lường hiệu ứng của thuốc.

1.2.1.2 Chỉ điểm sinh học của ung thư

Như đã nói ở trên, thì một trong những ứng dụng của bio-maker là sử dụng để phát hiện và chẩn đoán các loại bệnh ung thư.

Chất chỉ điểm sinh học ung thư là các chất xuất hiện và có nồng độ thay đổi trong cơ thể khi có sự hiện diện của tế bào ung thư Chúng bao gồm các phân tử protein, acid nucleic, hormone, enzyme và một số tế bào đặc biệt khác.

Dựa vào những thành tựu của kĩ thuật miễn dịch ghi dấu, người ta chia chất chỉ điểm sinh học ung thư thành 2 loại : [45]

Chỉ điểm tế bào là các kháng nguyên tập trung trên bề mặt màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như bệnh Leucemi và ung thư vú, liên quan đến nội tiết tố và cơ quan thụ cảm nội tiết.

Chỉ điểm dịch thể là các chất được tìm thấy với nồng độ cao trong huyết thanh, nước tiểu hoặc các dịch khác của cơ thể Những chất này được sản xuất và bài tiết từ các mô của khối u, chúng có thể được giải phóng thông qua quá trình phân hủy tế bào khối u hoặc là do phản ứng của cơ thể đối với sự hiện diện của khối u.

Tiêu chuẩn của các chất làm chỉ điểm ung thư [44] :

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xix

Khác với các phân tử được sản xuất từ các tổ chức lành tính bình thường, các phân tử này cần phải có tính đặc hiệu của tổ chức tế bào ung thư.

- Có tính đặc hiệu với cơ quan tổng hợp ra- cơ quan bị ung thư;

- Được giải phóng từ các tế bào khối u vào các dịch thể dễ thu nhận, như huyết thanh, nước tiểu,…

- Nồng độ các chất đó phản ánh được tình trạng và tiến triển của bệnh, của khối u

( kích thước, sự phát triển, có hay không di căn, kết quả điểu trị );

- Phát hiện được ngay cả khi có nồng độ rất thấp, có khả năng chẩn đoán, phát hiện sớm ung thư;

- Có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

Một số chất chỉ điểm sinh học tương ứng với từng loại ung thư ( Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thống kê một số chỉ điểm sinh học đối với mỗi loại ung thư [46]

STT Loại ung thư Chất chỉ điểm ung thư

1 Ung thư vú CA 15-3, CEA, MCA, CA549, TPA

2 Ung thư buồng trứng CA 125, CA 72 -4, CEA, AFP, hCG

3 Ung thư tử cung CEA, SCCA

4 Ung thư tuyến tiền liệt PSA, FPSA, PSA /FPSA, PAP, TPA

5 Ung thư tinh hoàn AFP, NSE, βHCG

6 Ung thư đại tràng – trực tràng CEA, CA 19-9

7 Ung thư tụy CEA, CA 19-9, CA 72-4

8 Ung thư gan AFP, CEA

9 Ung thư dạ dày CA 72-4, CEA, AFP, CA 19-9

10 Ung thư thực quản CEA, Cyfra 21-1

11 Ung thư tuyến giáp CEA, NSE

12 Ung thư bàng quang TPA, CEA, Cyfra 21-1

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xx

13 Ung thư phổi CEA, NSE, SCC, TPA, Cyfra 21-1

CA 15-3 là chất chỉ điểm đặc hiệu cho ung thư vú, có độ đặc hiệu là 98% và độ nhạy là 30% [46] Và PSA là kháng nguyên đặc hiệu cho ung thư tuyến tiền liệt, có độ đặc hiệu 91% và độ nhạy 21% [60] Từ 2 chất chỉ điểm đặc hiệu cho 2 loại ung thư, thấy rằng, tuy là chúng có độ đặc hiệu rất cao, đặc trưng cho từng loại ung thư riêng biệt, tuy nhiên, độ nhạy của chúng rất thấp Cho nên, cần tìm các loại chỉ điểm sinh học có độ nhạy cao hơn với độ đặc hiệu tương đương.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các phân tử microRNA (miRNA) trong cơ thể người đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị ung thư, khiến chúng trở thành các chỉ điểm sinh học hữu ích trong việc phát hiện và chẩn đoán bệnh này.

Tổng quan về microRNA

MicroRNA (miRNA) là các phân tử RNA không mã hóa nhỏ, dài từ 20 đến 25 nucleotide, có khả năng điều chỉnh sự biểu hiện gene sau phiên mã Chúng hoạt động bằng cách gắn vào vùng 3’ không dịch mã (3’-UTR) của RNA thông tin (mRNA) để điều phối quá trình này.

