Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới. Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành công cao. PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
- Kháng thể đặc hiệu kháng PSA [Sigma- Aldrich, Mỹ]
- Hạt nano sắt từ đã bọc SiO2 được chế tạo tại trường Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, đường kính 10nm
- 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES), 99.8% [Sigma- Aldrich, Mỹ]
- Glutaraldehyde (GA) 25%, [Sigma- Aldrich, Mỹ]
The "Human PSA (Total) ELISA Kit" from Sigma-Aldrich includes essential components for accurate testing, such as wells coated with a specific primary antibody for PSA, wash buffer, Diluent A and B, Streptavidin-HRP, a biotinylated secondary antibody for PSA, stop solution, PSA antigen, and TMB substrate.
- Chất chuẩn: Bradford, Bovine Serum Albumin (BSA) [Merck, Đức]
- Một số hoá chất thông dụng khác như: Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, HCl, NaOH, ethanol 99% [XL, Trung Quốc]
Dụng cụ: eppendorf, ống fancol, micropipette, đầu côn, cuvet, cốc thuỷ tinh, ống đong, bình thuỷ tinh đựng hoá chất, đũa thuỷ tinh, …
- Máy đo pH metter TOLEDO MP 220 dùng để xác định pH của đệm
- Máy đo mật độ quang: Bio-Rad Smartspec Plus sử dụng cuvet nhựa đặc trưng riêng cho máy
- Máy Voxter để phân tán đều mẫu
- Máy ly tâm MIKRO 200 24 lỗ
- Một số thiết bị khác: cân kỹ thuật, cân phân tích, bếp điện, …
- Máy siêu âm đồng nhất mẫu
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 16
Phương pháp thí nghiệm
2.2.1 Cơ sở của phương pháp gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ bằng APTES- GA Để có thể liên kết với các phân tử sinh học cần quan tâm lên hạt nano sắt từ, cụ thể trong đề tài này là kháng thể kháng kháng nguyên PSA, cần có một liên kết chặt chẽ, bền vững, như liên kết cộng hóa trị Với mục tiêu này, bề mặt hạt nano sắt từ được amin hóa bằng 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) sau đó xử lý bằng Glutaraldehyde (GA) tạo nhóm aldehyde (-CHO) trên bề mặt hạt nhằm tạo liên kết chặt chẽ với kháng thể (Hình 2.1)
Hình 2.1: Cơ sở của phương pháp cố định kháng thể lên MNPs thông qua hoạt hóa bề mặt bằng APTES – GA
2.2.2 Hoạt hóa bề mặt hạt nano bằng APTES- GA
Chuẩn bị hạt sắt từ: Đo nồng độ hạt sắt bằng phương pháp dựa trên nguyên tắc xác định độ ẩm của mẫu
- Chuẩn bị một đĩa Petri sấy khô cho đến khối lượng không đổi m1
- Hút 1ml hạt sắt từ cho vào đĩa, sấy khô cho đến khối lượng không đổi m2
- Từ m1 và m2 suy ra khối lượng hạt sắt tính trên 1ml dung dịch sẽ là m2 – m1
- Sau khi tớnh toỏn thu được nồng độ hạt sắt ban đầu là 24àg/ àl
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 17
Sau khi đã xác định khối lượng hạt sắt từ, em tiến hành bước hoạt hóa bề mặt hạt bằng APTES và GA theo quy trình như sau:
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs bằng APTES- GA
- Hỳt 12àl MNPs (24 àg/ àl) hũa vào 388 àl nước cất, để đạt được nồng độ 7àg/ àl
- Rửa 2 lần với 400 àl cồn 50 0 Sau đú tỏi huyền phự vào 396 àl cồn 50 0 , siờu õm
- Sau khi li tõm, bổ sung 4 àl APTES 99.8%, lắc 5 giờ ở 50 0 C Rửa 1 lần với cồn
50 0 , 2 lần với đệm PBS pH= 7.4 Loại bỏ dịch rửa
L1: 400àl cồn 50 0 / 1lần L2,3: 400àl PBS 7.4/ lần Rửa 3 lần
12àl hạt Fe3O4.SiO2 24 àg/ àl
L1: nước cất 400àl/lần L2+L3: cồn 400àl/lần
Vortex Rửa 3 lần với PBS, 7.4
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 18
- Tỏi huyền phự với 400 àl GA 5%, ủ 1 giờ và tiến hành lắc nhẹ Rửa 3 lần với đệm PBS pH=7.4
