Mục đích nghiên cứu
- Tách chiết polyphenol từ bã quảổi đào sau khi sản xuất nước ép ổi đào
- Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết và hướng tới ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.
Yêu cầu
- Đánh giá được thành phần nguyên liệu ban đầu
- Nghiên cứu lựa chọn được một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Tối ưu hóa được điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn
Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol cho thấy khả năng chống oxy hóa hiệu quả, đặc biệt trong việc bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo Thử nghiệm kiểm soát khả năng này chứng minh rằng dịch chiết polyphenol có thể nâng cao chất lượng và thời gian bảo quản thực phẩm cho gia súc.
- Hoàn thiện được quy trình tách chiết dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Giới thiệu về cây ổi
Đặc điểm phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, ổi là một loại cây ăn quả quan trọng, được trồng phổ biến ở cả vùng đồng bằng và miền núi, ngoại trừ các khu vực trên 1500m Có khoảng 7 - 10 giống ổi khác nhau, cây ổi ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, cho hoa và quả hàng năm.
Hình 2.3 a) Quảổi ruột đỏ b) Quảổi ruột trắng
Thành phần hóa học của quả ổi bao gồm: Flavonoid, tanin, tinh dầu, vitamin
-Flavonoid: Trong cả quả xanh và chín đều có quercetin, leucocyanidin, mecocyanidin, guajavarin [19]
-Tanin: Với hàm lượng cao khi quả còn xanh và thấp hơn khi quả chín, cũng thuộc loại pyrogalol với cả arabio ester của acid ellagic, acid gallic, [4]
-Tinh dầu: β-carophylen (24,1%), nerolidol (17,3%), 3-phenyl acetat (5,3%), carophyllen oxid (5,1%) [20]
Quả ổi là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, chứa 81,7% nước, 0,9% protein, 0,3% chất béo và 5,2% chất xơ Ngoài ra, quả ổi còn cung cấp 11,2% hydrat carbon dưới dạng đường khử, cùng với các hợp chất vô cơ như canxi, magie, acid oxalic, photpho, sắt, natri, đồng, sulfua, thiamin, riboflavin, acid nicotinic và đặc biệt là vitamin C.
+ Hàm lượng vitamin C trong quả ổi gấp 4 - 10 lần quả chanh, chúng thay đổi khá nhiều, trung bình từ 100 - 1000mg/100g, nhiều nhất ở phần vỏ quả rồi đến phần cùi [4]
+ Hạt ổi chiếm 6 - 12% trọng lượng quả và có khoảng 14% một chất dầu béo có mùi thơm [4]
2.1.4 Ho ạ t tính sinh h ọ c và công d ụ ng Ổi không chỉ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng mà còn giống như một loại thuốc dân gian được sử dụng rộng rãi ở các khu vực cận nhiệt đới trên toàn thế giới [21] Người ta biết rằng ổi thường được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, hạ sốt, kiết lỵ, viêm dạ dày ruột, tăng huyết áp, tiểu đường, sâu răng, giảm đau
Quả ổi nổi bật với hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ và chứa nhiều hợp chất chống ung thư cùng chất chống oxy hóa Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự đã chỉ ra rằng vỏ, hạt và bã của quả ổi chứa các hợp chất quý giá như axit Gallic, galangin, kaempferol, homogentisic acid và cyanidin 3-glucoside.
Hoạt động chống tiêu chảy
Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu phổ biến, ảnh hưởng đến cả các nước phát triển Hằng năm, khoảng 2,2 triệu người, chủ yếu là trẻ em và trẻ sơ sinh, tử vong do tiêu chảy.
Quả ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy do độc tố E coli hoặc S aureus theo nghiên cứu của Vieira RHSF và cộng sự [24]
Chiết xuất từ quảổi có tác dụng chống tiêu chảy, được nghiên cứu bởi Ojewole J và cộng sự, cho thấy hiệu quả trong việc điều trị và phòng ngừa tình trạng này.
