MỞ ðẦU
Nuôi trồng thủy sản (NTTS) hiện là một trong những ngành sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất thế giới, với khoảng 90% sản lượng nuôi thủy sản toàn cầu đến từ các nước Châu Á Đây là lĩnh vực được xem là thế mạnh của nhiều quốc gia có diện tích mặt nước lớn, trong đó có Việt Nam Hiện nay, diện tích nuôi trồng thủy sản của Việt Nam khoảng 887.700 ha, trong đó diện tích nuôi thủy sản nước ngọt chiếm 408.700 ha, và sản lượng thủy sản nước ngọt đóng góp 60-70% tổng sản lượng thủy sản của cả nước.
Sản phẩm từ nuôi trồng thủy sản không chỉ cung cấp protein quan trọng cho thị trường nội địa mà còn là nguồn nguyên liệu dồi dào cho xuất khẩu Do đó, an toàn vệ sinh thực phẩm trong nuôi trồng thủy sản rất cần được chú trọng Ký sinh trùng từ thủy sản có thể lây sang người, gây ra các bệnh như sán lá gan và sán ruột, là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng sản phẩm thủy sản Điều này đặc biệt quan trọng ở những quốc gia có truyền thống chế biến nhiều món ăn từ cá như gỏi, mắm, khô và muối.
Sán lá ruột nhỏ Haplorchis spp thuộc họ Heterophyidae thường ký sinh trong ruột non của người, gia súc và gia cầm, gây rối loạn tiêu hóa Mặc dù tác hại trực tiếp của loài sán này đối với người và động vật không lớn, nhưng khi ký sinh, chúng tạo ra các vết loét, làm tăng nguy cơ cho các tác nhân gây bệnh khác xâm nhập vào cơ thể Đặc biệt, chúng có thể gây tổn thương đến não bộ khi di chuyển tới não và đẻ trứng ở đó Hiện có khoảng 40 triệu người trên thế giới đang bị nhiễm sán lá gan nhỏ.
Clonorchis sinensis hay Opisthorchis viverrini và sán lá ruột nhỏ Haplorchis sp., Echinotosma sp, hoặc Metagonimus sp (World Health Organization, 1995)
Cỏ Rụ phi (Oreochromis niloticus) hiện ủang là một trong những ủối tượng nuụi chủ lực nhằm cung cấp thực phẩm cho nội ủịa cũng như xuất
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang tiến hành nghiên cứu về sự biến động và khả năng lây nhiễm của ấu trùng sán lá ruột Haplorchis pumilio trên cá rô phi Oreochromis niloticus Với sản lượng nuôi cá ngày càng tăng, việc nghiên cứu nguồn lây nhiễm này trở nên cực kỳ quan trọng nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá sự biến động và khả năng phát triển của ấu trùng metacercariae của sán lá ruột Haplorchis pumilio trên cá rô phi Oreochromis niloticus, nhằm đề xuất các giải pháp đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm trong nuôi trồng thủy sản.
Nghiờn cứu cường ủộ ấu trựng cercariae do ốc nhả ra
Nghiờn cứu sự biến ủộng metacercariae H pumilio nhiễm trờn cỏ rụ phi
O niloticus trong ủiều kiện thớ nghiệm
Nghiên cứu mô bệnh học của cá rô phi sau khi gây nhiễm
Nghiên cứu khả năng cảm nhiễm của ấu trùng metarcerariae trên chuột bạch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3
ðỐI TƯỢNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðối tượng và vật liệu nghiên cứu
Sỏn lỏ ruột nhỏ H pumilio giai ủoạn ấu trựng cercariae - pleurolophocercous ủược lấy từ ốc Melanoides tuberculata thu từ xó Nghĩa
Lạc, huyện Nghĩa Hưng, Nam ðịnh - vùng dịch tễ của sán lá truyền lây qua cỏ, ủặc biệt là sỏn lỏ ruột H Pumilio
Cỏ rụ phi Oreochromis niloticus được lấy từ Viện nghiên cứu NTTS1, Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh và đã được kiểm tra đầu vào để đảm bảo không nhiễm ấu trùng sán Sau đó, cỏ được nuôi thuần dưỡng trong vòng 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm.
