ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Quả ổi đào chín 90% với vỏ màu xanh nhạt, mùi thơm và vị ngọt vừa phải được thu mua tại chợ Minh Phương, Việt Trì - Phú Thọ Những quả này được lựa chọn kỹ lưỡng về kích thước, màu sắc và độ chín, đảm bảo không bị dập nát, sâu bệnh hay thối hỏng Sau khi thu hoạch, quả được rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên.
- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm STT
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205
7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200
8 Nồi hấp thanh trùng paster
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào.
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol.
Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 : Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp
- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp
- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn là bước quan trọng để nâng cao hiệu suất chiết xuất Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol cho thấy tiềm năng ứng dụng trong việc bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo, giúp cải thiện chất lượng và kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm.
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
3.4.1 Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu
Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991
Sử dụng sức nóng để loại bỏ độ ẩm trong vật liệu, đồng thời bảo toàn tất cả các chất có trong đó Vì vậy, nhiệt độ sấy cần được điều chỉnh ở mức hợp lý, không quá cao cũng không quá thấp.
Nhiệt độ cao khiến độ ẩm bay hơi nhanh chóng, nhưng cũng có thể làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, đặc biệt là các chất dễ bay hơi, từ đó ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Khi nhiệt độ quá thấp, quá trình thoát hơi diễn ra chậm, dẫn đến việc kéo dài thời gian và làm biến đổi các chất Độ ẩm được xác định thông qua phương pháp sấy cho đến khi đạt khối lượng không đổi.
- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991
- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định
- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:
+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g
+ Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)
+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm
Lấy chén cân có khả năng chứa 10g mẫu, rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 105 độ C cho đến khi trọng lượng không thay đổi Sau đó, để chén nguội trong bình hút ẩm trong 20-25 phút trước khi tiến hành cân với độ chính xác cao.
- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu Cân tất cả ở cân phân tích một cách chính xác.
- Cho tất cả vào tủ sấy ở 105 0 C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng lượng không đổi.
- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác.
Cho mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ, sau đó lấy ra và để nguội trong bình hút ẩm trong khoảng 20-25 phút Tiến hành cân mẫu bằng cân phân tích cho đến khi trọng lượng ổn định.
Tính kết quả: Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức:
- W: Độ ẩm của thực phẩm (%).
- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g).
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết bã quả ổi đào được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh Dịch chiết bã quả ổi đào được pha loãng và trộn với nước cất, sau đó thêm thuốc thử Folin-Ciocalteu và Na2CO3 Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm bằng máy quang phổ kế Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn, và kết quả được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (GAE) trên 1g chất khô (DW) hay mg GAE/g DW.
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)
- K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)
- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
- w là độ ẩm của mẫu (%)
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Quả ổi đào chín 90% được thu hái, sau đó loại bỏ tạp chất, sâu bệnh và thối hỏng Sau khi rửa sạch và để khô tự nhiên, quả được xay lấy bã Bã ổi đào được chiết xuất bằng phương pháp trích ly với dung môi là nước, ở nhiệt độ 40°C trong 30 phút, với tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi là 1/10 (w/v) Dịch chiết thu được sẽ được xác định hàm lượng polyphenol.
3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.
Để tách chiết polyphenol từ bã ổi đào, trước tiên, ổi đào được thu hái, rửa sạch và xay nhỏ để thu được bã Sau đó, cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và sử dụng thiết bị rung lắc để tiến hành trích ly polyphenol bằng các dung môi như methanol, ethanol và nước Phương pháp này cần được thực hiện trong một khoảng thời gian nhất định để đạt hiệu quả tối ưu.
Quá trình chiết diễn ra trong 30 phút với cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ 40 oC Sau khi hoàn tất, dịch chiết được ly tâm ở 4 oC với tốc độ 5000 rpm, sau đó tiếp tục lọc để thu được dịch chiết trong có màu hồng phớt nhẹ.
Thí nghiệm 1 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng trích ly, sử dụng ba loại dung môi khác nhau: nước (H₂O), methanol (CH₃OH) 60 độ và ethanol (C₂H₅OH) 60 độ Để đánh giá tác động của các dung môi này, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm đã được xác định.
Cân 4g (Bã ổi đào) Trích ly ở các loại dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol, với 4 công thức được thiết lập và thực hiện lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa trên kết quả phân tích chỉ tiêu, chúng tôi đã lựa chọn nồng độ dung môi chiết tối ưu Kết quả từ thí nghiệm 2 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhằm đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ này đến khả năng chiết Bố trí thí nghiệm sẽ được thực hiện theo công thức đã định.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2 Nhiệt độ tách chiết 40 0 C
Thời gian tách chiết 30 phút
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol.
Dựa trên kết quả phân tích, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tách chiết tối ưu đã được xác định Kết quả từ thí nghiệm 3 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm kế tiếp.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết nhằm đánh giá tác động của thời gian đến khả năng chiết Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo công thức cụ thể để thu thập dữ liệu chính xác.
Trích ly ở các khoảng thời gian
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết nhằm đánh giá tác động của nhiệt độ đến khả năng chiết Thí nghiệm được bố trí theo một công thức cụ thể để thu thập dữ liệu chính xác.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nhiệt độ
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào
Sau khi khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã xác định ba yếu tố A, B, C có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong bã ổi đào Để đánh giá khả năng ảnh hưởng của các yếu tố này, chúng tôi áp dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Benhken với ba yếu tố và ba cấp độ.
Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Ma trận thực nghiệm Box-Behnken bao gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với ba mức độ: +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình) Trong số này, có 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm với tất cả các yếu tố đều ở mức 0, như được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào
Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả hàm lượng polyphenol là cao nhất.
3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
3.5.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS
Năm 2002, với một số điều chỉnh nhỏ, khoảng 30 àl đến 120 àl dịch chiết được trộn với nước cất để đạt tổng thể tích 3 ml Sau đó, thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối trong 30 phút Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức đã đề ra.
- ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết
- ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Giá trị IC50 được báo cáo là nồng độ của dịch chiết có khả năng khử 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện xác định Một giá trị IC50 thấp cho thấy hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao hơn Mỗi phân tích được thực hiện ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình.
3.5.3.2 Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan.
Các số liệu thu thập được đã được thống kê và xử lý bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, với ba biến và ba cấp độ Quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện trên phần mềm Design-Expert 7.0.