- Bảo quản trong đệm PBS pH=7.4 ở 4 0 C cho đến khi sử dụng a Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo bằng phương pháp UV- VIS
Chuẩn bị dãy nồng độ Streptavidin 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml để xây dựng đường chuẩn Streptavidin và giá trị OD ở bước sóng 280nm
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm chuẩn bị mẫu đo UV- VIS
- MNPs đã được hoạt hóa bề mặt được bổ sung Streptavidin 0,1mg/ml, lắc 3h, sau đó thu dịch
- Tái huyền phù trong đệm PBS chứa Tris – HCl, NaCNBH3, lắc 1 giờ ở nhiệt độ phòng
- Rửa 3 lần với đệm PBST (đệm PBS + 0.05% Tween 20) có li tâm 6,000 vòng/ phút trong 5 phút Thu dịch rửa sau mỗi lần rửa [7]
400 àl MNPs được hoạt húa bề mặt
Li tâm 6000v/p, 5p Thu dịch (1) Rửa 3 lần với PBS
400 àl Streptavidin nồng độ 0.1 mg/ml
Li tâm 6000v/p, 5p, 4 0 C Bảo quản trong 400 àl PBS
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 19
Đo nồng độ Streptavidin gắn vào hạt nano bằng UV- VIS ở bước sóng 280nm
Tiến hành đo nồng độ Streptavidin lần lượt như sau:
- Đo Streptavidin gốc nồng độ 0.1mg/ml
- Đo Streptavidin trong dịch hút và dịch rửa bằng phương pháp UV- VIS ở OD280nm
Bằng cách phân tích độ chênh lệch giữa lượng Streptavidin gốc và tổng lượng Streptavidin trong dịch hút và dịch rửa, ta có thể xác định lượng Streptavidin đã gắn lên hạt nano sắt từ Thêm vào đó, thử nghiệm gắn Streptavidin-HRP được thực hiện qua phản ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất TMB.
- MNPs sau khi đã được hoạt hóa được bổ sung Streptavidin- HRP, lắc trong 3h ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ dịch hút
- Tái huyền phù trong đệm PBS chứa Tris – HCl, lắc 1 giờ ở nhiệt độ phòng
- Rửa 3 lần với đệm PBST (đệm PBS + 0.05% Tween 20), li tâm 6,000 vòng/ phút trong 5 phút
- Chuẩn bị mẫu đối chứng bằng cách đun nóng MNPs đã được gắn Streptavidin- HRP ở 100 0 C trong 5 phút nhằm bất hoạt enzyme HRP
- Hỳt 50 àl mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm (3 mẫu) vào mỗi giếng
- Bổ sung 50 àl TMB, ủ trong 30 phỳt ở nhiệt độ phũng trong búng tối
- Thờm 25 àl Stop solution vào mỗi giếng để dừng phản ứng, đo OD450 nm
2.2.3 Thử nghiệm gắn kháng thể lên MNPs a Khảo sát khả năng gắn kháng thể lên MNPs
Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu theo tỷ lệ như sau:
Sau khi được hoạt hóa, các MNPs sẽ được ủ với kháng thể kháng PSA đã được biotin hóa với nồng độ 80X trong vòng 3 giờ Quá trình này diễn ra ở nhiệt độ phòng và cần lắc nhẹ theo tỷ lệ đã quy định.
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 20
- Rửa 3 lần với đệm Wash Solution Tái huyền phù trong Wash Solution Sẵn sàng sử dụng
Hình 2.4: Phương pháp khảo sát khả năng gắn kháng thể lên MNPs,
1 Kháng thể kháng kháng nguyên PSA, 2 Biotin, 3 Liên kết giữa Streptavidin, 4 Hạt nano sắt từ
- Cho 50 àl MNPs cú gắn khỏng thể đó được biotin húa với cỏc nồng độ MNPs khỏc nhau vào mỗi giếng
- Loại bỏ dịch sau đú tỏi huyền phự bằng 50 àl Streptavidin - HRP ở mỗi giếng Ủ
45 phút ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ
- Rửa 4 lần với wash solution, mỗi lần rửa với 300àl, để yờn trong 3 phỳt
- Loại bỏ dịch rửa, thờm 50 àl TMB, ủ trong 30 phỳt ở nhiệt độ phũng trong búng tối
Cho 50 µl dung dịch Stop vào mỗi giếng để ngừng phản ứng và đo OD tại 450nm Khảo sát khả năng gắn kết của kháng thể cố định với kháng nguyên dựa trên phản ứng màu giữa enzyme HRP và TMB.