Chuột bạch Mus musculus, 4 tuần tuổi, cú trọng lượng 20-30g ủược mua từ Phũng ủộng vật thớ nghiệm, Viện vệ sinh dịch tễ TW, Hà Nội
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17
Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
• Kính hiển vi soi nổi 3X
• Kính hiển vi quang học, với các vật kính 4X, 20X, 60X, 100X
• Hệ thống bể: 4 bể kính (50 x 90 x 50cm)
• Thiết bị cõn ủo: Cõn ủiện với ủộ chớnh xỏc ủến 0.01 g, thước thẳng ủo chiều dài với ủộ chớnh xỏc ủến 1 mm
• Cốc ủong: 4 cốc thủy tinh 1000 ml, 30 cốc thủy tinh 15 ml, 25 cốc nhựa 15 ml
• Bộ xử lý mẫu mô, máy cắt mô và các dụng thiết bị, dụng cụ phụ trợ khác
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 18
• Pepsin, axit Clohydric (HCl), NaCl dựng ủể tiờu cơ cỏ
• Dóy nồng ủộ cồn (50 - 100%), Xylen, Bomsal Canada
• Dung dịch Eosin và Hematoxyline ủể nhuộm tiờu bản mụ
Phương pháp nghiên cứu
∗ Xỏc ủịnh cường ủộ nhiễm cercariae trờn ốc
Thớ nghiệm ủược bố trớ ủể xỏc ủịnh cường ủộ thải ấu trựng cercariae của ốc M tuberculata sau 1 và 4 giờ ủược tiến hành như sau;
- ðặt riêng từng cá thể ốc vào trong lọ nhựa tròn (2.5 x 3cm), màu trong suốt có chứa 0.5cm nước sạch
- Sau 1 giờ, chuyển ốc sang lọ nhựa khác có kích thước giống nhau chứa 0.5cm nước sạch thờm 4 giờ sau ủú loại bỏ ốc ra khỏi cốc
- Sử dụng pipette ủể hỳt ấu trựng cercariae ra ủĩa petri, soi và ủếm số lượng cercariae thải ra trong mỗi cốc nhựa ở thời ủiểm 1 và 4 giờ
Thớ nghiệm ủược lặp lại với 10 cỏ thể ốc nhiễm khỏc nhau ủược thu cựng một thời ủiểm
∗ đánh giá sự biến ựộng metacercariae trên cá
Nghiệm thức 1: 500 cỏ rụ phi O niloticus ủược gõy nhiễm với n= 40 cỏ thể ốc M tuberculata có nhiễm ấu trùng cercariae trong thùng xốp
(40x50x30cm) chứa nước sạch cú ủộ sõu là 10 cm
Nghiệm thức 2: cũng với cỏc ủiều kiện tương tự nhưng chỉ ủược gõy nhiễm với liệu thấp một nửa so với nghiệm thức 1(1/2 n= 20 ốc M tuberculata) nhiễm ấu trùng cercariae
Sau 2 giờ phơi nhiễm trong nước, cỏ ở cỏc Nghiệm thức 1 và 2 ủược chuyển sang 2 bể kính tương ứng có kích thước giống nhau (50 x 90 x 50cm)
Cỏ ủược nuụi trong ủiều kiện thớ nghiệm trong vũng 15 tuần, sử dụng cho ăn
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp chương trình luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tập trung vào việc nghiên cứu thức ăn công nghiệp của Cargill phù hợp với kích cỡ cỏ Đồng thời, việc có chế độ thay nước sạch từ giếng khoan hàng ngày cũng được nhấn mạnh trong chương trình này.
Mỗi nghiệm thức, 15 cỏ thể ủược thu vào cỏc tuần thứ 2, 3, 6, 8, 10, 11,
12, 13, 14 và 15 sau gõy nhiễm ủể kiểm tra ấu trựng nhiễm trờn cỏ nhằm ủỏnh giỏ sự biến ủộng về tỷ lệ và cường ủộ nhiễm
Mỗi nghiệm thức, 2-5 cỏ thể ủược thu vào cỏc ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 sau gõy nhiễm, cố ủịnh trong formalin 10% ủể nghiờn cứu sự phỏt triển của metacercaria trong cá
Hình 4: Hình thức gây nhiễm ấu trùng sán cho cá rô phi
∗ đánh giá sự phát triển của ấu trùng
Thớ nghiệm ủược bố trớ với 500 cỏ rụ phi O niloticus (0.1 g) nhiễm với
60 cá thể M tuberculata có nhiễm pleurolophocercous trong 5 giờ
Metacercariae sẽ ủược ủịnh kỳ thu bằng cỏch tiờu cơ và phõn lập từ 30, 30,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 20
Trong nghiên cứu, số lượng cá được ghi nhận lần lượt là 50, 55, 60, 75, 100, 100 ở các độ tuổi 12 giờ, 1, 2, 3, 5, 7, 9 và 13 ngày Thí nghiệm được thực hiện với ấu trùng được phân lập từ 35 cá rụhu nuôi trong ao gia đình tại Nghĩa Lạc, Nghĩa Hưng, Nam Định Metacercariae đã được gây nhiễm cho chuột với liều lượng 40 ấu trùng mỗi chuột, và sau 7 ngày, chuột được mổ để kiểm tra sự hiện diện của sán trưởng thành trong ruột non (chi tiết xem bảng 1).