Chiết xuất từ quả ổi chứa phenol, một hợp chất quan trọng có tác dụng chống dị ứng và chống viêm, theo nghiên cứu của Denny C và cộng sự Ngoài ra, nghiên cứu của Roy CK cũng chỉ ra rằng chiết xuất từ quả ổi có hiệu quả trong điều trị viêm gan và sản xuất huyết thanh.
Hoạt động chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các phân tử giúp làm chậm quá trình oxy hóa, ngăn chặn sự hình thành gốc tự do có thể gây hại cho tế bào Những gốc tự do này có thể dẫn đến ung thư và nhiều bệnh lý khác Các chất chống oxy hóa phổ biến bao gồm beta-carotene, lycopene và vitamin.
C, E và A, polyphenol và một số chất khác Phản ứng oxy hóa là một trong những phản ứng phá hủy quan trọng nhất Các gốc tự do gây ra rất nhiều rối loạn ở người như rối loạn thần kinh, ung thư, nhiễm virus Các gốc tự do này tác động gây ra các phản ứng oxy hóa qua nghiên cứu của Masuda T và cộng sự [28]
Quả ổi chứa nhiều chất chống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn chức năng não, viêm, bệnh tim, ung thư, xơ cứng động mạch và viêm khớp Trong số các chất chống oxy hóa, polyphenol và axit ascorbic là hai thành phần dồi dào nhất Polyphenol chủ yếu bao gồm flavonoid, thường xuất hiện dưới dạng glycoside và ester.
Quả ổi có hàm lượng cao axit protocatechuic, quercetin, axit ferulic, axit ascorbic, quercetin, axit gallic và axit caffeic là những chất chống oxy hóa quan trọng [31, 32].
Hoạt tính sinh học và công dụng
Polyphenol là các hợp chất có cấu trúc phân tử chứa nhiều vòng Benzen và từ một đến nhiều nhóm Hydroxyl (OH -) Dựa vào đặc điểm cấu tạo hóa học, polyphenol được phân loại thành ba nhóm chính.
Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH Đại diện thường gặp:
- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:
Vallinin là một hợp chất glycoside có mùi thơm đặc biệt, thường xuất hiện trong quả Nó được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp xà phòng và thực phẩm như một chất tạo hương.
- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi
- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao.
Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất
Polyphenol
Polyphenol là các hợp chất có cấu trúc phân tử chứa nhiều vòng Benzen và một hoặc nhiều nhóm Hydroxyl (OH -) Dựa vào đặc điểm cấu tạo hóa học, polyphenol được chia thành ba nhóm chính.
Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH Đại diện thường gặp:
- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:
Vallinin là một hợp chất có mùi thơm đặc biệt, tồn tại dưới dạng glycoside, thường xuất hiện trong quả Nó được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp xà phòng và thực phẩm như một chất tạo hương.
- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi
- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao
Dẫn xuất phenyl propan là các hợp chất chứa vòng benzene kết hợp với mạch bên có ba nguyên tử cacbon, phổ biến trong nhiều loại thực vật và thường có mùi thơm.
+ Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6 (flavonoids)
Flavonoids là nhóm sắc tố thực vật phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu sắc cho nhiều loại hoa quả Ngoài ra, flavonoids cũng là các hoạt chất thiết yếu trong dược liệu, được phân lập và phân loại theo cấu trúc hóa học của chúng.
Flavanol, hay còn gọi là flavan-3-ol, catechin và galocatechin, là thành phần của hợp chất tanin có trong nhiều loại trái cây, trà xanh, rượu đỏ và socola (Yang et al., 2001) Ngoài ra, gallocatechin, epigallocatechin và epigallocatechin gallate cũng được tìm thấy trong các loại hạt họ đậu và chè (Arts et al., 2000a; Arts et al., 2000b).
Flavon là một hợp chất phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong tỏi, hành, chè và dâu tây Chúng thường có màu vàng và tồn tại dưới dạng glycoside, với flavonol là dạng phổ biến nhất Flavonol thường xuất hiện dưới nhiều hình thức khác nhau, trong đó Kampherol và Quercetin là hai loại thường gặp Sự hình thành flavonols glycosides phụ thuộc vào hoạt động của ánh sáng, do đó chúng chủ yếu tập trung ở lá và vỏ quả.
