Mục đích nghiên cứu
- Tách chiết polyphenol từ bã quảổi đào sau khi sản xuất nước ép ổi đào
- Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết và hướng tới ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.
Yêu cầu
- Đánh giá được thành phần nguyên liệu ban đầu
- Nghiên cứu lựa chọn được một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Tối ưu hóa được điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn
Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol là rất quan trọng, đặc biệt trong việc thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của nó Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng dịch chiết polyphenol để bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo, nhằm nâng cao chất lượng và độ an toàn của sản phẩm.
- Hoàn thiện được quy trình tách chiết dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Giới thiệu về cây ổi
Đặc điểm phân bố và sinh thái
Ổi là một loại cây ăn quả quan trọng tại Việt Nam, được trồng phổ biến ở cả vùng đồng bằng và miền núi, nhưng không xuất hiện ở những khu vực cao trên 1500m Có khoảng 7 - 10 giống ổi khác nhau, cây này ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, cho hoa và quả hàng năm.
Hình 2.3 a) Quảổi ruột đỏ b) Quảổi ruột trắng
Thành phần hóa học của quả ổi bao gồm: Flavonoid, tanin, tinh dầu, vitamin
-Flavonoid: Trong cả quả xanh và chín đều có quercetin, leucocyanidin, mecocyanidin, guajavarin [19]
-Tanin: Với hàm lượng cao khi quả còn xanh và thấp hơn khi quả chín, cũng thuộc loại pyrogalol với cả arabio ester của acid ellagic, acid gallic, [4]
-Tinh dầu: β-carophylen (24,1%), nerolidol (17,3%), 3-phenyl acetat (5,3%), carophyllen oxid (5,1%) [20]
Quả ổi là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, với thành phần hóa học ấn tượng được phân tích tại Ấn Độ Theo nghiên cứu, quả ổi chứa 81,7% nước, 0,9% protein, 0,3% chất béo, 5,2% chất xơ, và 11,2% carbohydrate chủ yếu dưới dạng đường khử Ngoài ra, nó còn cung cấp các hợp chất vô cơ như canxi, magiê, axit oxalic, photpho, sắt, natri, đồng, sulfua, cũng như các vitamin thiết yếu như thiamin, riboflavin, axit nicotinic và vitamin C.
+ Hàm lượng vitamin C trong quả ổi gấp 4 - 10 lần quả chanh, chúng thay đổi khá nhiều, trung bình từ 100 - 1000mg/100g, nhiều nhất ở phần vỏ quả rồi đến phần cùi [4]
+ Hạt ổi chiếm 6 - 12% trọng lượng quả và có khoảng 14% một chất dầu béo có mùi thơm [4]
2.1.4 Ho ạ t tính sinh h ọ c và công d ụ ng Ổi không chỉ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng mà còn giống như một loại thuốc dân gian được sử dụng rộng rãi ở các khu vực cận nhiệt đới trên toàn thế giới [21] Người ta biết rằng ổi thường được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, hạ sốt, kiết lỵ, viêm dạ dày ruột, tăng huyết áp, tiểu đường, sâu răng, giảm đau
Quả ổi nổi bật với khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ và chứa nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe, bao gồm các hợp chất chống ung thư và chống oxy hóa Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự chỉ ra rằng vỏ, hạt và bã của quả ổi chứa các hợp chất quý giá như axit Gallic, galangin, kaempferol, homogentisic acid và cyanidin 3-glucoside.
Hoạt động chống tiêu chảy
Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu phổ biến, ảnh hưởng đến cả các quốc gia phát triển Hàng năm, ước tính có khoảng 2,2 triệu ca tử vong do tiêu chảy, trong đó phần lớn là trẻ em và trẻ sơ sinh.
Quả ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy do độc tố E coli hoặc S aureus theo nghiên cứu của Vieira RHSF và cộng sự [24]
Chiết xuất từ quảổi có khả năng chống tiêu chảy, được nghiên cứu bởi Ojewole J và cộng sự, cho thấy hiệu quả trong việc điều trị và phòng ngừa tình trạng này.
