ðẶT VẤN ðỀ
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với sự đa dạng về điều kiện địa lý và khí hậu giữa các miền Hệ thống sông ngòi dày đặc tạo điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại và phát triển của nhiều loài thủy sản nước ngọt Vì vậy, nguồn lợi thủy sản nước ngọt của Việt Nam rất phong phú và đa dạng về thành phần loài Khu hệ thủy sản nước ngọt Việt Nam có giá trị cao trong việc phát triển kinh tế và bảo tồn sinh thái.
Miền Bắc Việt Nam có 544 loài cá, trong đó 226 loài chiếm 41,6% Trong số này, hơn 60 loài có giá trị kinh tế, nhiều loài quý hiếm và trên 30 loài có giá trị kinh tế cao, có khả năng xuất khẩu (Bộ Thủy sản, 1996).
Trong vài thập kỷ qua, nguồn lợi thủy sản ở Việt Nam đã suy giảm đáng kể về thành phần loài, năng suất và sản lượng do khai thác quá mức và sử dụng các phương pháp hủy diệt như thuốc nổ và kích điện Ô nhiễm môi trường từ chất thải sinh hoạt, công nghiệp và nông nghiệp cũng đang đe dọa đến sự sống còn của nhiều loài cá bản địa, trong đó có cá Nhưng Cá Nhưng, một loài cá có giá trị kinh tế và thịt thơm ngon, đang bị suy giảm nguồn lợi tự nhiên, cần được nghiên cứu và bảo vệ Loài cá này thường xuất hiện ở vùng trung và hạ lưu các sông lớn, cũng như các vùng nước ven sông nhỏ và đầm hồ ở miền Bắc Với khả năng ăn tạp và phát triển nhanh hơn cá diếc, cá Nhưng có thể nuôi trong ao và ruộng, do đó, nghiên cứu sinh học sinh sản của loài này là cần thiết để nâng cao năng suất và hiệu quả nuôi trồng thủy sản.
Xuất phỏt từ những lý do trờn, tụi tiến hành ủề tài “Nghiờn c ứ u m ộ t s ố ủặ c ủ i ể m sinh h ọ c sinh s ả n và kớch thớch sinh s ả n cỏ Nh ư ng (Carassioides cantonensis Heincke, 1892 )”
Luận văn này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài khoa học về nghiên cứu sản xuất giống và nuôi thương phẩm cá Nhưng (Carassioides cantonensis Heincke, 1892) tại Trung tâm Tư vấn thiết kế và Chuyển giao công nghệ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I.
Góp phần xây dựng cơ sở khoa học và thực tiễn phục vụ sản xuất giống nhân tạo cá Nhưng (Carassioides cantonensis Heincke, 1892)
Nghiờn cứu một số ủặc ủiểm sinh học sinh sản cỏ Nhưng
Thử nghiệm kích thích sinh sản nhân tạo cá Nhưng.
TỔNG QUAN CÁC VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU
Một số ủặc ủiểm sinh học của cỏ Nhưng
Giống cá Nhưng: Carassioides Oshima, 1926
Loài cá Nhưng: Carassioides cantonensis Heincke, 1892
Hình 1 Cá Nh ư ng Carassioides cantonensis
2.1.2 ðặ c ủ i ể m hỡnh thỏi và phõn b ố ðặ c ủ i ể m nh ậ n d ạ ng
Thân cỏ cao, dẹp bờn với viền lưng cong sõu và viền bụng thẳng Cỏn ủuụi ngắn và thúp lại, đầu lớn vừa phải với mừm ngắn tự và chiều rộng lớn Cỏ có 2 ủuụi râu: râu mõm ngắn và râu hàm phát triển hơn Mắt lớn, nổi cao với khoảng cách giữa hai mắt rộng, hơi lồi Lỗ mũi gần mắt hơn mõm, miệng ở mút mõm, hướng ngang và hình bán nguyệt Hàm dưới dài hơn hàm trên, rạch miệng không tới viền trước mắt Màng mang liền với eo mang, lược mang dài, mảnh và cứng, răng hầu mảnh, dài (Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân, 2001).
