MỞ ðẦU
ðẶT VẤN ðỀ
Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp, với khoảng 70% dân số sống bằng nghề nông, trong đó chăn nuôi đang trở thành mũi nhọn phát triển kinh tế nông nghiệp Tuy nhiên, chăn nuôi nhỏ lẻ và thiếu quy hoạch đã dẫn đến ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, chủ yếu từ chất thải rắn, chất thải lỏng, bụi, tiếng ồn và xác động vật Ô nhiễm môi trường không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, tăng tỷ lệ mắc bệnh và chi phí điều trị, từ đó giảm năng suất và hiệu quả kinh tế Do đó, xử lý chất thải chăn nuôi là vấn đề cấp bách để bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững Các chế phẩm sinh học như EM, EMUNI và EMINA thường được sử dụng để xử lý ô nhiễm trong chăn nuôi.
Công nghệ Vi sinh vật hữu hiệu (Effective Microorganisms - EM) đã được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới trong nhiều lĩnh vực như trồng trọt, chăn nuôi, nuôi trồng thủy hải sản, xử lý môi trường, xây dựng, công nghiệp và y học từ những năm 1980 Tại Việt Nam, chế phẩm EM cũng đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kể từ năm 1994-1995.
Hiện nay, ngoài các chế phẩm EM nhập khẩu, nhiều loại chế phẩm sinh học được nghiên cứu và chế tạo dựa trên nguyên tắc hoạt động và phối chế của chế phẩm EM đã xuất hiện, như EMUNIV của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và EMINA của Viện Sinh học Nông nghiệp Đại học Nông nghiệp Hà Nội Chế phẩm EMINA có chất lượng tương đương với chế phẩm EM nhập khẩu và đã được thử nghiệm, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chăn nuôi, trồng trọt, thủy sản và xử lý ô nhiễm môi trường.
EMINA, the effective microorganisms developed by the Institute of Agrobiology, is a blend of beneficial microbial species, including various groups of bacteria.
Bacillus, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn Lactic, nấm men và xạ khuẩn là những vi sinh vật sống cộng sinh trong cùng môi trường Các vi sinh vật trong chế phẩm EMINA có cơ chế tác động khác nhau nhưng đều nhằm mục đích làm lệch cân bằng giữa vi sinh vật có ích và vi sinh vật gây hại trong đất, nước, vật nuôi, cây trồng và môi trường Kết quả là tăng khả năng ủng hộ, sức đề kháng, sự sinh trưởng của vật nuôi và cây trồng, đồng thời làm trong lành môi trường Chế phẩm này đã được Bộ NN&PTNT công nhận là tiến bộ kỹ thuật, phù hợp để áp dụng rộng rãi trong sản xuất.
Việc sử dụng chế phẩm sinh học EMINA trong xử lý chất thải chăn nuôi mang lại nhiều lợi ích như an toàn cho vật nuôi, người chăn nuôi và thân thiện với môi trường Tuy nhiên, EMINA hiện chỉ có dạng dung dịch, gây khó khăn trong vận chuyển và ứng dụng cho các chất thải nhão Do đó, nghiên cứu chế tạo chế phẩm dạng bột là cần thiết để nâng cao hiệu quả và tính tiện lợi trong sử dụng Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột phục vụ xử lý ô nhiễm môi trường chăn nuôi.”
MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU
Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thành công chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột phục vụ xử lý ô nhiễm môi trường chăn nuôi
- Tuyển chọn ủược cỏc chủng vi sinh vật cú hoạt tớnh phõn giải xenlulose, protein, tinh bột mạnh (bao gồm: vi khuẩn Bacillus, nấm men, xạ khuẩn, nấm Trichorderma)
- Xỏc ủịnh ủược mụi trường lờn men xốp thớch hợp với từng nhúm vi sinh vật
Để đạt được mật độ và hoạt tính tối ưu của vi sinh vật, cần xác định tỷ lệ phối trộn chính xác giữa các nhúm vi sinh vật trong quá trình tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột.
- Bước ủầu ủỏnh giỏ hiệu quả xử lý ụ nhiễm mụi trường của chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột ủó chế tạo
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Bổ sung các dẫn liệu khoa học trong nghiên cứu vi sinh vật là cần thiết để xác định và phát hiện thêm nhiều nhúm cũng như các chủng vi sinh vật hữu ích cho nông nghiệp Những nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp mà còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.
- Tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột có hiệu quả cao, giá thành rẻ, gúp phần giải quyết ủề ụ nhiễm mụi trường trong chăn nuụi.
ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðối tượng, vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Các nhóm vi sinh vật : vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm Trichorderma
- Chế phẩm EMINA dung dịch ( Viện Sinh học Nông Nghiệp- Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội)
- Chế phẩm BIMA (Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh)
- Chế phẩm TRICAB (Trung tâm Sinh học Ứng dụng của Viện công nghệ sinh học và môi trường- Trường ðại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh)
3.1.3 Các loại hoá chất dùng cho nghiên cứu
- Cao nấm men (Yeast extract)
- Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh
- Mỏy ủo khớ NH 3 và H 2 S
- Kớnh hiển vi ủiện tử
- ðĩa petri, lamen, lam kính, chày, cối sứ.
Môi trường nghiên cứu
+ Môi trường MRS: phân lập vi khuẩn lactic
Môi trường Thành phần Số lượng (g/l)
+ Môi trường LB: phân lập vi khuẩn Bacillus
Môi trường Thành phần Số lượng (g/l)
+ Môi trường Hansen: phân lập nấm men
Môi trường Thành phần Số lượng (g/l)
+ Môi trường Gauze: phân lập xạ khuẩn
Môi trường Thành phần Số lượng (g/l)
+ Môi trường PDA: phân lập nấm Trichorderma
Môi trường Thành phần Số lượng (g/l)
Thời gian và ủịa ủiểm nghiờn cứu
- ðịa ủiểm: phũng thớ nghiệm VSV khoa Cụng nghệ sinh học- Viện sinh học nông nghiệp- Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.1.1 Thí nghiệm 1:Phân lập các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose, protein, tinh bột mạnh
- Cỏc chủng Lactic ủược phõn lập trờn mụi trường MRS từ cỏc mẫu dưa chua, sữa chua và nem chua Thanh Hóa
- Cỏc chủng Bacillus ủược phõn lập trờn mụi trường LB từ cỏc mẫu phõn hữu cơ và ủất
- Cỏc chủng nấm men ủược phõn lập trờn mụi trường HS từ cỏc mẫu mẻ và men rượu
- Cỏc chủng xạ khuẩn ủược phõn lập trờn mụi trường Gauze từ cỏc mẫu giỏ thể trồng nấm và thân lá cây mục
Các chủng nấm Trichoderma được phân lập trên môi trường PDA từ các mẫu chế phẩm BIMA tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và chế phẩm TRICAB từ Trung tâm Sinh học Ứng dụng của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.4.1.2 Thí nghiệm 2 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose, protein, tinh bột mạnh
Xỏc ủịnh khả năng sinh enzym của cỏc chủng Bacillus , xạ khuẩn, nấm Trichorderma bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
3.4.1.3 Thớ nghiệm 3: Xỏc ủịnh mụi trường lờn men xốp thớch hợp với từng nhúm vi sinh vật
Cỏc chủng Lactic, Bacillus, nấm men, xạ khuẩn ủược tiến hành trờn mụi trường bột mì và cám gạo với tỉ lệ theo các công thức sau
Chủng Trichoderma ủược nuụi trờn mụi trường trấu : cỏm gạo theo cỏc tỷ lệ CT1: 0.3 trấu : 0.7 cám
Bổ sung cỏc chủng sinh vật vào mụi trường xốp, sau ủú trộn ủều
Nuụi cấy ở nhiệt ủộ phũng
Các chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng vi sinh vật CFU/g chế phẩm và hoạt tính phân giải xellulose, protein, tinh bột sau 14 ngày
3.4.1.4 Thớ nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản ủến chế phẩm
Chỉ tiờu theo dừi: Mật ủộ vi sinh vật /g chế phẩm (CFU/g) và hoạt tớnh phân giải xellulose, protein, tinh bột
3.4.1.5.Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chế phẩm EMINA và chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột ủến kết quả xử lý chất ủộn chuồng
- Cụng thức 1 (ủối chứng): khụng sử dụng chế phẩm
- Công thức 2: sử dụng chế phẩm EMINA dạng dung dịch
- Công thức 3: sử dụng chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột
- Lượng phun chế phẩm EMINA dạng dung dịch với tỷ lệ pha loãng 1/100, lượng chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột dùng 1000gram /chuồng
-ðo nồng ủộ khớ H 2 S, NH 3 ở cỏc cụng thức xử lý khỏc nhau
Thời gian thay chất ủộn chuồng
Mùi chuồng – cảm quan ðộ hoai mục chất ủộn chuồng
3.4.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chế phẩm EMINA và chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột ủến kết quả xử lý phõn gia cầm
Tiến hành: Ủ phân gia cầm tại Bắc Ninh
+ Chuẩn bị ủống ủ: Phõn gia cầm ủược ủỏnh thành cỏc ủống ủ cú khối lượng 300kg/ủống
+ Bổ sung chế phẩm vào ủống ủ theo cỏc cụng thức:
CT2: phun dung dịch EMINA dạng dung dịch
CT3: rắc chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột
Trong quá trình ủ, dung dịch EMINA cần được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1/100 Đối với chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu dạng bột, tỷ lệ sử dụng là 100g cho 300kg nguyên liệu Sau khi ủ, dung dịch này sẽ được tưới đều lên bề mặt ủ.