- Chuẩn bị giếng đã phủ kháng thể thứ nhất (trong bộ kit elisa)
- Thờm 50 àl khỏng nguyờn với cỏc nồng độ 2, 4, 6 ng/ ml, ủ 2.5 giờ ở nhiệt độ phòng, có lắc nhẹ
- Loại bỏ cỏc phần khụng liờn kết bằng cỏch rửa 4 lần với 1X wash buffer (300 àl), để yên 3 phút trong mỗi lần rửa
Stop solution TMB Đo OD 450nm
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 21
- Thờm 50 àl MNPs (135 àg) đó được gắn khỏng thể vào mỗi giếng, ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Tiến hành lặp lại bước rửa
- Thờm 50àl Streptavidin – HRP vào mỗi giếng, ủ 45 phỳt ở nhiệt độ phũng cú lắc nhẹ Lặp lại bước rửa, loại bỏ dịch huyền phù
- Thờm 50 àl TMB, ủ trong 30 phỳt ở nhiệt độ phũng trong búng tối Thờm 25 àl Stop solution vào mỗi giếng, đo OD 450 nm(Hình 2.5)
Hình 2.5: Hình minh họa phương pháp xác định hoạt tính kháng thể sau khi cố định lên MNPs
2.2.4 Khảo sát nồng độ tối ưu của kháng thể
Chuẩn bị các dãy ống eppendoff, đánh dấu từ nồng độ 0, 160X, 80X, 40X theo trình tự như sau:
Dãy 1: Pha loãng nồng độ kháng thể gốc thành 0, 160X, 80X, 40X
Dãy 2,3: Gắn kháng thể với các nồng độ trên lên MNPs theo quy trình sau:
Mỗi ống chứa 135µg hạt nano được hoạt hóa bề mặt bằng APTES-GA Sau đó, bổ sung kháng thể biotin hóa với các nồng độ đã chỉ định vào MNPs, lắc trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng và rửa lại 3 lần bằng dung dịch rửa có li tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút.
5 phút) a Khảo sát khả năng bắt giữ kháng nguyên của kháng thể tự do
Sử dụng kháng thể ở dãy 1 và dãy 2 để tiến hành quy trình sau đây:
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 22
- Cho 50àl khỏng nguyờn nồng độ 4ng/ml vào cỏc giếng đó được phủ khỏng thể kháng kháng nguyên PSA thứ nhất, ủ trong 2.5 giờ, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng
- Rửa 4 lần với 300àl wash solution
Loại bỏ dịch rửa và cho vào mỗi giếng 50µl với nồng độ khác nhau (0, 160X, 80X, 40X), đảm bảo không thể tự do và không thể cố định Sau đó, ủ trong 1 giờ và lặp lại bước rửa.
- Bổ sung 50àl Streptavidin- HRP, ủ trong 45 phỳt Lặp lại bước rửa
- Bổ sung 50àl cơ chất TMB, ủ 30 phỳt ở điều kiện tối
- Sau khi phản ứng, cho 50àl stop solution vào để dừng phản ứng
- Tiến hành đo OD ở bước sóng 450nm (Hình 2.5) b Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs và hoạt tính của chúng
Tiến hành đo lượng kháng thể được gắn lên hạt nano sắt từ ở dãy 3 bằng phương pháp dựa trên sự thay đổi màu của TMB nhờ enzyme HRP:
- Hỳt 50àl MNPs- khỏng thể vào mỗi giếng, sử dụng nam chõm để hỳt dịch
Tỏi huyền phực được xử lý bằng 50μl Streptavidin-HRP và ủ trong 45 phút Sau đó, rửa sạch 3 lần với dung dịch rửa, sử dụng nam châm để giữ hạt sắt và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
- Bổ sung 50àl cơ chất TMB vào ủ 30 phỳt, sau đú cho 50àl stop solution vào để dừng phản ứng Đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 450nm
2.2.5 Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs dựa vào khả năng “bắt chước” enzyme peroxydase của MNPs a Khảo sát khả năng “bắt chước” enzyme peroxydase của MNPs
- Chuẩn bị cỏc ống eppendoff cú 50 àl MNPs với cỏc nồng độ khỏc nhau 0, 10, 20,
- Thờm 40 àl TMB và 10 àl H2O2 vào mỗi giếng Ủ ở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt ở điều kiện không có ánh sáng
Cho 20 àl Stop solution vào mỗi giếng để ngừng phản ứng và đo OD tại 450 nm Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs dựa vào khả năng "bắt chước" enzyme peroxydase của MNPs.
- Chuẩn bị giếng đã phủ kháng thể kháng PSA thứ nhất
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 23
- Thờm 50 àl khỏng nguyờn nồng độ 4ng/ml vào mỗi giếng Ủ trong 2,5 giờ ở nhiệt độ phòng với điều kiện lắc nhẹ
- Loại bỏ cỏc phần khụng liờn kết bằng cỏch rửa 4 lần với wash solution (300 àl)
- Thờm 50 àl MNPs cú gắn khỏng thể đó được biotin húa cú nồng độc khỏc nhau 0, 320X, 160X, 80X, 40X vào mỗi giếng, ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng
- Lặp lại bước rửa, loại dịch huyền phự sau đú thờm 40 àl TMB và 10 àl H2O2 vào mỗi giếng Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trong tối, lắc nhẹ
- Thờm 50 àl Stop solution vào mỗi giếng, đo OD450 nm
SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 24