Vây lưng của cá có kích thước lớn, khởi điểm vây lưng nằm đối diện hoặc trước khởi điểm bụng một chút, với gốc vây lưng dài và viền sau hơi lõm Tia gai của vây lưng và vây hậu có cấu trúc cứng, phần sau có răng cưa Vây hậu có hình dáng sỏ và vây hậu mút gần như bằng nhau.
Vẩy cá tròn lớn Vẩy phần ngực nhỏ hơn ðường bên hoàn toàn, nằm giữa thân Ruột cá có chiều dài bằng 1,8 – 2,2 chiều dài thân
Cỏ cú lưng màu sẩm, bụng trắng bạc Võy hậu mụn ủỏ, gốc vàng
Vây lưng (D) = III – IV, 16 - 19; vây hậu môn (A) = III, 5; vây bụng (V) = 1, 7 - 8; vây ngực (P) = 1, 15 – 17; lược mang cung mang I: 42 – 46 Răng hầu 2 hàng: 2.4 – 4.2 hoặc 2.5 – 5.2 Vẩy ủường bờn 30– 33
Chiều dài thân (L0) = 2,3 – 3,6 chiều cao thân (H) = 3,5 – 3,7 chiều dài ủầu (T) = 1,9 – 2,0 khoảng cỏch trước võy lưng (daD)
Chiều dài ủầu (T) dao động từ 3,8 đến 4,2, trong khi chiều dài mừn (Ot) nằm trong khoảng 2,8 đến 3,2 Đường kính mắt (O) có giá trị từ 2,6 đến 3,1, và khoảng cách giữa hai mắt (OO) từ 1,5 đến 1,7 Chiều dài cán ủuụi (Lcd) được xác định từ 1,7 đến 2,0, còn chiều cao cỏn ủuụi (ccd) cũng được đề cập trong nghiên cứu của Nguyễn Văn Hảo và Ngụ Sỹ Vân vào năm 2001.
Cá Nhung phân bố rộng rãi tại các sông ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ Việt Nam, chủ yếu sống ở trung và hạ lưu của các sông lớn cũng như các sông nhỏ, vùng đồng bằng và hồ Một số con sông lớn nơi cá Nhung thường xuất hiện bao gồm sông Chảy (Yên Bái), sông Lô (Tuyên Quang) và sông Hồng (khu vực Việt Trì, Phú Thọ).
Thọ) và vùng hạ lưu sông Hồng Giới hạn phân bố thấp nhất về phía Nam của cá này là sông Ba - Nam Trung Bộ (Nguyễn Hữu Dực, 1995)
Trên thế giới, cá Nhưng phân bố ở phía Nam Trung Quốc (Quảng đông, Quảng Tây và đảo Hải Nam ) (Mai đình Yên, 1978; Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân, 2001)
Cỏ Nhưng phát triển mạnh mẽ ở các khu vực có nước chảy và nước ủng, nơi có chất nền là bùn cát Cá thường sinh sống và hoạt động chủ yếu ở tầng giữa và tầng đáy của môi trường nước để tìm kiếm thức ăn.
2.1.3 ðặ c ủ i ể m sinh tr ưở ng
Cỏ Nhưng có tốc độ tăng trưởng nhanh, với chiều dài đạt 107mm ở tuổi 1, 146mm ở tuổi 2 và 186mm ở tuổi 3 Trọng lượng của cỏ lớn nhất đạt từ 0,6 đến 0,8 kg/con Tuy nhiên, khi so sánh với các loài cá trong họ cá Chép, như cá Chép, Rohu và Mrigal, cá Nhưng có tốc độ tăng trưởng chậm hơn (Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân, 2001).
Cá Nhưng là loài cá ăn tạp, với chế độ ăn chủ yếu bao gồm rong (như rong tóc tiên, rong ủi chú), ấu trùng côn trùng, giun ớt tơ, động vật phù du và các mảnh vụn thực vật mục nát chìm dưới đáy nước.