Anthocyanin là các hợp chất sắc tố quan trọng trong hoa quả, mang lại màu đỏ, tím, xanh dương và vàng cho nhiều loại thực vật Chúng là các glycoside, trong đó phần aglucon là anthocyanidin, với anthocyanin hòa tan trong nước còn anthocyanidin thì không Một điểm lưu ý trong cấu trúc của anthocyanidin là nguyên tử oxi trong vòng pyran có hóa trị tự do, nhưng chưa xác định rõ nguyên tử nào, oxi hay cacbon, mang điện tích dương tự do; do đó, cấu trúc của anthocyan thường được biểu diễn bằng công thức trung hòa.
Anthocyanidin có điện tích dương tự do, cho phép nó hoạt động như một cation trong môi trường acid và như một anion trong môi trường kiềm, từ đó có khả năng tạo muối với cả acid và base.
Trạng thái tích điện của Anthocyan thay đổi theo pH môi trường, dẫn đến sự biến đổi màu sắc Các muối cation của Anthocyan thường có màu đỏ với nhiều sắc thái như vàng nhạt, tím và xanh nhạt, trong khi các muối anion lại có màu xanh Hiện tượng hoa thực vật màu hồng chuyển sang màu xanh khi luộc chín chứng tỏ sự thay đổi pH trong dịch tế bào theo hướng kiềm.
Antocyanidin được chia thành 3 nhóm nhỏ, đó là: Pelargonidin, cyanidin, delphinidin, ngoài ra còn gặp apigenidin
Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa- khử, phản ứng cộng và ngưng tụ
- Phản ứng oxy hóa-khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon
- Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tướng ứng
- Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen.
Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol
Theo Jovanovic (2000); Nicole (2001); Marfak (2003); Van Camp, (2005) trích dẫn bởi Chirinos Gallardo [12], cơ chế kháng oxi hoá của các chất phenol:
Cơ chế 1: Vô hoạt các gốc tự do
Polyphenol có cấu trúc vòng, với các điện tử chuyển động liên tục trong các liên kết đôi, đóng vai trò như bẫy cho gốc tự do Gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có electron lớp ngoài không cặp đôi, dẫn đến hoạt tính cao và khả năng phản ứng mạnh mẽ với các phân tử xung quanh như DNA và lipid màng, gây ra hiện tượng lão hóa và ung thư Khi gốc tự do gặp polyphenol, chúng sẽ nhường electron không cặp đôi cho polyphenol, giúp chúng trở về trạng thái ổn định Electron không cặp đôi trong polyphenol được "nhốt" lại và di chuyển giữa các vòng benzene mà không làm thay đổi cấu trúc của chúng.
Cơ chế 2: Tạo phức dạng chelat với các ion Fe2+ và Cu+
Polyphenol có khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng cách “bắt giữ” các ion kim loại, những kim loại này đóng vai trò quan trọng trong cơ thể như vận chuyển oxy (sắt trong hemoglobin) và làm cofactor cho nhiều enzyme (sắt với catalase, đồng với superoxide dismutase) Tuy nhiên, chúng cũng có thể gây ra sự hình thành các gốc tự do thông qua việc cắt bỏ hydrogen của lipid, tạo ra gốc tự do peroxide, hoặc tham gia vào phản ứng Fenton.
Thứ nhất, các ion kim loại có thể gây ra kích thích cắt bỏ hydrogen của lipid chưa bão hòa thành gốc lipid:
Các ion kim loại cũng có thể phân tách hydro thành dạng alkoxyl và gốc peroxyl, gây ra kích thích sự oxi hóa lipid:
Fe3+(Cu 2+ )+ ROOH → Fe 2+ (Cu + ) + ROO ● + H +
Fe2+(Cu + ) + ROOH → Fe 3+ (Cu 2+ ) + RO ● + OH ─
Các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss:
H2O2 + Fe 2+ (Cu + ) →°OH + OH - + Fe 3+ (Cu 2+ ) (Phản ứng Fenton)
Phản ứng Haber-Weiss diễn ra theo phương trình O2-° + H2O2 → °OH + OH- + O2 Cấu trúc của flavonoid cho phép chúng tạo ra các phức bền dạng chelat với các ion kim loại, giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do do kim loại như Fe và Cu gây ra.