1.2.2.2 Cơ chế hình thành miRNA

Trong tế bào, miRNA được phiên mã từ gene miRNA bởi enzyme RNA polymerase II, tạo ra các phân tử RNA dạng “thân-vòng” (pri-miRNA) dài khoảng 80 nucleotide Pri-miRNA sau đó được xử lý bởi các enzyme RNase III như Drosha và DGCR8/Pasha để cắt cấu trúc “thân-vòng”, tạo ra pre-miRNA Các pre-miRNA được vận chuyển ra tế bào chất nhờ protein Exportin-5 Tại tế bào chất, enzyme Dicer tiếp tục cắt pre-miRNA để tạo ra các microRNA “trưởng thành” dưới dạng RNA sợi đôi ngắn, sau đó các đoạn RNA này sẽ được giải xoắn.

SVTH: Tran Thi Bich Ngoc – Class: 10SH Page xxi discusses the role of the enzyme helicase in the formation of single-stranded RNA, which subsequently integrates into the RNA-induced silencing complex (RISC) that mediates gene suppression.

Hình 1.4 : Cơ chế hình thành miRNA [2,3].

1.2.2.3 Chức năng và vai trò của miRNA trong cơ thể

Kể từ khi được phát hiện vào năm 1993, miRNA đã trở thành yếu tố quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, bao gồm phát triển, tạo phôi, chuyên biệt tế bào và hình thành cơ quan, cũng như điều khiển sự phát triển và chết tế bào MiRNA có khả năng điều tiết sự phân giải mRNA thông qua phức hợp RISC, và khi có sự bổ sung hoàn toàn, quá trình này được gọi là RNAi.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xxii

Trong trường hợp bổ sung không hoàn toàn với 3'UTR của mRNA, sự chuyển hoán sẽ bị tiết giảm và bị chậm bớt [47].

Một loại phân tử miRNA có khả năng ức chế sự biểu hiện của hàng chục gene khác nhau, và trong cơ thể sinh vật có thể tồn tại hàng trăm loại miRNA Các miRNA này có thể tác động lên gần 200 phiên bản RNA và nhiều miRNA có khả năng điều tiết một gene mã hóa protein.

Hình 1.5 : Cơ chế tác động của miRNA[48].

Gần 70% miRNA liên quan đến việc điều tiết quá trình tạo mRNAs và các RNA không sinh tổng hợp protein, trong khi phần còn lại được phát sinh độc lập Các chuyên gia ước tính rằng hơn 50% gene mã hóa protein ở người đang bị kiểm soát bởi miRNA.

1.2.2.4 Tác động của miR N A lên ung thư nói chung miRNA được chứng minh là một trong các yếu tố đóng vai trò bản lề trong quá trình tạo thành ung thư[9].

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng miRNA đóng vai trò quan trọng trong mọi giai đoạn của ung thư, bao gồm sự phát triển của khối u, quá trình tự chết của tế bào (apoptosis), cũng như khả năng xâm lấn và di căn.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xxiii quá trình kháng thuốc của tế bào ung thư MiRNA có thể đóng vai trò như là các gen

Các miRNA có thể hoạt động như các gen gây ung thư (oncogene) hoặc như các gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự rối loạn trong hoạt động của từng nhóm miRNA có mối liên hệ chặt chẽ với các loại ung thư cụ thể.

Nghiên cứu di truyền cho thấy việc xóa bỏ hoặc ức chế cụm gene miRNA như miR-15a và miR-16-1 có liên quan đến ung thư bạch cầu lympho Sự ức chế của miRNA let-7 cũng dẫn đến ung thư phổi và ung thư vú, trong khi miR-34a-b-c bị ức chế trong ung thư tụy, ruột và vú Ngược lại, cụm miR-17~92 được kích thích trong các loại ung thư như tuyến lympho, vú, phổi, ruột, dạ dày và tuyến tụy.

MiRNA có tiềm năng lớn để làm loại chất chỉ điểm ung thư lý tưởng vì những lý do sau đây :

- Biểu hiện của các miRNA được chứng minh là bất thường trong bệnh ung thư

- Biểu hiện của nhiều miRNA được chứng minh gắn liền với bệnh lý, hoặc đặc hiệu với mô và cơ quan nhất định [18].

- miRNA là các phân tử khá ổn định, đã được chứng minh để được bảo quản tốt trong formalin, mô nhúng paraffin cũng như mẫu bệnh phẩm đông lạnh [16,19].

Vì vậy, miRNA được xem là một hướng đi mới trong nghiên cứu chẩn đoán và điều trị ung thư.