Cá Nhưng, theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân (2001), sống và sinh sản trong các vùng nước tự nhiên Chúng bắt đầu sinh sản khi đạt chiều dài 110mm và khối lượng 50g trở lên, thường vào mùa sinh sản từ tháng 3 đến tháng 5 trong điều kiện thời tiết ấm áp Trứng có màu vàng xanh, kích thước từ 0,8 – 1,0mm, được dính vào thực vật thủy sinh hoặc các giá thể chìm Buồng trứng của cá thường chứa trứng ở nhiều giai đoạn khác nhau, cho phép cá có thể đẻ nhiều lần trong năm Sức sinh sản của cá Nhưng rất lớn, dao động từ 24.000 – 83.000 trứng hoặc 195 – 389 trứng/1g khối lượng cá, và phụ thuộc vào kích thước cá thể; cá càng lớn thì sức sinh sản càng cao.
Tình hình nghiên cứu ở trong nước và thế giới
2.2.1 Tình hình nghiên c ứ u trên th ế gi ớ i
Cỏ Nhưng là một loài cá đặc trưng của Nam Trung Quốc, bao gồm các tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây và đảo Hải Nam Nghiên cứu về cỏ Nhưng chủ yếu được thực hiện tại Trung Quốc, với nhiều tác giả như Nguyễn Điền Ngũ và Thập Cát (1943), Ngũ Hiến Văn (1963) đã đóng góp vào lĩnh vực này Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu hiện tại chủ yếu chỉ tập trung vào hình thái phân loại và các đặc điểm sinh học, trong khi tài liệu về sinh sản và nuôi thương phẩm của loài cá này vẫn còn hạn chế.
2.2.2 Tình hình nghiên c ứ u trong n ướ c
Cá Nhưng Carassioides cantonensis, còn gọi là cỏ Dưng hay cỏ Rưng, đã được nghiên cứu tại Việt Nam từ những năm 1978 bởi các tác giả như Mai Đình Yên, Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Hữu Dực, tập trung vào việc điều tra nguồn lợi và mô tả các đặc điểm phân loại cũng như giới hạn phân bố của loài này Nghiên cứu tiếp theo của Nguyễn Văn Hảo và Ngụ Sỹ Vọng vào năm 2001 đã bổ sung thêm thông tin về các đặc điểm sinh học và sinh sản của cá Nhưng trong môi trường tự nhiên.
Cá Nhưng là loài cá có giá trị kinh tế cao với thịt ngon và sản lượng dồi dào, nhưng hiện đang đối mặt với nguy cơ suy giảm nguồn lợi, do đó cần được bảo vệ và phát triển bền vững Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương phẩm cá Nhưng Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học sinh sản và kích thích sinh sản nhân tạo của cá Nhưng là rất cần thiết, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất giống nhân tạo cho loài cá này.
Một số vấn ủề chung về sinh học sinh sản ở cỏ
Nghiên cứu về đặc điểm sinh học sinh sản là rất quan trọng cho việc sản xuất giống nhân tạo cá Để có cơ sở khoa học vững chắc, cần tìm hiểu về sự phát triển của tuyến sinh dục, tế bào sinh dục, quá trình thụ tinh và sự phát triển phôi của cá.
2.3.1 S ự phát tri ể n tuy ế n sinh d ụ c và t ế bào sinh d ụ c
2.3.1.1 Sự phát triển tuyến sinh dục và tế bào sinh dục cái
* Sự phát triển của tế bào sinh dục cái
Tế bào sinh dục cái, hay còn gọi là trứng, là một trong những tế bào hoàn hảo với khả năng phát triển thành một cơ thể mới Trứng phát triển gần như độc lập nhờ vào lượng chất dự trữ lớn trong noãn hoàng, cung cấp nguyên liệu cần thiết cho sự phát triển sau này Trứng có thể có màu xanh nhạt, vàng nhạt, da cam hoặc màu đỏ Theo nghiên cứu của Nguyễn Tường Anh (1999), trứng có cấu trúc đặc biệt, khi thành thục, noãn hoàng sẽ dồn về cực thực vật, trong khi nhân và tế bào chất di chuyển về cực động vật Nghiên cứu mô học đã chia sự phát triển của trứng thành 5 giai đoạn dựa trên kích thước và cấu tạo của chúng.