Cơ chế 3: Kìm hãm enzyme xanthine oxydase
Hoạt động của xanthine oxidase là một nguồn chính tạo ra các gốc tự do Khi có oxy, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa xanthine thành acid uric, trong đó phân tử oxy nhận điện tử và chuyển đổi thành ion superoxide.
Xanthine + 2O2 + H2O xanthine oxydase Acid uric + 2O2° - + 2H +
Các flavonoid có cấu trúc vòng A tương tự như vòng purin của xanthine, được xem là chất ức chế cạnh tranh của xanthine oxidase, từ đó giúp ngăn chặn sự hình thành ion superoxide (Nicole, 2001).
Nhiều hợp chất phenol, đặc biệt là flavonoid, đã chứng minh tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người nhờ khả năng chống oxi hóa Chúng có khả năng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hóa, thoái hóa gan và tổn thương do bức xạ Flavonoid giúp làm bền thành mạch và được sử dụng trong điều trị rối loạn chức năng tĩnh mạch, bệnh trĩ và rối loạn tuần hoàn võng mạc Ngoài ra, flavonoid còn có tác dụng chống độc, giảm thiểu tổn thương gan, và nhiều loại flavonoid như flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, có trong các loại thảo dược như lá diếp cá và cây râu mèo.
Nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim
Hiện nay, các dược liệu và hoa quả giàu flavonoid đã được nghiên cứu, chiết xuất và sản xuất thành các sản phẩm tiện lợi như thuốc viên và thuốc nước.
G ố c t ự do, quá trình oxy hóa ch ấ t béo
Quá trình oxy hóa
Quá trình oxy hóa là phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển giao cho chất oxy hóa, tạo ra các gốc tự do Những gốc tự do này có khả năng gây ra phản ứng dây chuyền, dẫn đến sự phá hủy tế bào trong cơ thể sinh vật.
Bi ệ n pháp h ạ n ch ế quá trình oxy hóa
Để hạn chế sự oxi hóa, một số biện pháp sau thường được sử dụng:
- Loại bỏ oxi trong thực phẩm bằng cách đóng gói chân không hoặc sử dụng glucose-oxidase
Để bảo quản thực phẩm hiệu quả, cần giữ ở nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng, giúp giảm tốc độ oxi hóa Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp với các loại trái cây và rau củ có chứa lipoxygenase Để ngăn ngừa hư hỏng thực phẩm, việc xử lý nhiệt là cần thiết.
Để bảo quản dầu mỡ hiệu quả, việc bổ sung các chất chống oxi hóa là cần thiết Chúng không chỉ giúp loại bỏ các gốc tự do mà còn hạn chế sự phân hủy hydroperoxide thành các sản phẩm thứ cấp Các chất chống oxi hóa phổ biến như vitamin E, BHA và BHT thường được sử dụng, bên cạnh đó, các chất chống oxi hóa tự nhiên như polyphenol và carotenoid cũng đang được nghiên cứu để ngăn ngừa quá trình oxi hóa trong dầu mỡ.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5]
Loại dung môi
Dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết polyphenol từ thực vật, với độ phân cực của dung môi ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các hợp chất phenol Sự lựa chọn dung môi không chỉ tác động đến hiệu suất chiết tách mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tinh sạch dịch chiết Do đó, việc chọn dung môi thường dựa trên hai tiêu chí chính: loại chất chủ đạo cần tách và sự thuận tiện cho công đoạn tinh sạch sau này.
Các loại chất phenolic khác nhau yêu cầu các dung môi chiết xuất khác nhau Các phenolic có glicosid hóa thường hòa tan tốt trong nước, do đó nước và hỗn hợp nước với methanol, ethanol hoặc aceton là những dung môi phổ biến Ngược lại, các phenolic ít phân cực như isoflavones và flavanones thường tan tốt hơn trong các dung môi không có nước Đặc biệt, aceton và methanol là lựa chọn lý tưởng cho việc chiết xuất flavanol, trong khi methanol là dung môi tốt nhất cho chiết xuất catechin.