Bảng 1: Thí nghiệm gây nhiễm trên chuột Tuổi ấu trùng
(giờ, ngày, khụng xỏc ủịnh -TN)
13 ngày 5 40 ðối chứng Nhiễm tự nhiên 7 40
∗ Phương pháp tiêu cơ cá Áp dụng theo Sổ tay phòng thí nghiệm dự án FIBOZOPA - FIBOZOPA Lab manual, 2005
- Pha dung dịch tiờu cơ gồm 6 gam pepsin và 8 ml HCl ủặc pha trong 1 lít nước cất
- Cõn, ủo kớch thước từng cỏ thể cỏ
- Nghiền nhỏ từng cá thể cá
- Trộn phần ủó nghiền với dung dịch tiờu cơ sau ủú khuấy ủều
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21
- ðặt trong tủ ấm 37 o C trong 2-3 giờ
- Khi cơ tan hết tiến hành lọc: ủổ sản phẩm tiờu cơ qua lưới lọc cú mắt lưới (1 x1) mm và rửa bằng nước muối sinh lý 0,86%
- ðể lắng hỗn hợp trong vài phút, các bào nang metacercariae nặng sẽ lắng chìm xuống dưới, loại bỏ phần nước nổi bên trên, giữ lại phần lắng cặn
Đưa phần lắng cặn vào đĩa petri chứa nước muối sinh lý 0,86%, sau đó xoay nhẹ đĩa để các chất lắng cặn tập trung vào giữa Sử dụng pipet để loại bỏ phần nhẹ nổi trên bề mặt.
- Quan sỏt trờn kớnh hiển vi soi nổi ủể ủếm số lượng metacercariae
Để nhận dạng ấu trùng metacercariae, chuyển chúng sang lam kính và nhỏ một giọt nước muối sinh lý Sau đó, quan sát hình thái chi tiết dưới kính hiển vi với các mức phóng đại X20, X60 và X100.
∗ Phương pháp mô bệnh học
Phương pháp chuẩn để cố định mẫu cỏ là sử dụng formalin 10%, sau đó ngấm parafin và ủ khuẩn Mẫu sẽ được cắt bằng máy microtome với độ dày lát cắt từ 4-5 micromet Cuối cùng, sử dụng dung dịch H&E để nhuộm tiêu bản trước khi quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh.
∗ Kỹ thuật gây nhiễm chuột (Theo Helle Kay và ctv, 2008)
- Sử dụng kim gõy nhiễm ủầu trũn lấy 40 ấu trựng sỏn H pumilio sau khi phõn lập ủược từ cỏ
Để thực hiện quy trình, tay phải cần cầm kim chứa ấu trùng sán, trong khi tay trái cầm chuột Ngón trỏ và ngón cái của tay trái phải giữ chắc vào phần gáy của chuột, còn ngón út thì kẹp chặt lấy ủuụi chuột.
- Kộo nhẹ phớa ủầu chuột giữ chặt cố ủịnh phớa ủuụi ủể sao cho chuột ở tư thế thẳng nhất
- ðưa nhẹ ủầu kim gõy nhiễm vào miệng chuột, luồn qua hầu, thực quản ủến dạ dày và bơm hết dung dịch chứa metacercariae ra khỏi xi lanh
Sau 7 ngày gõy nhiễm, chuột sẽ ủược mổ ủể thu sỏn trưởng thành
- Giết chuột bằng dung dịch ete trong cốc thủy tinh có chứa bông
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22
- Mổ lấy toàn bộ ruột của chuột và tỏch ruột trong ủĩa petri cú chứa nước muối sinh lý 0,86%
- Cho ủĩa petri cú chứa ruột vào tủ ấm ở nhiệt ủộ 37 o C trong vũng 30 phỳt ủể sỏn trưởng thành thoỏt ra ngoài
- Lọc rửa ruột bằng nước sạch rồi soi trờn kớnh giải phẫu ủể tỡm sỏn trưởng thành
- ðếm số lượng sỏn tỡm ủược ở mỗi cỏ thể chuột.