Giai đoạn I là giai đoạn trứng còn non, chỉ là những noón nguyên bào trong quá trình sinh trưởng và biến đổi Trong giai đoạn này, kích thước tế bào nhỏ và tỷ lệ giữa nhân và tế bào chất lớn.
- Giai ủoạn II: Noón bào vẫn tiếp tục tăng trưởng về nguyờn sinh chất, cuối giai ủoạn này là sự kết thỳc sinh trưởng về nguyờn sinh chất
Giai đoạn III của sự phát triển noãn bào diễn ra trong giai đoạn tạo noãn hoàng, trong đó kích thước tế bào tăng nhanh nhờ sự tích lũy chất dinh dưỡng, với nhân tế bào nằm ở chính giữa Kết thúc giai đoạn này, tế bào trứng hoàn thành quá trình tích lũy chất noãn hoàng và đạt kích thước tối đa Sự phát triển của noãn bào ở giai đoạn III chịu ảnh hưởng trực tiếp từ hormone tuyến yên; nếu cắt bỏ tuyến yên, sẽ không có sự hình thành noãn hoàng ở cá Sau khi kết thúc giai đoạn này, sự phát triển của noãn bào có thể bị tạm ngừng trước khi chuyển sang giai đoạn thành thục hoàn toàn.
Giai đoạn IV là giai đoạn kéo dài trong suốt quá trình di chuyển của nhân noãn bào từ trung tâm ra ngoại biên, được gọi là quá trình cực hóa Kết quả của quá trình này là sự phân cực của noãn bào, trong đó cực chứa túi mầm được xác định là cực động vật, còn phía đối diện là cực thực vật hay cực sinh dưỡng Trong giai đoạn này, noãn bào chứa nhiều giọt mỡ với kích cỡ khác nhau.
Giai đoạn V là giai đoạn quan trọng trong quá trình trứng chín và rụng, trong đó trứng chín có túi mầm tan biến và màng nhân bị phá hủy do tác động của các yếu tố bên ngoài Những yếu tố này xuất hiện trong noãn bào dưới sự ảnh hưởng của progesteron, theo nghiên cứu của Nguyễn Mộng Hùng (1993).
Sự rụng trứng là sự tỏch và vỡ nang trứng, trứng ủược ủẩy vào xoang buồng trứng hoặc xoang thân
* Cỏc giai ủoạn phỏt triển tuyến sinh dục
Sự phát triển tuyến sinh dục cỏi (buồng trứng, noón sào) của cỏ được phân chia dựa trên các tiêu chuẩn về hình thái, màu sắc, khối lượng, kích thước và mức độ phát triển tế bào sinh dục Nhiều tác giả đã nghiên cứu sự phát triển tuyến sinh dục của các loài cỏ khác nhau và nhận thấy chúng trải qua các giai đoạn phát triển tương tự Tuy nhiên, mức độ phân chia cụ thể các giai đoạn này khác nhau giữa các quốc gia Chẳng hạn, các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản và Ấn Độ chia thành 5 giai đoạn, trong khi ở Mỹ là 7 giai đoạn, còn Trung Quốc và Liên Xô chia thành 6 giai đoạn Hiện nay, nghiên cứu về sự phát triển tuyến sinh dục ở Việt Nam áp dụng cách phân chia theo 6 giai đoạn của các tác giả Liên Xô như Kixelevits, Pravdin, Sakun và Butskaia Sự phân chia noón sào theo 6 giai đoạn dựa vào sự xuất hiện noón bào lớn nhất, cùng với quan sát kích thước, màu sắc và cấu trúc mô học của tuyến sinh dục.
Giai đoạn I là giai đoạn đặc trưng cho thời kỳ còn non, trong đó tuyến sinh dục chưa phát triển, có dạng mảnh, trong suốt và nằm trong xoang bụng của cỏ, cũng như sợi vỏ cơ thể Ở giai đoạn này, chúng ta chưa thể phân biệt được giới tính.