Tỷ lệ dung môi trên nước
Polyphenol là nhóm hợp chất đa dạng, tồn tại dưới dạng tự do hoặc glycosid Để tách polyphenol glycoside, nước thường được thêm vào dung môi Tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau giữa các nguyên liệu, do đó cần xác định tỷ lệ dung môi/nước phù hợp để tăng hiệu quả chiết xuất và tối ưu chi phí quá trình.
Th ờ i gian chi ế t
Thời gian chiết là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol và chất lượng dịch chiết Thời gian chiết ngắn có thể dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp, trong khi thời gian chiết quá dài làm polyphenol dễ bị oxi hóa, giảm hiệu quả sử dụng thiết bị Thời gian chiết lý tưởng dao động từ 1 phút đến 24 giờ (Shahidi & Nack, 2004).
Nhiệt độ chiết
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, chi phí và chất lượng dịch chiết polyphenol Nhiệt độ cao giúp giảm độ nhớt dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và nâng cao hiệu suất trích li Tuy nhiên, chiết ở nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến chi phí ổn nhiệt tăng và nguy cơ giảm chất lượng dịch chiết do phản ứng nâu hóa.
Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
Trên thế giới
- Theo nghiên cứu của Lilis Sukeksi và Maya Sarah, “Đặc tính và tách chiết polyphenol từ bã ổi đào”, sử dụng những phương pháp:
+ Xác định trọng lượng khô: bằng cách thông qua sự bốc hơi của nước trong bã ổi
+ Phân tích quercetin: bằng máy đo quang phổ
+ Xác định hàm lượng Axit Galic bằng: phương pháp đo màu Folin quy Ciocalteau + Xác định lượng tanin bằng: phương pháp chuẩn độ
+ Phân tích Apigenin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
Kết quả thu được từ nghiên cứu trên:
Bã ổi đào sau khi chiết xuất polyphenol có trọng lượng khô đạt 28,42%, với hàm lượng chất chống oxy hóa polyphenol gồm 0,40 mg/100g quercetin, 8,70 mg/100g axit gallic, 62,60 mg/100g tanin, và không phát hiện apigenin Nghiên cứu đã khảo sát bốn dung môi hữu cơ và nước để chiết xuất polyphenol từ bã ổi đào sau chế biến nước ép Kết quả cho thấy tổng hàm lượng polyphenol còn lại trong bã ổi là 9,59 mg/100g, trong đó hàm lượng polyphenol tổng cao nhất được chiết xuất bằng metanol, và cao thứ hai là từ nước.
Hàm lượng polyphenol cao nhất được đạt được từ hỗn hợp metanol và nước với tỷ lệ tối ưu là 60% metanol/nước, tiếp theo là 50% metanol/nước Tổng hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào điều kiện dung môi và nồng độ giữa các dung môi Đặc biệt, hàm lượng polyphenol tổng cao nhất xảy ra khi sử dụng tỷ lệ 1g bã trên 25ml dung dịch metanol/nước 60%.
180 phút được chọn là thời gian lý tưởng để tách chiết polyphenol
Seokwon Seo, Soojung Lee, Marcus L Elam, Sarah A Johnson, Jonghoon Kang, và Bahram H Arjmaandi đã thực hiện nghiên cứu nhằm xác định dung môi chiết xuất tối ưu từ lá ổi, với mục tiêu đạt được hiệu quả chống oxy hóa cao Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá hiệu quả của các dung môi trong việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá ổi.
+ Xét nghiệm hàm lượng hợp chất Phenolic bằng phương pháp: Folin Ciocalteu + Xét nghiệm hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp của Moreno
+ Thử nghiệm khử gốc 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH)
+ Hoạt động của ABTS-Scavenging được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Re et al
+ Hoạt tính khử gốc oxit nitric (NO) được đo bằng thuốc thử Greiss
Hoạt động quét nitrite được đánh giá thông qua độ hấp thụ tại bước sóng 520nm bằng máy quang phổ UV, theo phương pháp đã được Kato và các cộng sự báo cáo.
