NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ NẢY MẦM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY BÌM EBERHARDT

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ NẢY MẦM CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY BÌM EBERHARDT (MERREMIA EBERHARDTII).Cây Bìm eberhardt thuộc họ Bìm bìm, là loài cây dây leo điển hình được tìm thấy ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Á.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Mẫu lá cây Bìm eberhardt được thu thập từ khu rừng phía nam chân đèo Hải Vân, thuộc xã Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng Sau khi lấy mẫu, lá được rửa sạch, phơi khô và sau đó xay nghiền thành bột.

 Hóa chất tinh khiết gồm có: Ethanol, vitamin C, môi trường thạch thịt – pepton; α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH), …

Các dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm bao gồm: pipet các loại, micropipette, lọ penicillin, ống nghiệm, bình tam giác, bình định mức, cốc thủy tinh và phễu lọc.

Tại phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, các thiết bị như máy siêu âm, máy lắc khô, tủ cấy, tủ ấm và máy đo UV-VIS được sử dụng để phục vụ cho nghiên cứu và thực hành trong lĩnh vực sinh học.

Phương pháp

Quá trình chiết nhằm thu nhận các hợp chất phân cực để đánh giá khả năng ức chế nảy mầm, tính kháng khuẩn và chống oxy hóa Hệ dung môi hiệu quả cho việc này là ethanol - nước Để xác định loại dung môi chiết tách phù hợp nhất, tôi đã tiến hành chia thành 4 mẫu thí nghiệm.

Mẫu 1: Cho 250 ml nước cất vào bình tam giác có chứa 50 g bột lá cây Bìm eberhardt Sau đó tiến hành thí nghiệm theo hình 2.1

Mẫu 2: Làm tương tự mẫu 1, nhưng thay nước cất bằng dung môi ethanol 50% Mẫu 3: Dùng dung môi ethanol 80%

Mẫu 4: Dùng dung môi ethanol 90%

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 20

Hình 2.1 Quy trình chiết thu cao

2.2.1.2 Chiết thu dịch Để khảo sát phương pháp chiết tốt nhất, đồng thời xem xét khả năng ức chế nảy mầm của dịch chiết cây Bìm eberhardt từ bộ phận nào là tốt nhất Tôi tiến hành chiết mẫu rễ, thân, lá cây Bìm eberhardt sử dụng 2 phương pháp chiết siêu âm, chiết sử dụng nhiệt để thu dịch

Mẫu rễ, thân và lá được thu thập tại nam đèo Hải Vân vào buổi sáng sớm để tránh các điều kiện bất lợi Sau khi thu thập, mẫu được mang về phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, rửa sạch, để ráo và xay thành bột tươi Quy trình chiết siêu âm sẽ được thực hiện tiếp theo.

Quy trình chiết siêu âm tại phòng thí nghiệm bắt đầu bằng việc cân 50 g mẫu rễ, thân và lá đã qua xử lý, sau đó cho vào ba bình tam giác khác nhau Tiếp theo, 250 ml nước cất được thêm vào mỗi bình và đặt vào máy lắc để tiến hành chiết xuất.

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 21 mô tả quy trình xử lý mẫu khô ở điều kiện tE 0°C và v 0 v/p trong 4 giờ Sau khi lắc hỗn hợp, mẫu được siêu âm ở mức độ 5 trong 5 phút, chia nhỏ vào các bình 100ml Cuối cùng, hỗn hợp được lọc để thu dịch.

Hình 2.2 Quy trình chiết thu dich sử dụng phương pháp siêu âm

Hình 2.3 Quy trình chiết thu dịch sử dụng nhiệt

50 g bột tươi + 250 ml nước cất

50 g bột tươi+ 250 ml nước cất

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 22

Quy trình chiết siêu âm tại phòng thí nghiệm bắt đầu bằng việc cân 50 g mẫu rễ, thân, lá đã qua xử lý, sau đó cho vào ba bình tam giác khác nhau Tiếp theo, thêm 250 ml nước cất vào mỗi bình và đun sôi trong 30 phút Cuối cùng, tiến hành lọc để thu được dịch chiết.