Chiết xuất từ quả ổi chứa phenol, một hợp chất quan trọng có tác dụng chống dị ứng và chống viêm, theo nghiên cứu của Denny C và cộng sự Ngoài ra, nghiên cứu của Roy CK cũng chỉ ra rằng chiết xuất từ quả ổi hiệu quả trong việc điều trị viêm gan và sản xuất huyết thanh.
Hoạt động chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các phân tử giúp làm chậm quá trình oxy hóa, ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do có thể gây hại cho tế bào Những gốc tự do này có liên quan đến sự phát triển của ung thư và nhiều bệnh lý khác Các chất chống oxy hóa phổ biến bao gồm beta-carotene, lycopene và vitamin.
C, E và A, polyphenol và một số chất khác Phản ứng oxy hóa là một trong những phản ứng phá hủy quan trọng nhất Các gốc tự do gây ra rất nhiều rối loạn ở người như rối loạn thần kinh, ung thư, nhiễm virus Các gốc tự do này tác động gây ra các phản ứng oxy hóa qua nghiên cứu của Masuda T và cộng sự [28]
Quả ổi chứa nhiều chất chống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn chức năng não, viêm, bệnh tim, ung thư, xơ cứng động mạch và viêm khớp Trong số các chất chống oxy hóa, polyphenol và axit ascorbic là hai thành phần quan trọng nhất, trong đó polyphenol chủ yếu là flavonoid, thường tồn tại dưới dạng glycoside và ester.
Quả ổi có hàm lượng cao axit protocatechuic, quercetin, axit ferulic, axit ascorbic, quercetin, axit gallic và axit caffeic là những chất chống oxy hóa quan trọng [31, 32].
Hoạt tính sinh học và công dụng
Polyphenol là các hợp chất có cấu trúc phân tử chứa nhiều vòng Benzen và một hoặc nhiều nhóm Hydroxyl (OH -) Dựa vào đặc điểm cấu tạo hóa học, polyphenol được chia thành ba nhóm chính.
Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH Đại diện thường gặp:
- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:
Vallinin là một hợp chất có mùi thơm đặc biệt, tồn tại dưới dạng glycoside và được tìm thấy nhiều trong quả Nó được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp xà phòng và thực phẩm như một chất tạo hương.
- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi
- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao.
Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất
Polyphenol
Polyphenol là các hợp chất có cấu trúc phân tử chứa nhiều vòng Benzen và một hoặc nhiều nhóm Hydroxyl (OH -) Dựa vào đặc điểm cấu trúc hóa học, polyphenol được phân loại thành ba nhóm chính.
Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH Đại diện thường gặp:
- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:
Vallinin là một hợp chất có mùi thơm đặc biệt, tồn tại dưới dạng glycoside và thường được tìm thấy trong quả Hợp chất này được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp xà phòng và thực phẩm như một chất tạo hương.
- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi
- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao
Các hợp chất chứa vòng benzene kết hợp với chuỗi ba nguyên tử carbon được gọi là dẫn xuất phenyl propan Những hợp chất này rất phổ biến trong nhiều loại thực vật và thường mang lại hương thơm dễ chịu Một số đại diện tiêu biểu của chúng thường được gặp trong tự nhiên.
+ Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6 (flavonoids)
Flavonoids là nhóm sắc tố thực vật phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu cho nhiều loại hoa quả Ngoài ra, flavonoid còn là nhóm hoạt chất thiết yếu trong dược liệu, được phân lập và phân loại dựa trên cấu trúc hóa học của chúng.
Flavanol, hay còn gọi là flavan-3-ol, catechin và galocatechin, là một thành phần quan trọng trong hợp chất tanin, có mặt trong nhiều loại trái cây, trà xanh, rượu đỏ và socola (Yang et al., 2001) Các hợp chất như gallocatechin, epigallocatechin và epigallocatechin gallate cũng được tìm thấy trong các loại hạt họ đậu và chè (Arts et al., 2000a; Arts et al., 2000b).
Flavon là một hợp chất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là trong tỏi, hành, chè và dâu tây, với màu vàng và thường tồn tại dưới dạng glycoside, chủ yếu là flavonol Flavonol có nhiều dạng glycoside khác nhau, trong đó Kampherol và Quercetin là hai loại thường gặp Sự hình thành flavonols glycosides phụ thuộc vào hoạt động của ánh sáng, do đó chúng chủ yếu xuất hiện ở lá và vỏ quả.