Từ việc nghiên cứu trên họ đã thu được kết quả:
Hàm lượng hợp chất phenolic trong chiết xuất nước vượt trội hơn so với chiết xuất ethanol và metanol tinh khiết Đặc biệt, chiết xuất hydroethanolic có hàm lượng hợp chất phenolic cao hơn chiết xuất nước Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hydroethanolic cũng cao hơn, với chiết xuất hydroethanolic 50% đạt hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất và hiệu quả chống oxy hóa đáng kể.
Trong nước
Nghiên cứu của Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn về "Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng" đã áp dụng các phương pháp tiên tiến nhằm nâng cao hiệu quả chiết xuất polyphenol từ lá ổi.
+ Thu mẫu: từ những lá ổi già từ một cây ổi
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) đã được chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất polyphenol từ lá ổi.
+ Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo phương pháp của Singleton et al (1999)
+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khảnăng khử gốc tự do DPPH (được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh)
Nghiên cứu đã phát triển mô hình toán học mô tả ảnh hưởng của bốn yếu tố chiết xuất (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol) đến hàm lượng polyphenol từ lá ổi xẻ Các giá trị tối ưu để chiết polyphenol bao gồm dung môi ethanol 44,3%, nhiệt độ 90°C, thời gian 76,5 phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70/1 (ml/g) Dưới điều kiện tối ưu, hàm lượng polyphenol đạt 233,76 mg GAE/g chất khô, với hoạt tính chống oxi hóa cao trong thử nghiệm DPPH, cho giá trị IC50 là 2,1 μg/ml Những phát hiện này cho thấy tiềm năng của lá ổi xẻ như một nguồn chiết xuất chất chống oxi hóa tự nhiên, mở ra khả năng ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.
Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu
Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Quả ổi đào đạt độ chín 90% với vỏ màu xanh nhạt, mùi thơm hấp dẫn và vị ngọt vừa phải, vẫn giữ được độ cứng vừa phải mà chưa bị mềm Những quả này được thu mua tại chợ Minh Phương.
Quả được chọn lựa kỹ lưỡng về kích thước, màu sắc và độ chín, đảm bảo không bị dập nát, sâu bệnh hay thối hỏng Sau khi lựa chọn, rửa quả bằng nước sạch và để khô tự nhiên.
- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Hóa Chất Nơi sản xuất
3 Thuốc thử Folin Ciocalteu Trung Quốc
10 Cao nấm men Trung Quốc
Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
STT Dụng cụ Nơi sản xuất
1 Bình tam giác Trung Quốc
5 Cốc đong có mỏ Trung Quốc
6 Bình định mức Trung Quốc
Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất
2 Cân phân tích có độ chính xác 0,001g Trung Quốc
4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205 Trung Quốc
5 Tủ lạnh Samsung Việt Nam
7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200 Trung Quốc
8 Nồi hấp thanh trùng paster Nhật Bản
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol
Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.
Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
Nội dung nghiên cứu
N ộ i dung 1 : Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
N ộ i dung 2: Nghiên c ứ u l ự a ch ọ n m ộ t s ố thông s ố tách chi ế t polyphenol thích h ợ p
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp
- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp
- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
N ộ i dung 3: T ối ưu hóa điề u ki ệ n chi ế t polyphenol trên dung môi đã chọ n
N ộ i dung 4 : Đánh giá hoạ t tính sinh h ọ c c ủ a ch ế ph ẩ m polyphenol và ứ ng d ụ ng b ả o qu ả n th ức ăn chăn nuôi giàu chấ t béo
- Đánh giá khảnăng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
N ộ i dung 5: Hoàn thi ệ n quy trình d ự a trên các thông s ố công ngh ệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
Phương pháp phân tích
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
3.4.2 Xác định hàm lượ ng polyphenol t ổ ng s ố
Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết bã quả ổi đào được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh Cụ thể, dịch chiết bã quả ổi đào được pha loãng, sau đó 0,1 ml dịch chiết pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất, tiếp theo thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và 2,5 ml Na2CO3 7,5% Hỗn hợp này được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm bằng máy quang phổ kế Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn, và hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (GAE) trên 1g chất khô (DW) hay mg GAE/g DW.