2.2.2 Thí nghiệm khảo sát ức chế nảy mầm a Mục đích

- Đánh giá khả năng ức chế nảy mầm của cao chiết nước cất, cao chiết bằng ethanol 50% lên hạt cải mầm

- Đánh giá khả năng ức chế nảy mầm của cây Bìm eberhardt từ bộ phận nào là tốt nhất b Nguyên tắc

Dựa vào số hạt nảy mầm trên tổng số hạt thí nghiệm để đánh giá b Cách tiến hành

 Khảo sát khả năng ức chế nảy mầm của cao chiết trên hạt cải mầm được tiến hành như sau:

- Hạt cải được ngâm bằng nước ấm trong vòng một ngày

- Dùng giấy lọc lót dưới đĩa petri

- Chọn 20 hạt cải cho vào mỗi đĩa petri

- Pha loãng mẫu cao chiết với nồng độ 20 mg/ml

- Hút 5 ml dịch chiết cho vào đĩa petri Làm tương tự với mẫu đối chứng chỉ thay dịch chiết bằng 5 ml nước cất

- Đưa mẫu vào trong tối và tiến hành quan sát lấy kết quả sau 2 ngày

Mỗi mẫu tiến hành trên 5 đĩa petri để so sánh

* Tương tự ta lặp lại thí nghiệm trên tại nồng độ cao chiết 10 mg/ml, 5 mg/ml

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 23

Khảo sát khả năng ức chế nảy mầm của dịch chiết cây Bìm eberhardt trên hạt cải mầm được thực hiện bằng cách sử dụng dịch chiết với nồng độ 1 ml dịch/4 ml nước cất, thay vì mẫu cao chiết.

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Khảo sát tính chống oxy hóa của cao chiết cây Bìm eberhardt bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH ● a Mục đích

Nghiên cứu đã khẳng định sự hiện diện của các chất chống oxy hóa trong cây Bìm eberhardt, đồng thời đánh giá mức độ hoạt tính của các chất này trong các mẫu khác nhau.

Phương pháp DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng kháng oxy hóa DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và có bước sóng hấp thu cực đại tại 517nm Các chất kháng oxy hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH bằng cách cung cấp hydrogen, dẫn đến sự giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại, làm cho màu dung dịch chuyển từ tím sang vàng.

- Cân 2 mg cao + 5 ml nước cất, lắc hòa tan mẫu Nồng độ mẫu lúc này là

- Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần

- Cân 2 mg vitamin C + 5 ml nước cất, lắc hòa tan mẫu Nồng độ mẫu lúc này là 400 l/ml

- Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần

- Cân 2,4 mg DPPH cho vào bình định mức 100 ml (0,06 mM)

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 24

- Thêm ethanol vào rồi lắc cho hòa tan hết, tiếp tục thêm ethanol cho đủ 100 ml

- Hỳt 2àl nước cất + 5 ml nước cất

- Cân 2 mg cao + 5 ml ethanol 90%, lắc hòa tan mẫu Nồng độ mẫu lúc này là

- Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần

- Cân 2 mg vitamin C + 5 ml ethanol 90%, lắc hòa tan mẫu Nồng độ mẫu lúc này là 400 l/ml

- Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần

- Cân 2,4 mg DPPH cho vào bình định mức 100 ml (0,06 mM)

- Thêm ethanol vào rồi lắc cho hòa tan hết, tiếp tục thêm ethanol cho đủ 100 ml

- Hỳt 2 àl nước cất + 5 ml ethanol 90%

Để tiến hành thí nghiệm, chuẩn bị 1,5 ml mẫu cần thử và 1,5 ml dung dịch DPPH Trộn đều hỗn hợp và để yên trong tối thiểu 30 phút Cuối cùng, đo absorbance tại bước sóng 517 nm để thu được giá trị A.