Giai đoạn II của quá trình phát triển buồng trứng cho thấy buồng trứng lớn hơn so với giai đoạn I, tuy nhiên, hạt trứng vẫn chưa thể nhìn thấy bằng mắt thường Trên bề mặt buồng trứng, có sự phân bố dày đặc của nhiều mạch máu.
Giai đoạn III của sự phát triển buồng trứng đặc trưng bởi kích thước tăng lên đáng kể, chiếm từ 1/3 đến 1/2 xoang bụng Trong giai đoạn này, hạt trứng có thể được nhìn thấy bằng mắt thường, tuy nhiên, chúng khó tách rời khỏi vách ngăn bên trong buồng trứng và thường kết thành từng chùm gồm vài hạt (Pravdin, 1973).
Các noón bào được bao quanh bởi màng Follicul, trong tế bào trứng xuất hiện một hoặc hai hàng không bào Hầu hết các tiểu hạch phân bố ở màng nhân, với một số lượng nhỏ phân tán ở giữa nhân Sự lớn lên của các noón bào trong giai đoạn này chủ yếu do việc tích lũy chất dinh dưỡng dưới dạng các giọt mỡ và các hạt noón hoàng Các hạt noón hoàng có màu từ vàng đến da cam, do đó trứng và buồng trứng trong giai đoạn này có màu sắc đặc trưng Trong giai đoạn III, tế bào trứng trải qua nhiều biến đổi phức tạp, vì vậy để tiện theo dõi, người ta chia thành nhiều phase khác nhau.
Phase 31: Ở ngoại vi tế bào trứng xuất hiện một hàng không bào ngay sát màng của nó
Phase 32: Xuất hiện hàng không bào phía dưới hàng không bào cũ, như vậy lúc này trong tế bào trứng có 2 hàng không bào
Phase 3 3 : Số lượng không bào xuất hiện thêm nhiều, chiếm khoảng một nửa khụng gian từ màng nhõn ủến màng tế bào trứng
Phase 34: Tế bào trứng bắt ủầu tớch lũy noón hoàng, cỏc hạt noón hoàng xuất hiện từ nhân ra ngoại vi
Phase 35: Tớch lũy ủủ noón hoàng và noón hoàng dồn nhõn ra ngoại vi Không bào bị vỡ chỉ còn lại một lớp gọi là lớp hạt vỏ, lớp này có tác dụng hình thành màng thụ tinh sau này
Giai đoạn IV của buồng trứng đặc trưng bởi kích thước lớn, chiếm phần lớn thể tích xoang bụng với màu sắc vàng đậm hoặc xanh vàng Các hạt trứng trong giai đoạn này căng tròn và tách rời nhau, trong khi nhân của noãn bào dịch chuyển dần về lỗ noãn.
Giai đoạn V là thời điểm trứng đã rơi vào xoang buồng trứng và hoàn toàn chuyển về cực động vật Trong giai đoạn này, buồng trứng và bụng cá trở nên rất mềm Nếu vuốt nhẹ dọc theo bụng cá về phía hậu môn, có thể thấy trứng chảy ra ngoài qua lỗ sinh dục.
Giai đoạn VI là giai đoạn sau khi cỏ ủẻ, trong đó sản phẩm sinh dục được thải ra ngoài, thể tích buồng trứng thu hẹp lại và nhão, các mạch máu mở rộng Trong buồng trứng, vẫn còn lại các vết tích của tế bào nang, tế bào chớn muồi cũn sút lại cùng với các tế bào trứng giai đoạn II Những trứng không được giải phóng sẽ nhanh chóng bị thoái hóa và hấp thu.
ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và ủịa ủiểm nghiờn cứu
Mẫu tuyến sinh dục được thu thập định kỳ tại Trạm nghiên cứu thực nghiệm nuôi trồng thủy sản Mê Linh, thuộc Trung tâm tư vấn thiết kế và chuyển giao công nghệ, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, Từ Sơn, Bắc Ninh.