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)
- K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)
- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
- w là độ ẩm của mẫu (%)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ bã qu ả ổi đào
- Cần chuẩn độ 2 - 3 mẫu trong cùng điều kiện
Để đảm bảo độ chính xác trong phân tích, cần thực hiện chuẩn độ một mẫu trắng song song bằng cách thay thế 5ml dung dịch mẫu thử bằng 5ml nước cất Nếu kết quả của mẫu trắng vượt quá 0,1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N, điều này cho thấy hóa chất không tinh khiết và cần phải thay đổi hóa chất.
Tính chỉ số peroxit (PV), biểu thị bằng mili đương lượng (meq) ôxy hoạt động trên kilogam, sử dụng Công thức sau:
V là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng để xác định, tính bằng mililit (ml)
V0 là thể tích dung dịch natri thiosulfat chuẩn được sử dụng trong phép thử trắng, được đo bằng mililit (ml) Cthio là nồng độ của dung dịch natri thiosulfat, tính bằng mol trên lít (mol/l) M là khối lượng mẫu thử, được tính bằng gam (g).
F là nồng độ đường lượng gam của Na2S2O3
3.5.4 Phương pháp nghiên cứ u n ộ i dung 5: Hoàn thi ệ n quy trình thu d ị ch chi ế t t ừ bã qu ả ổi đào
- Tổng hợp và lựa chọn các chỉ tiêu sau khi phân tích
- Vẽ sơ đồ - thuyết minh quy trình tách chiết polyphenol từ bã qua ổi đào.
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan
Số liệu thu thập được đã được thống kê và xử lý bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, với ba biến và ba cấp độ Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Design-Expert 7.0.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
4.2.1 Kh ả o sát ảnh hưở ng c ủ a lo ạ i dung môi và n ồng độ c ủ a dung môi chi ết đế n hàm lượ ng polyphenol
Theo bảng 4.1, hàm lượng polyphenol thấp nhất là 36,87 mg GAE/g DW khi sử dụng dung môi meOH, trong khi dung môi nước và EtOH có hàm lượng polyphenol lần lượt là 37,19 mg GAE/g DW và 37,23 mg GAE/g DW, không có sự khác biệt về giá trị trung bình Do đó, chúng tôi đã chọn nước làm dung môi để hạn chế ô nhiễm, giảm công đoạn thu hồi dung môi và tiết kiệm chi phí tách chiết.
Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi
Bảng 4.1 Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau
Dung môi Hàm lượng polyphenol
4.2.2 Kh ả o sát ảnh hưở ng c ủ a t ỷ l ệ dung môi trên nguyên li ệ u đến hàm lượ ng polyphenol
Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol thu được Sử dụng lượng dung môi quá ít không đủ để chiết xuất các thành phần cần thiết, trong khi lượng dung môi quá nhiều sẽ gây lãng phí và tăng chi phí Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát tác động của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol và xác định tỷ lệ tối ưu cho quá trình chiết xuất, với kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào
Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượ ng polyphenol
Theo bảng 4.1, hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất là 36,87 mg GAE/g DW với dung môi meOH, trong khi nước và EtOH lần lượt có hàm lượng polyphenol là 37,19 mg GAE/g DW và 37,23 mg GAE/g DW Sự khác biệt về hàm lượng polyphenol giữa nước và EtOH không đáng kể, do đó, chúng tôi đã chọn nước làm dung môi để giảm thiểu ô nhiễm, tiết kiệm chi phí và đơn giản hóa quy trình thu hồi dung môi.
Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi
Bảng 4.1 Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau
Dung môi Hàm lượng polyphenol
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng
Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol thu được Nếu dung môi quá ít, không đủ để chiết xuất các hợp chất, trong khi dung môi quá nhiều sẽ gây lãng phí và tăng chi phí Nghiên cứu này nhằm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol và xác định tỷ lệ tối ưu cho quá trình chiết xuất, với kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol
Công thức Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW)
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α