Phương pháp xử lý số liệu
Nhập số liệu, vẽ cỏc bảng biểu và ủồ thị bằng Microsoft Excel
Trong năm 2003, T-test được sử dụng để đánh giá sự khác biệt về cường độ trung bình, trong khi Chi-square được áp dụng để so sánh sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ
4.1.1 Cường ủộ nhiễm cercariae trờn ốc
Nghiên cứu đã quan sát quá trình thải ấu trùng cercariae từ 10 cá thể ốc dương tính với pleurolophocercous sau 1 giờ và 4 giờ Kết quả cho thấy số lượng ấu trùng cao nhất là 384 ấu trùng/ốc sau 4 giờ và 238 ấu trùng/ốc sau 1 giờ Số lượng ấu trùng cercariae trung bình được thải ra là 118,5 ấu trùng/ốc sau 1 giờ và 175,8 ấu trùng/ốc sau 4 giờ Mặc dù số lượng ấu trùng thải ra sau 4 giờ cao hơn, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P=0,1943).
Bảng 2: Khả năng thải ấu trùng cercariae từ ốc nhiễm
Số lượng ấu trùng cercariae/ốc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 24
Hỡnh 5 Pleurolophocercous cercariae (A-B) của H pumilio thu ủược từ ốc M tuberculata (C-D)
4.1.2 Biến ủộng metacercariae trờn cỏ sau gõy nhiễm
Biến ủộng về tỷ lệ nhiễm
Kết quả kiểm tra sau 2 tuần gây nhiễm cho thấy nghiệm thức 1 đạt tỷ lệ 100% và nghiệm thức 2 đạt 93,3% Tỷ lệ nhiễm có xu hướng giảm dần từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 15, chỉ còn 20% ở nghiệm thức 1 và 0% ở nghiệm thức 2.
2 Sự biến ủộng rất lớn ở mức cú ý nghĩa thống kờ (P=0,0001) giữa tuần thứ 2 và tuần thứ 15 Kết quả cũng cho thấy trong vũng 6 tuần ủầu sau khi gõy nhiễm, tỷ lệ nhiễm có giảm nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê (P=1,00) Mặc dự vậy, ủến tuần thứ 8 thỡ sự biến ủộng ủó rừ ràng hơn; tỷ lệ nhiễm ở nghiệm thức 1 là 66,67% và nghiệm thức 2 là 53,33% Sự biến ủộng
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu liên quan đến luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tuần thứ 8 và tuần thứ 2 với giá trị P lần lượt là 0,042 và 0,014.
Trong 2 nghiệm thức, Nghiệm thức 1 gây nhiễm với 40 ốc dương tính, cao gấp ủụi so với Nghiệm thức 2 với 20 ốc nhiễm pleurolophocercous cercariae Tuy vậy, tại thời ủiểm ban ủầu (tuần 2) tỷ lệ nhiễm giữa 2 nghiệm thức là không có sai khác về mặt thống kê (P=1,00) Cá ở Nghiệm thức 1 có tỷ lệ ở mức 100% cho ủến hết tuần thứ 3 và cỏ ở Nghiệm thức 2 tương ứng là 93,3 và 86,6% Tại thời ủiểm tuần thứ 15 khi kết thỳc thớ nghiệm, tỷ lệ nhiễm của cỏ ở nghiệm thức 2 ủó giảm xuống tới 0% nhưng tỷ lệ này vẫn là 20% trên cá ở nghiệm thức 1 ðiều này cho thấy ấu trùng sán lá ruột nhỏ H pumilio có thể tồn tại trong cá ít nhất là 15 tuần sau khi nhiễm
Tuần 2 Tuần 3 Tuần 8 Tuần 10 Tuần 11 Tuần 12 Tuần 13 Tuần 14 Tuần 15
Hỡnh 6: Biến ủộng tỷ lệ nhiễm ấu trựng metacercariae sau gõy nhiễm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26
Biến ủộng về cường ủộ
Cường độ nhiễm ấu trùng qua 15 tuần có xu hướng giảm dần Ở tuần thứ 2, cường độ nhiễm trung bình là 7,8 ấu trùng/cá và 4,26 ấu trùng/cá ở các nghiệm thức 1 và 2 Sự biến động tiếp tục được ghi nhận ở tuần thứ 3, thứ 6, và thứ 8, khi cường độ nhiễm trung bình giảm mạnh xuống còn 1,5 và 0,5 ấu trùng/cá tương ứng ở nghiệm thức 1 và 2 Sự thay đổi về số lượng ấu trùng ở cả hai nghiệm thức từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 8 có ý nghĩa thống kê với P=0,042 và P=0,014 (P