Anthocyanin là các hợp chất sắc tố quan trọng trong hoa quả, mang lại màu đỏ, tím, xanh dương và vàng cho nhiều loại thực vật Chúng là các glycoside, trong đó phần aglucon là anthocyanidin Các anthocyanin hòa tan trong nước, trong khi anthocyanidin thì không Một điểm cần lưu ý là trong cấu trúc của anthocyanidin, nguyên tử oxy trong vòng pyran có hóa trị tự do, nhưng chưa xác định chắc chắn nguyên tử nào, oxy hay carbon, mang điện tích dương tự do, do đó cấu trúc của anthocyan thường được biểu diễn bằng công thức trung hòa.
Anthocyanidin có khả năng tồn tại dưới dạng cation trong môi trường acid và anion trong môi trường kiềm nhờ vào điện tích dương tự do, cho phép nó tạo muối với cả acid và base.
Trạng thái tích điện của Anthocyan thay đổi theo pH môi trường, dẫn đến sự biến đổi màu sắc Các muối cation của Anthocyan thường có màu đỏ với các sắc thái như vàng nhạt, tím và xanh nhạt, trong khi các muối anion lại có màu xanh Hiện tượng nhiều hoa thực vật màu hồng chuyển sang màu xanh khi được luộc chín chứng tỏ sự thay đổi pH của dịch tế bào theo hướng kiềm.
Antocyanidin được chia thành 3 nhóm nhỏ, đó là: Pelargonidin, cyanidin, delphinidin, ngoài ra còn gặp apigenidin
Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa- khử, phản ứng cộng và ngưng tụ
- Phản ứng oxy hóa-khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon
- Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tướng ứng
- Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen.
Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol
Theo Jovanovic (2000); Nicole (2001); Marfak (2003); Van Camp, (2005) trích dẫn bởi Chirinos Gallardo [12], cơ chế kháng oxi hoá của các chất phenol:
Cơ chế 1: Vô hoạt các gốc tự do
Polyphenol có cấu trúc vòng với các điện tử chuyển động liên tục trong các liên kết đôi, đóng vai trò như bẫy cho gốc tự do Gốc tự do là những nguyên tử hoặc phân tử có electron lớp ngoài không cặp đôi, khiến chúng có hoạt tính cao và dễ phản ứng với các phân tử như DNA và lipid màng, dẫn đến lão hóa và ung thư Khi gốc tự do tiếp xúc với polyphenol, chúng nhường electron không cặp đôi cho polyphenol và trở về trạng thái ổn định Electron không cặp đôi trong polyphenol bị "nhốt" và di chuyển giữa các vòng benzene mà không làm thay đổi cấu trúc của chúng.
Cơ chế 2: Tạo phức dạng chelat với các ion Fe2+ và Cu+
Polyphenol có khả năng ngăn chặn sự hình thành gốc tự do bằng cách "bắt giữ" các ion kim loại Các kim loại này, mặc dù có vai trò sinh lý quan trọng như vận chuyển oxy (sắt trong hemoglobin) và làm cofactor cho nhiều enzyme (sắt với catalase, đồng với superoxide dismutase), cũng có thể tạo ra gốc tự do Chúng có thể gây ra sự hình thành gốc tự do peroxide bằng cách cắt bỏ hydrogen của lipid hoặc tham gia vào phản ứng Fenton.
Thứ nhất, các ion kim loại có thể gây ra kích thích cắt bỏ hydrogen của lipid chưa bão hòa thành gốc lipid:
Các ion kim loại cũng có thể phân tách hydro thành dạng alkoxyl và gốc peroxyl, gây ra kích thích sự oxi hóa lipid:
Fe3+(Cu 2+ )+ ROOH → Fe 2+ (Cu + ) + ROO ● + H +
Fe2+(Cu + ) + ROOH → Fe 3+ (Cu 2+ ) + RO ● + OH ─
Các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss:
H2O2 + Fe 2+ (Cu + ) →°OH + OH - + Fe 3+ (Cu 2+ ) (Phản ứng Fenton)
Phản ứng Haber-Weiss diễn ra theo phương trình O2-° + H2O2 → °OH + OH- + O2, cho thấy rằng cấu trúc của flavonoid có khả năng tạo phức chelat bền với các ion kim loại, từ đó ngăn chặn sự hình thành gốc tự do do kim loại như Fe và Cu gây ra.