Nghiên cứu về tổ chức học tuyến sinh dục của cỏ ủ được thực hiện tại phòng mô học của Trung tâm Quan trắc và Cảnh báo môi trường, thuộc Bệnh thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nghiờn cứu một số ủặc ủiểm sinh học sinh sản cỏ Nhưng trong ao nuôi ðịnh kỳ hàng thỏng từ thỏng 05/2010 ủến thỏng 12/2010 (thu mẫu vào ngày 10 hàng thỏng), tiến hành thu mẫu ủể nghiờn cứu một số ủặc ủiểm sinh học Mẫu ủược thu trong ao nuụi vỗ tại Trạm nghiờn cứu thực nghiệm nuụi trồng thuỷ sản Mờ Linh, mỗi thỏng thu 5 mẫu cỏ ủực và 5 mẫu cỏ cỏi
3.3.1.1 Xỏc ủịnh tuổi, cỡ cỏ, mựa vụ sinh sản, ủặc ủiểm sinh dục phụ
* Tuổi cỏ: Xỏc ủịnh tuổi thành thục của cỏ theo phương phỏp của Pravdin (1973)
Chọn những vẩy còn nguyên vẹn và không bị trầy xước, sau đó rửa sạch bằng nước cất Đưa chúng lên kính hiển vi ở độ phóng đại 40x để quan sát và xác định tuổi cá dựa vào các vòng sinh trưởng trên vẩy Các vòng tuổi bao gồm những vòng thưa và dày, tạo nên vựng sống tối, và vòng tuổi không bị đứt quảng.
- Khối lượng cỏ: Dựng cõn ủiện tử ủộ chớnh xỏc 0,1g ủể xỏc ủịnh khối lượng cá
- Chiều dài: ðo chiều dài tiêu chuẩn (Lo) và chiều dài toàn thân cá (L) bằng thước, ủơn vị ủo bằng cm, ủộ chớnh xỏc 1mm
Mùa vụ sinh sản của cỏ được xác định dựa vào hệ số thành thục và tỷ lệ phát triển của tuyến sinh dục Thời điểm mà hệ số thành thục và tỷ lệ phát triển tuyến sinh dục đạt mức cao nhất ở giai đoạn IV sẽ được xem là mùa vụ sinh sản.
* ðặc ủiểm sinh dục phụ: Quan sỏt và mụ tả cỏc ủặc ủiểm sinh dục phụ của cỏ ủực và cỏ cỏi
3.3.1.2 Hình thái và cấu tạo của tuyến sinh dục
Cỏ Nhưng được bắt lên, đặt vào khay men, tiến hành giải phẫu cắt một đường từ lỗ hậu môn đến một bên, sau đó tiếp tục cắt dọc theo bên đến sau xương nắp mang Sau khi tìm thấy tuyến sinh dục, quan sát và mô tả hình thái bên ngoài của tuyến sinh dục có màu sắc và cấu trúc đặc trưng Tiến hành cắt tuyến sinh dục để nghiên cứu thêm về đặc điểm của nó.
3.3.1.3 Theo dõi sự phát triển tuyến sinh dục và tế bào sinh dục cá Nhưng qua các tháng nghiên cứu
Dựa trên quan sát hình dạng bên ngoài của noãn bào và tinh sào bằng mắt thường, kết hợp với việc làm tiêu bản mô học của tuyến sinh dục, sự phát triển của tuyến sinh dục được phân chia thành 6 giai đoạn theo bậc thang của Sakun và Butskaia (1978).
Tiêu bản tuyến sinh dục được thực hiện theo phương pháp của David E Honton (1990) và quy trình làm tiêu bản mô học của Trung tâm Quan trắc và Cảnh báo môi trường, Bệnh thủy sản – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I Mẫu được nhuộm bằng thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin theo phương pháp Sheehan và Harpchar (1980).