 Mẫu control: 1,5 ml mẫu trắng + 1,5 ml DPPH Rồi làm tương tự như trên, thu được giá trị A0

Trong đó: o A o : Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control)

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 25 o A: Giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu thử (sample)

Khả năng ức chế gốc tự do được đánh giá bằng phương pháp gốc tự do bền DPPH

2.2.4 Khảo sát tính kháng khuẩn với vi khuẩn Bacillus subtilis

Nghiên cứu tính kháng khuẩn của cao chiết cây Bìm eberhardt được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch đối với vi khuẩn Bacillus subtilis Mục đích của nghiên cứu là để đánh giá khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Bacillus subtilis của các loại cao chiết khác nhau Nguyên tắc của phương pháp này là xác định hiệu quả kháng khuẩn thông qua việc đo đường kính vùng ức chế xung quanh đĩa cao chiết.

Dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn tạo ra khi cho dịch chiết vào môi trường chứa vi khuẩn Bacillus subtilis c Cách tiến hành

Thao tác nuôi vi sinh vật được thực hiện theo trình tự sau:

1 Khử trùng dụng cụ và môi trường: sử dụng phương pháp hấp bằng hơi nước bão hoà dưới áp suất ở nhiệt độ 121 0 C

- Chuẩn bị dụng cụ khử trùng

- Trước khi khử trùng dụng cụ cần phải làm nút bông bao gói thích hợp

- Hấp khử trùng dụng cụ

2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Sử dụng hai loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn, bao gồm môi trường cao thịt – pepton và cao thạch thịt – pepton, để cung cấp chất dinh dưỡng tối ưu cho hầu hết các loại vi khuẩn.

- Để điều chỉnh pH, dùng HCl hoặc NaOH có nồng độ 0,01M

- Phân phối vào dụng cụ chứa

SVTH: Đậu Thị Ngọc Ngà_10SH Trang 26

3 Chuẩn bị dịch huyền phù vi sinh vật

Đầu tiên, nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng ở nhiệt độ 37°C trong 18 tiếng Tiếp theo, cấy mẫu ra đĩa thạch và sau 2 ngày, sẽ quan sát thấy nhiều khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt thạch Sau đó, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc và pha loãng trong 10 ml nước cất, tiếp tục pha loãng đến tỷ lệ 10^-3.

4 Tiến hành gieo cấy trên thạch hộp.

Sử dụng phương pháp khuyếch tán đĩa, đầu tiên, dùng micropipét vô khuẩn hút 100 l canh khuẩn từ ống có độ pha loãng 10^-3 và cho vào đĩa petri đã chuẩn bị sẵn Tiếp theo, dùng que cấy đã hơ qua ngọn lửa đèn cồn để trải đều vi khuẩn trên bề mặt thạch Sau đó, sử dụng đầu côn đã cắt 1/3 và gắn với bóp cao su để ấn nhẹ vào đĩa thạch và lấy thỏi thạch ra Cuối cùng, chuẩn bị dịch chiết bằng cách pha loãng 0,2 g cao (có thể là cao chiết bằng nước cất hoặc cao chiết bằng ethanol 50%) trong 1 ml dung dịch nước cất.

Để thực hiện quy trình, đầu tiên, cần chuẩn bị dung dịch có nồng độ 200 mg/ml và tiến hành thanh trùng trong 30 phút Sau đó, tạo dịch chiết với nồng độ 0,1 g cao trong 1 ml nước cất, tương đương 100 mg/ml, và tiếp tục thanh trùng.

Dựng micropipet hỳt 100-200 àl mỗi phõn đoạn mẫu lần lượt cho vào mỗi lỗ của đĩa Mỗi đĩa tiến hành đục 3 hoặc 4 lổ

5 Nuôi vi sinh vật trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 37 0 C