Cơ chế 3: Kìm hãm enzyme xanthine oxydase
Hoạt động của xanthine oxidase là một nguồn gốc tạo ra các gốc tự do Enzyme này xúc tác quá trình oxi hóa xanthine thành acid uric trong sự hiện diện của oxi, dẫn đến việc phân tử oxi nhận điện tử và chuyển đổi thành ion superoxide.
Xanthine + 2O2 + H2O xanthine oxydase Acid uric + 2O2° - + 2H +
Các flavonoid có cấu trúc vòng A tương tự như vòng purin của xanthine, được xem là chất ức chế cạnh tranh của xanthine oxidase, giúp ngăn chặn sự hình thành ion superoxide (Nicole, 2001).
Nhiều hợp chất phenol, đặc biệt là flavonoid, đã chứng minh khả năng chống oxi hóa và tác dụng bảo vệ cơ thể con người Chúng giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến, lão hóa, thoái hóa gan và tổn thương do bức xạ Flavonoid còn có tác dụng làm bền thành mạch, hỗ trợ trong các rối loạn chức năng tĩnh mạch, trĩ và rối loạn tuần hoàn võng mạc Bên cạnh đó, chúng cũng có khả năng chống độc và giảm thương tổn gan Nhiều flavonoid như flavon, flavanon và flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, được tìm thấy trong lá diếp cá và cây râu mèo.
Nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim
Hiện nay, các dược liệu và hoa quả giàu flavonoid đã được nghiên cứu và chiết xuất để sản xuất các sản phẩm tiện lợi như viên thuốc và thuốc nước.
G ố c t ự do, quá trình oxy hóa ch ấ t béo
Quá trình oxy hóa
Quá trình oxy hóa là một phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển giao cho chất oxy hóa, dẫn đến sự hình thành gốc tự do Những gốc tự do này có khả năng gây ra phản ứng dây chuyền, làm tổn hại tế bào sinh vật.
Bi ệ n pháp h ạ n ch ế quá trình oxy hóa
Để hạn chế sự oxi hóa, một số biện pháp sau thường được sử dụng:
- Loại bỏ oxi trong thực phẩm bằng cách đóng gói chân không hoặc sử dụng glucose-oxidase
Để bảo quản thực phẩm hiệu quả, cần giữ ở nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng, giúp giảm tốc độ oxi hóa Tuy nhiên, phương pháp này không hiệu quả với các loại trái cây và rau củ có chứa lipoxygenase Việc ngăn ngừa hư hỏng thực phẩm chỉ có thể đạt được thông qua quá trình xử lý nhiệt.
Để bảo quản dầu mỡ hiệu quả, việc bổ sung các chất chống oxi hóa là rất quan trọng Những chất này không chỉ giúp loại bỏ các gốc tự do mà còn hạn chế sự phân hủy hydroperoxide thành các sản phẩm thứ cấp Các chất chống oxi hóa phổ biến như vitamin E, BHA, và BHT thường được sử dụng Ngoài ra, các chất chống oxi hóa tự nhiên như polyphenol và carotenoid cũng đang được nghiên cứu để ngăn ngừa quá trình oxi hóa trong dầu mỡ.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5]
Loại dung môi
Dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết polyphenol từ thực vật, với độ phân cực của nó ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các hợp chất phenol, từ đó tác động đến hiệu suất chiết tách Lựa chọn dung môi không chỉ ảnh hưởng đến quá trình chiết mà còn trực tiếp liên quan đến công đoạn tinh sạch dịch chiết Do đó, việc chọn dung môi thường dựa trên hai tiêu chí chính: loại chất cần tách và sự thuận tiện cho quá trình tinh sạch sau này.
Mỗi loại chất phenolic có tính chất hòa tan khác nhau, do đó, chúng cần các dung môi chiết khác nhau Các phenolic có glicosid hóa thường tan nhiều trong nước, vì vậy nước và hỗn hợp nước với methanol, ethanol hoặc aceton là những dung môi phổ biến Ngược lại, các phenolic ít phân cực như isoflavones và flavanones thường hòa tan tốt hơn trong các dung môi không có nước Đặc biệt, aceton và methanol là những dung môi lý tưởng để chiết xuất flavanol, trong khi methanol là lựa chọn tốt nhất cho việc chiết xuất catechin.