- Yờu cầu của ủống ủ: ủộ ẩm ủạt 60 – 70% (khi nắm hoặc nộn ủống ủ thấy cú nước chảy ra ở kẽ tay hoặc nền sàn ủ)
- ðống ủ ủược ủúng vào cỏc tỳi bằng nilon ủể ủống ủ ủược ủ yếm khớ hoàn toàn
- Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
+ Thành phần phân gia cầm
+ Lấy ủất mặt, ủất từ 5-10 cm, lỏ mục dưới ủất
Lấy 10g ủất lỏ đã nghiền nhỏ, cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất Sau đó, lắc máy ở tốc độ 200 vòng/phút trong 20 phút Cuối cùng, thu lấy dịch lọc và pha loãng theo tỉ lệ 10-1.
+ Lắc ủều rồi hỳt 1ml dịch cho vào ống nghiệm ủựng 9ml nước cất, thu ủược dịch pha loóng 10 -2 Tiếp tục pha loóng ủến nồng ủộ 10 -3 , 10 -4 ;10 -5 , 10 -6
+ Dựng pipet hỳt 0.1 ml dịch pha loóng ở nồng ủộ 10 -5 , 10 -6 nhỏ lờn ủĩa petri cú mụi trường 1 Sau ủú, dựng que cấy trang ủều trờn bề mặt thạch
+ Lật ủĩa thạch, gúi trong giấy bỏo, nuụi ở nhiệt ủộ phũng từ 3-7 ngày
Tách các khuẩn lạc riêng rẽ và cấy chuyển cho đến khi đạt độ thuần khiết, sau đó chuyển sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm khác nhau.
3.4.2.2 Phương phỏp xỏc ủịnh hoạt tớnh enzym ngoại bào của Bacillus, xạ khuẩn và nấm Trichorderma sp
- Phương pháp: khuếch tán trên thạch bằng cách khoan lỗ, nhỏ dịch nuôi nấm vào cỏc lỗ khoan trờn ủĩa thạch cú chứa 1% cơ chất
Để chuẩn bị dịch enzym, các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dịch thể trên máy lắc trong 2 ngày đối với Bacillus và 4 ngày đối với xạ khuẩn với tốc độ 200 vòng/phút Chủng Trichoderma được nuôi trên môi trường thạch, sau đó thu bào tử và cho vào ống nghiệm chứa nước cất.
Sau khi ủ 15 phút ở nhiệt độ 25°C, dịch thể được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút Sau đó, sử dụng pipet để hút phần dịch trong ống và cho vào các lỗ khoan trên thạch có chứa 1% cơ chất.
+ Nhỏ thuốc thử ủể xỏc ủịnh khả năng phõn giải (protease bằng thuốc thử HgCl2; amylase, cellulase bằng thuốc thử lugol) và ủo vũng phõn giải
- Chỉ tiêu theo dõi: Vòng phân giải=D – d (mm)
Trong ủú: D là ủường kớnh vũng phõn giải d là ủường kớnh của lỗ khoan
- Phương phỏp xỏc ủịnh OC%: Walkley và Black
- Phương phỏp Kjeldhal xỏc ủịnh %N tổng số: phỏ bằng H 2 SO 4 và xỳc tỏc
- Phương phỏp so màu xỏc ủịnh %P 2 O 5 tổng số: cụng phỏ bằng H 2 SO 4 + HClO4
- Phương phỏp xỏc ủịnh % K 2 O tổng số: ủo bằng quang kế ngọn lửa, phỏ mẫu bằng HF + HClO 4
3.4.2.4.Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu thớ nghiệm ủược xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
