ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Quả ổi đào đạt độ chín 90% với vỏ xanh nhạt, mùi thơm và vị ngọt vừa phải, vẫn giữ độ cứng nhất định, được thu mua tại chợ Minh Phương, Việt Trì, Phú Thọ Những quả được chọn lọc đồng đều về kích thước, màu sắc và độ chín, không có dấu hiệu dập nát, sâu bệnh hay thối hỏng Sau khi thu hoạch, quả được rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên.
- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm STT
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205
7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200
8 Nồi hấp thanh trùng paster
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào.
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol.
Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 : Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp
- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp
- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
Để tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn, cần thực hiện các thí nghiệm nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Đồng thời, việc đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol cũng rất quan trọng, đặc biệt là trong ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo, nhằm nâng cao chất lượng và an toàn cho sản phẩm.
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
3.4.1 Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu
Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991
Sử dụng nhiệt độ phù hợp để tách ẩm trong vật liệu là rất quan trọng, đồng thời cần giữ lại tất cả các chất có trong vật liệu Do đó, việc điều chỉnh nhiệt độ sấy không nên quá cao hoặc quá thấp để đảm bảo hiệu quả tối ưu.
Nhiệt độ cao khiến độ ẩm bốc hơi nhanh chóng, nhưng cũng có thể làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, đặc biệt là những chất có tính bay hơi Điều này có thể ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả phân tích.
Nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ thoát hơi, dẫn đến thời gian kéo dài và biến đổi chất Độ ẩm được xác định thông qua phương pháp sấy cho đến khi đạt khối lượng không đổi.
- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991
- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định
- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:
+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g
+ Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)
+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm
Lấy chén cân có khả năng chứa 10g mẫu, sau đó rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 105°C cho đến khi trọng lượng ổn định Để chén nguội trong bình hút ẩm trong khoảng 20-25 phút, rồi tiến hành cân với độ chính xác cao.
- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu Cân tất cả ở cân phân tích một cách chính xác.
- Cho tất cả vào tủ sấy ở 105 0 C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng lượng không đổi.
- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác.
Đặt mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 độ C trong 1 giờ, sau đó lấy ra và làm nguội trong bình hút ẩm khoảng 20-25 phút Cuối cùng, cân mẫu trên cân phân tích cho đến khi trọng lượng ổn định.
Tính kết quả: Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức:
- W: Độ ẩm của thực phẩm (%).
- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g).
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết bã quả ổi đào được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh Dịch chiết bã quả ổi đào được pha loãng và trộn với nước cất, sau đó thêm thuốc thử Folin-Ciocalteu và Na2CO3 Hỗn hợp này được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo ở bước sóng 760 nm bằng máy quang phổ kế Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn, và kết quả hàm lượng polyphenol được biểu diễn dưới dạng mg đương lượng gallic acid (GAE) trên 1g chất khô (DW) hay mg GAE/g DW.
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)
- K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)
- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
- w là độ ẩm của mẫu (%)
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Quả ổi đào chín 90% được thu hái và loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, thối hỏng trước khi rửa sạch và để khô tự nhiên Sau đó, bã quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly với dung môi nước, ở nhiệt độ 40°C trong 30 phút, với tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi là 1/10 (w/v) Cuối cùng, dịch chiết thu được sẽ được xác định hàm lượng polyphenol.
3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.
Để tách chiết polyphenol từ bã ổi đào, trước tiên, ổi đào được thu hái và rửa sạch, sau đó xay nhỏ để lấy bã Tiến hành tách chiết polyphenol bằng các dung môi như methanol, ethanol và nước Cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và sử dụng thiết bị rung lắc để thực hiện quá trình trích ly.
Quá trình chiết diễn ra trong 30 phút với cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ 40 oC Sau khi hoàn tất, dịch chiết được ly tâm ở 4 oC với tốc độ 5000 rpm, sau đó tiếp tục lọc để thu được dịch chiết trong, có màu hồng phớt nhẹ.
Trong thí nghiệm 1, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng trích ly bằng cách sử dụng ba loại dung môi khác nhau: nước (H2O), methanol (CH3OH) 60 độ và ethanol (C2H5OH) 60 độ Để đánh giá hiệu quả của từng loại dung môi, chúng tôi đã thiết lập một bố trí thí nghiệm cụ thể nhằm phân tích sự khác biệt trong khả năng trích ly.
Cân 4g (Bã ổi đào) Trích ly ở các loại dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Trong thí nghiệm 2, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol Nghiên cứu được thiết kế với 4 công thức khác nhau và thực hiện lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa trên kết quả phân tích chỉ tiêu, chúng ta sẽ chọn nồng độ dung môi chiết tối ưu Kết quả từ thí nghiệm 2 sẽ được áp dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhằm đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ này đến khả năng chiết Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo công thức đã xác định.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2 Nhiệt độ tách chiết 40 0 C
Thời gian tách chiết 30 phút
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol.
Dựa trên kết quả phân tích, chúng tôi đã xác định được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tối ưu cho quá trình tách chiết Kết quả từ thí nghiệm 3 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 4 tập trung vào việc nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết Để thực hiện đánh giá này, chúng tôi đã thiết lập bố trí thí nghiệm dựa trên công thức thí nghiệm cụ thể.
Trích ly ở các khoảng thời gian
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết nhằm đánh giá tác động của nhiệt độ đến khả năng chiết Thí nghiệm được bố trí theo một công thức cụ thể để thu thập dữ liệu chính xác.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nhiệt độ
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào
Sau khi khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã xác định ba yếu tố A, B, C có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong bã ổi đào Để đánh giá khả năng ảnh hưởng của những yếu tố này, chúng tôi áp dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Benhken với ba yếu tố và ba cấp độ.
Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Ma trận thực nghiệm Box-Behnken bao gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức độ: +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình) Trong số đó, có 5 thí nghiệm được lặp lại tại điểm trung tâm, nơi tất cả các yếu tố đều ở mức 0 (bảng 3.4).
Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào
Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả hàm lượng polyphenol là cao nhất.
3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
3.5.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS
Năm 2002, với một số điều chỉnh nhỏ, khoảng 30 àl đến 120 àl dịch chiết được trộn với nước cất để đạt tổng thể tích 3 ml Tiếp theo, thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối trong 30 phút Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ, và khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức đã được thiết lập.
- ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết
- ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Giá trị IC50 trong báo cáo phản ánh nồng độ dịch chiết cần thiết để ức chế 50% gốc tự do DPPH dưới các điều kiện xác định Một giá trị IC50 thấp cho thấy hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao hơn Mỗi phân tích được thực hiện ba lần và kết quả cuối cùng được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình.
3.5.3.2 Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan.
Các số liệu thu thập được được thống kê và xử lý bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, với ba biến ở ba cấp độ Việc xử lý dữ liệu được thực hiện trên phần mềm Design-Expert 7.0.