Tỷ lệ dung môi trên nước
Polyphenol là nhóm hợp chất đa dạng, tồn tại dưới dạng tự do hoặc glycosid Để tách polyphenol glycoside, nước thường được thêm vào dung môi Tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau giữa các nguyên liệu, do đó cần xác định tỷ lệ dung môi/nước phù hợp để tối ưu hiệu quả chiết và giảm chi phí.
Th ờ i gian chi ế t
Thời gian chiết là yếu tố quyết định đến hiệu suất thu hồi polyphenol và chất lượng dịch chiết Nếu thời gian chiết quá ngắn, hiệu suất thu hồi sẽ thấp, trong khi thời gian chiết quá dài có thể dẫn đến hiện tượng oxi hóa polyphenol, làm giảm hiệu quả sử dụng thiết bị Thời gian chiết có thể dao động từ 1 phút đến 24 giờ (Shahidi & Nack, 2004).
Nhiệt độ chiết
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất polyphenol, ảnh hưởng đến hiệu suất, chi phí và chất lượng dịch chiết Nhiệt độ cao giúp giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và cải thiện hiệu suất trích li Tuy nhiên, chiết xuất ở nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến chi phí ổn nhiệt tăng và nguy cơ giảm chất lượng dịch chiết do phản ứng nâu hóa.
Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
Trên thế giới
- Theo nghiên cứu của Lilis Sukeksi và Maya Sarah, “Đặc tính và tách chiết polyphenol từ bã ổi đào”, sử dụng những phương pháp:
+ Xác định trọng lượng khô: bằng cách thông qua sự bốc hơi của nước trong bã ổi
+ Phân tích quercetin: bằng máy đo quang phổ
+ Xác định hàm lượng Axit Galic bằng: phương pháp đo màu Folin quy Ciocalteau + Xác định lượng tanin bằng: phương pháp chuẩn độ
+ Phân tích Apigenin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
Kết quả thu được từ nghiên cứu trên:
Bã ổi đào sau khi chiết xuất polyphenol có trọng lượng khô đạt 28,42%, với hàm lượng chất chống oxy hóa polyphenol gồm: 0,40 mg/100g quercetin, 8,70 mg/100g axit gallic, 62,60 mg/100g tanin, và không phát hiện apigenin Nghiên cứu đã thử nghiệm bốn dung môi hữu cơ và nước để chiết xuất hợp chất polyphenol từ bã ổi đào sau chế biến nước ép Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng của bã ổi đạt 9,59 mg/100g, với hàm lượng polyphenol tổng cao nhất thu được khi sử dụng metanol, và cao thứ hai khi dùng nước làm dung môi.
Hàm lượng polyphenol cao nhất đạt được từ hỗn hợp metanol và nước với tỷ lệ tối ưu là 60% metanol/nước, tiếp theo là 50% metanol/nước Biến thể trong tổng hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào điều kiện và nồng độ của dung môi Đặc biệt, hàm lượng polyphenol tổng cao nhất khi sử dụng tỷ lệ 1g bã còn lại trong 25ml dung dịch metanol/nước 60%.
180 phút được chọn là thời gian lý tưởng để tách chiết polyphenol
Seokwon Seo, Soojung Lee, Marcus L Elam, Sarah A Johnson, Jonghoon Kang và Bahram H Arjmaandi đã tiến hành nghiên cứu nhằm xác định dung môi chiết xuất tối ưu từ lá ổi, mang lại hiệu quả chống oxy hóa cao Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp khoa học hiện đại để đạt được kết quả chính xác và đáng tin cậy.
+ Xét nghiệm hàm lượng hợp chất Phenolic bằng phương pháp: Folin Ciocalteu + Xét nghiệm hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp của Moreno
+ Thử nghiệm khử gốc 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH)
+ Hoạt động của ABTS-Scavenging được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi Re et al
+ Hoạt tính khử gốc oxit nitric (NO) được đo bằng thuốc thử Greiss
Hoạt động quét nitrite được đánh giá thông qua độ hấp thụ tại bước sóng 520nm bằng máy quang phổ UV, theo phương pháp đã được Kato et al báo cáo.