Sơ ủồ quy trỡnh nghiờn cứu mụ học tuyến sinh dục cỏ Nhưng
Cố ủịnh mẫu tuyến sinh dục
Tuyến sinh dục của cỏ ủược cố ủịnh bằng dung dịch Bouin cú thành phần như sau:
+ 750ml dung dịch acid picric bão hòa
+ 50ml acid acetic ủậm ủặc
Thu mẫu tuyến sinh dục
Xử lý mẫu đúc paraffin và cắt lát mẫu
Nhuộm mẫu ( Haematoxylin và Eosin) ðọc kết quả
Cố ủịnh mẫu trong dung dịch Bouin 24h, sau ủú ngõm trong nước từ 1 - 3h
- Khử nước ở mẫu cố ủịnh: ðưa mẫu lần lượt qua cồn etylic với cỏc nồng ủộ tăng dần:
+ Cồn 80 0 : 3 lần, mỗi lần từ 30 – 60 phút
+ Cồn 100 0 : 3 lần, mỗi lần ngâm 30 – 60 phút
- Làm trong mẫu: Ngâm mẫu trong xylen 2 lần, mỗi lần 60 phút
- Thấm parafin, mẫu ủược chuyển vào parafin ủun núng ở nhiệt ủộ 56 -
58 o C trong thời gian 60 phút ðúc parafin và cắt lát mẫu
Trước tiên, ta ủ mẫu vào khuôn ủng mẫu, sau đó dựng máy đổ paraffin nóng chảy vào khuôn chứa mẫu Sau khi paraffin đông lại, đặt khuôn lên dàn lạnh để tạo khối paraffin chứa mẫu Trong quá trình này, cần giữ mẫu ở một mặt khuôn để thuận tiện cho thao tác cắt lát mẫu.
+ Dùng dao gọt bỏ phần paraffin thừa tạo thành khối paraffin chứa mẫu có hình chữ nhật hoặc hình tháp cụt
+ Gắn khối parafin chứa mẫu vào máy Microtom
+ Tiến hành cắt lỏt mụ dày 6àm
+ ðưa lỏt cắt vào nước ấm (40 0 C) khoảng 1 phỳt ủể lỏt cắt khụng bị nhăn
+ Dựng lam kớnh ủể lấy lỏt cắt mẫu mụ ra khỏi nước, ủặt lam chứa lỏt cắt lờn mỏy sấy slide ở nhiệt ủộ 40 0 C trong thời gian 40 – 50 phỳt
Nhuộm mẫu: Dùng thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin Quá trình nhuộm mẫu ủược thực hiện theo cỏc bước sau:
- Loại bỏ paraffin ở lát cắt:
+ Ngâm lam chứa mẫu trong xylen I: 5 phút
+ Ngâm lam chứa mẫu trong xylen II: 5 phút
- Nhúng mẫu trong nước cất 3 – 6 lần
- Rửa qua vòi nước chảy nhẹ: 4 – 6 phút
- Dựng lamen sạch dỏn lờn lam mẫu bằng keo Bom Canada ủể bảo quản và quan sát mẫu dưới kính hiển vi
3.3.1.4 Xỏc ủịnh sức sinh sản
Sức sinh sản tuyệt đối (số trứng/cỏ cỏi) là tổng số trứng có trong buồng trứng ở giai đoạn IV Để tính toán sức sinh sản tuyệt đối, ta sử dụng công thức: n × p.
N: Sức sinh sản tuyệt ủối (số trứng/cỏ cỏi) n: Số trứng trong mẫu q p: Khối lượng buống trứng (g) q: Khối lượng mẫu trứng (g)
Để xác định số lượng trứng trong mỗi buồng trứng, cần lấy mẫu trứng ở ba phần: đầu, giữa và cuối của buồng trứng, mỗi mẫu nặng 1g Sau đó, tính giá trị trung bình và nhân với tổng khối lượng của toàn bộ buồng trứng để có kết quả chính xác.
Khối lượng cỏ xỏc ủịnh bằng cõn ủiện tử cú ủộ chớnh xỏc 0,1g; khối lượng tuyến sinh dục ủược xỏc ủịnh bằng cõn ủiện tử, ủộ chớnh xỏc 0,01g
Sức sinh sản tương ủối (trứng/1g cỏ cỏi) là chỉ số đo lường số lượng trứng trên một đơn vị khối lượng thân cỏ Công thức tính sức sinh sản tương ủối giúp xác định khả năng sinh sản của cỏ cỏi một cách chính xác.