1.2.2.5 Đặc tính miRNA trong hệ thống máu

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các miRNA liên quan đến ung thư có thể được phát hiện trong huyết tương hoặc huyết thanh, giúp phân biệt rõ ràng giữa bệnh nhân ung thư và người khỏe mạnh Nghiên cứu đầu tiên trong lĩnh vực này được thực hiện vào năm 2008, tập trung vào việc so sánh sự biểu hiện của các miRNA lưu chuyển.

Trần Thị Bích Ngọc, học sinh lớp 10SH, đã nghiên cứu về bệnh nhân ung thư bạch huyết (lymphoma) và mẫu đối chứng, cho thấy ung thư ảnh hưởng đến mức độ các miRNA trong huyết thanh.

Một số tính chất của miRNA lưu thông trong hệ thống máu ( trong huyết tương và huyết thanh): [16,17]

- Có thể được xác định rõ ràng, và giúp phân định chính xác giữ bệnh nhân ung thư và khỏe mạnh;

- miRNA có độ bền rất tốt so với các phân tử mRNA ở trong mẫu máu hay các mẫu sinh thiết tế bào;

Hoạt tính của các mẫu huyết thanh và huyết tương không bị ảnh hưởng đáng kể khi trải qua quá trình đông đá, tan, đun sôi, hoặc khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Các mẫu phẩm máu dễ dàng thu nhận, cho thấy rằng miRNA trong hệ thống máu có tiềm năng trở thành các phân tử chỉ thị sinh học lý tưởng cho nghiên cứu và điều trị ung thư.

Giới thiệu một số miRNA dùng trong chẩn đoán ung thư vú

Nghiên cứu cho thấy nồng độ miRNA trong hệ thống máu có sự khác biệt giữa bệnh nhân ung thư vú và người khỏe mạnh, với mức độ biểu hiện của các miRNA tăng cao trong mẫu bệnh giảm sau phẫu thuật Các miRNA trong huyết thanh có tiềm năng trong chẩn đoán và điều trị ung thư vú, tuy nhiên vẫn chưa xác định được miRNA nào là đại diện tốt nhất cho bệnh này Câu hỏi về nguồn gốc và chức năng của miRNA ở nồng độ cao trong huyết thanh bệnh nhân ung thư vú vẫn chưa được làm rõ Thêm vào đó, các nghiên cứu hiện tại còn hạn chế về số lượng mẫu và phương pháp nghiên cứu.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang xxv

Nghiên cứu về miR-34a cho thấy không có sự khác biệt về lượng miR-34a giữa bệnh nhân ung thư vú giai đoạn M0 và người khỏe mạnh Tuy nhiên, ở bệnh nhân giai đoạn M1, lượng miR-34a cao hơn khoảng 4,5 lần so với nhóm đối chứng là người khỏe mạnh Đối tượng nghiên cứu bao gồm khối u và huyết thanh của bệnh nhân ung thư vú ở cả giai đoạn chưa và đã di căn.

MiR-122 có mức độ lưu thông cao và được dự đoán là chỉ số tái phát di căn ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn II-III, dựa trên việc sử dụng huyết thanh của người bệnh trong giai đoạn này.

Mức độ miR-29a (P = 0,86) không có sự khác biệt giữa các giai đoạn, tuy nhiên, ở từng giai đoạn khối u lại cho thấy sự khác biệt đáng kể khi so sánh với các mẫu đối chứng, bao gồm huyết thanh của bệnh nhân trước phẫu thuật và mẫu kiểm chứng.

Nghiên cứu cho thấy rằng miR-411 và miR-299-5p có mức biểu hiện thấp hơn trong huyết thanh của bệnh nhân so với người khỏe mạnh Đặc biệt, ở nhóm bệnh nhân đã di căn, lượng miRNA này giảm, nhưng có sự tăng trở lại sau khi điều trị.

Nồng độ let-7a trong máu có sự tăng nhẹ qua các giai đoạn bệnh, nhưng tăng rõ rệt gấp 11,20 lần so với nhóm khỏe mạnh Sau phẫu thuật, nồng độ này có xu hướng giảm Nghiên cứu được thực hiện trên mô và mẫu bệnh nhân ở cả 4 giai đoạn, trước và sau phẫu thuật.

Nồng độ miR-10b trong huyết thanh cao hơn đáng kể ở bệnh nhân có di căn xương so với những người không có di căn xương và nhóm khỏe mạnh.

MiR-195, giống như let-7a, có nồng độ tăng nhẹ qua các giai đoạn và tăng rõ rệt so với nhóm khỏe mạnh (19,25 lần, P