Từ việc nghiên cứu trên họ đã thu được kết quả:
Hàm lượng hợp chất phenolic trong chiết xuất nước cao hơn so với chiết xuất ethanol và metanol tinh khiết Ngoài ra, chiết xuất hydroethanolic có hàm lượng hợp chất phenolic cao hơn so với chiết xuất nước Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hydroethanolic vượt trội hơn chiết xuất nước, đặc biệt là chiết xuất hydroethanolic 50% với hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất.
Trong nước
Nghiên cứu của Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn về “Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng” đã áp dụng các phương pháp tiên tiến nhằm nâng cao hiệu quả chiết xuất polyphenol.
+ Thu mẫu: từ những lá ổi già từ một cây ổi
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) đã được chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất polyphenol từ lá ổi, nhằm cải thiện hiệu quả chiết xuất và đạt được sản phẩm chất lượng cao.
+ Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo phương pháp của Singleton et al (1999)
+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khảnăng khử gốc tự do DPPH (được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh)
Nghiên cứu đã phát triển mô hình toán học để phân tích ảnh hưởng của bốn yếu tố chiết xuất (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol) đến hàm lượng polyphenol từ lá ổi xẻ Các điều kiện tối ưu để chiết polyphenol bao gồm dung môi ethanol 44,3%, nhiệt độ 90°C, thời gian 76,5 phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70/1 (ml/g) Dưới điều kiện tối ưu, hàm lượng polyphenol đạt 233,76 mg GAE/g chất khô và cho thấy hoạt tính chống oxi hóa cao với giá trị IC50 là 2,1 μg/ml trong thử nghiệm DPPH Những phát hiện này mở ra tiềm năng sử dụng lá ổi xẻ như một nguồn chiết xuất chất chống oxi hóa tự nhiên trong ngành thực phẩm chức năng.
Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu
Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Quả ổi đào chín 90% có vỏ màu xanh nhạt, tỏa hương thơm và vị ngọt vừa phải, vẫn giữ được độ cứng mà chưa bị mềm Những quả này được thu mua tại chợ Minh Phương.
Quả được chọn lựa phải đồng đều về kích thước, màu sắc và độ chín, không có dấu hiệu dập nát, sâu bệnh hay thối hỏng Sau khi lựa chọn, rửa quả bằng nước sạch và để khô tự nhiên.
- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Hóa Chất Nơi sản xuất
3 Thuốc thử Folin Ciocalteu Trung Quốc
10 Cao nấm men Trung Quốc
Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
STT Dụng cụ Nơi sản xuất
1 Bình tam giác Trung Quốc
5 Cốc đong có mỏ Trung Quốc
6 Bình định mức Trung Quốc
Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất
2 Cân phân tích có độ chính xác 0,001g Trung Quốc
4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205 Trung Quốc
5 Tủ lạnh Samsung Việt Nam
7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200 Trung Quốc
8 Nồi hấp thanh trùng paster Nhật Bản
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol
Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol.
Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
Nội dung nghiên cứu
N ộ i dung 1 : Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
N ộ i dung 2: Nghiên c ứ u l ự a ch ọ n m ộ t s ố thông s ố tách chi ế t polyphenol thích h ợ p
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp
- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp
- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
N ộ i dung 3: T ối ưu hóa điề u ki ệ n chi ế t polyphenol trên dung môi đã chọ n
N ộ i dung 4 : Đánh giá hoạ t tính sinh h ọ c c ủ a ch ế ph ẩ m polyphenol và ứ ng d ụ ng b ả o qu ả n th ức ăn chăn nuôi giàu chấ t béo
- Đánh giá khảnăng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
N ộ i dung 5: Hoàn thi ệ n quy trình d ự a trên các thông s ố công ngh ệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
Phương pháp phân tích
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
3.4.2 Xác định hàm lượ ng polyphenol t ổ ng s ố
Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết bã quả ổi đào được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh nhỏ Cụ thể, dịch chiết bã quả ổi đào được pha loãng đến tỷ lệ nhất định, sau đó 0,1 ml dịch chiết pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất, rồi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5% Hỗn hợp này được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm bằng máy quang phổ kế Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn, và hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (GAE) trên 1g chất khô (DW) hay mg GAE/g DW.