S: Sức sinh sản tương ủối (trứng/1g cỏ cỏi) N: Sức sinh sản tuyệt ủối
W: Khối lượng toàn thân của cá (g)
3.3.1.5 Xỏc ủịnh hệ số thành thục và ủộ bộo của cỏ
- Hệ số thành thục của cá tính theo công thức sau:
K : Là hệ số thành thục
Wo: Khối lượng cá bỏ nội quan (g)
Wtsd: Khối lượng tuyến sinh dục (g)
- ðộ bộo của cỏ ủược xỏc ủịnh theo hai cụng thức:
W: Kối lượng toàn thân cá (g)
W0: Khối lượng cá bỏ nội quan (g)
Cân khối lượng cỏ sử dụng cân điện tử, với đơn vị đo là gram, chính xác đến 1 gram Đo chiều dài cỏ bằng thước, đơn vị đo là cm, chính xác đến 1 mm.
3.3.1.6 Theo dõi quá trình phát triển của phôi
Quá trình quan sát và theo dõi sự phát triển của phôi được tiến hành từ khi trứng thụ tinh cho đến khi nở ra ấu trùng bằng kính hiển vi Mẫu được lấy định kỳ 5 phút một lần, mỗi lần lấy 10 trứng.
Mẫu sau khi thu ủược cố ủịnh bằng dung dịch Bouin ủể trỏnh sai lệch thời ủiểm thu mẫu
Việc xác định các giai đoạn phát triển của phụi dựa trên đặc điểm hình thái và cấu tạo của phụi Thời điểm chuyển giai đoạn được tính khi quan sát thấy hơn 50% phụi đã phát triển sang giai đoạn mới Các giai đoạn này được chụp ảnh và ghi chép thông tin đầy đủ.
3.3.2 Th ử nghi ệ m kích thích sinh s ả n nhân t ạ o cá Nh ư ng
Trong quá trình nuôi vỗ, để cá phát triển sinh dục tốt và tham gia sinh sản hiệu quả, cần đảm bảo chế độ dinh dưỡng hợp lý và môi trường sống phù hợp Nghiên cứu đã chọn 150 cá bố mẹ (75 cá đực và 75 cá cái, trọng lượng từ 0,16 – 0,35 kg/con) nuôi trong ao có diện tích 200m², với nguồn nước sạch Thức ăn cho cá là thức ăn công nghiệp có protein 22%, được cho ăn với lượng khoảng 5% khối lượng cá/ngày.
Chọn cỏ bố mẹ là bước quan trọng trong việc kích thích sinh sản nhân tạo, đặc biệt là cỏ bố mẹ có tuyến sinh dục phát triển ở giai đoạn IV Quy trình lựa chọn này dựa vào việc quan sát hình thái bên ngoài của cỏ, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong việc nhân giống.
- Loại kích dục tố: Nghiên cứu thử nghiệm kích thích sinh sản bằng 2 loại kích dục tố với liều lượng như sau:
+ Công thức 1: Dùng não thuỳ cá chép với liều lượng 4mg/1kg cá cái
Cỏ ủực tiờm với liều lượng bằng 1/5 liều tiờm cỏ cỏi
+ Cụng thức 2: Dựng LRHa với liều lượng 40àg kết hợp với 30mg DOM LRHa cho 1kg cỏ cỏi Cỏ ủực tiờm với liều lượng bằng 1/5 liều tiờm cỏ cỏi
Cỏ cỏi: Chia làm 2 lần tiờm, trong ủú tiờm lần 1 bằng 1/10 tổng liều Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 4 - 6 giờ
Cỏ ủực: Tiờm 1 lần với liều lượng bằng 1/5 liều tiờm cỏ cỏi và tiờm cùng với tiêm lần 2 cho cá cái
Xử lý số liệu
Phân tích số liệu được thực hiện bằng phương pháp thống kê mô tả và phân tích phương sai ANOVA với mức ý nghĩa P