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)
- K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)
- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
- w là độ ẩm của mẫu (%)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ bã qu ả ổi đào
- Cần chuẩn độ 2 - 3 mẫu trong cùng điều kiện
Chuẩn độ một mẫu trắng song song bằng cách thay 5ml dung dịch mẫu thử bằng 5ml nước cất Nếu kết quả của mẫu trắng vượt quá 0,1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N, cần phải thay đổi hóa chất do không đảm bảo độ tinh khiết.
Tính chỉ số peroxit (PV), biểu thị bằng mili đương lượng (meq) ôxy hoạt động trên kilogam, sử dụng Công thức sau:
V là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat dùng để xác định, tính bằng mililit (ml)
V0 là thể tích dung dịch natri thiosulfat chuẩn sử dụng trong phép thử trắng, được đo bằng mililit (ml) Cthio biểu thị nồng độ của dung dịch natri thiosulfat, tính bằng mol trên lít (mol/l) M là khối lượng mẫu thử, được tính bằng gam (g).
F là nồng độ đường lượng gam của Na2S2O3
3.5.4 Phương pháp nghiên cứ u n ộ i dung 5: Hoàn thi ệ n quy trình thu d ị ch chi ế t t ừ bã qu ả ổi đào
- Tổng hợp và lựa chọn các chỉ tiêu sau khi phân tích
- Vẽ sơ đồ - thuyết minh quy trình tách chiết polyphenol từ bã qua ổi đào.
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan
Các số liệu thu thập được đã được thống kê và xử lý bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, với ba biến ở ba cấp độ khác nhau Quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện trên phần mềm Design-Expert 7.0.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
4.2.1 Kh ả o sát ảnh hưở ng c ủ a lo ạ i dung môi và n ồng độ c ủ a dung môi chi ết đế n hàm lượ ng polyphenol
Theo bảng 4.1, hàm lượng polyphenol thấp nhất là 36,87 mg GAE/g DW khi sử dụng methanol (meOH), trong khi nước đạt 37,19 mg GAE/g DW và ethanol (EtOH) cao nhất với 37,23 mg GAE/g DW Sự khác biệt về hàm lượng polyphenol giữa nước và EtOH không đáng kể, do đó, chúng tôi đã chọn nước làm dung môi để giảm ô nhiễm, tiết kiệm chi phí và đơn giản hóa quy trình tách chiết.
Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi
Bảng 4.1 Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau
Dung môi Hàm lượng polyphenol
4.2.2 Kh ả o sát ảnh hưở ng c ủ a t ỷ l ệ dung môi trên nguyên li ệ u đến hàm lượ ng polyphenol
Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol thu được Nếu dung môi sử dụng quá ít, sẽ không đủ để hòa tan và chiết xuất các thành phần, chỉ làm ướt nguyên liệu Ngược lại, nếu sử dụng quá nhiều dung môi, sẽ dẫn đến lãng phí và tăng chi phí Do đó, thí nghiệm được thực hiện nhằm khảo sát tác động của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol, từ đó xác định tỷ lệ tối ưu cho quá trình chiết xuất, với kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào
Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượ ng polyphenol
Theo bảng 4.1, hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất là 36,87 mg GAE/g DW khi sử dụng methanol (meOH), trong khi hàm lượng polyphenol cao thứ hai là 37,19 mg GAE/g DW với dung môi nước, và cao nhất là 37,23 mg GAE/g DW với ethanol (EtOH) Sự khác biệt về giá trị trung bình giữa dung môi nước và EtOH là không đáng kể, do đó, chúng tôi đã chọn nước làm dung môi để giảm thiểu ô nhiễm, tối ưu hóa quy trình thu hồi dung môi và tiết kiệm chi phí tách chiết.
Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi
Bảng 4.1 Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau
Dung môi Hàm lượng polyphenol
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng
Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol thu được Nếu dung môi quá ít, không đủ để hòa tan và chiết xuất các hợp chất, trong khi dung môi quá nhiều sẽ gây lãng phí và tăng chi phí Thí nghiệm được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol, từ đó xác định tỷ lệ tối ưu cho quá trình chiết xuất, với kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol
Công thức Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW)
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α