Đặ t v ấn đề
Rượu là một loại đồ uống có lịch sử lâu đời và, nếu được sử dụng hợp lý, có thể mang lại lợi ích cho sức khỏe cũng như trong giao tiếp Trong ngành công nghiệp thực phẩm, rượu và các đồ uống có cồn đóng vai trò quan trọng, với sự đa dạng do truyền thống và sở thích của người tiêu dùng Hệ vi sinh vật trong bánh men là yếu tố then chốt trong quá trình sản xuất rượu, giúp chuyển hóa nguyên liệu thành đường và từ đường thành rượu thông qua quá trình đường hóa và lên men Nghề nấu rượu thủ công ở Việt Nam có từ lâu đời, đặc biệt ở miền núi nơi người dân sử dụng gạo, ngô, khoai, sắn để làm rượu cần, trong khi ở đồng bằng, men thuốc bắc được dùng để lên men từ các nguyên liệu chứa tinh bột Các loại men này, như men bánh hoặc men lá, chứa vi sinh vật có hoạt tính, trong đó có loài nấm mốc Mucor rouxii, được phân lập vào cuối thế kỷ XIX, có khả năng phân giải tinh bột hiệu quả và lên men đường thành rượu.
Nhiều loại men rượu hiện nay trên thị trường có nguồn gốc không rõ ràng và không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, dẫn đến việc không kiểm soát được hệ vi sinh vật về chủng loại và số lượng, tiềm ẩn nguy cơ ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.
Nghiên cứu và phát triển các chủng nấm mốc thuần chủng từ bánh men rượu truyền thống là cần thiết, nhằm ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng, góp phần nâng cao hiệu quả trong ngành công nghiệp sản xuất rượu.
Dưới sự đồng ý của Khoa Công nghệ thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam và sự hỗ trợ của TS Đinh Thị Hiền cùng TS Đặng Hồng Ánh từ Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống”.
M ục đích
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và nhân sinh khối các chủng nấm mốc như Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus, có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống, nhằm mục đích sản xuất bánh men rượu hiệu quả hơn.
Yêu c ầ u
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống
Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc/ nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu
Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được
T ổ ng quan chung v ề bánh men rượ u
Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam
Bánh men rượu truyền thống trên thế giới rất đa dạng, với các loại men nổi bật như men Loopang dạng bột ở Thái Lan, men Koji dạng hạt ở Nhật Bản, và men Nuruk cùng Meju dạng bánh lớn ở Hàn Quốc (Haard, 1999) Men rượu là hỗn hợp vi sinh vật tương tác trong quá trình lên men, được nuôi dưỡng trên nguyên liệu giàu tinh bột như bột gạo, ngô, sắn và khoai.
Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ởcác nước trên thế giới
Tên nước Tên gọi Thành phần Dạng men Hệ vi sinh vật
Nhật Bản Koji Lúa mỳ, gạo Dạng hạt Aspergillus
Thái Lan Loopang Cám Dạng bột Amylomyces Aspergillus
Ragi Gạo Dạng bánh nhỏ Amylomyces
Trung Quốc Chu Lúa mỳ, kê, gạo, bo bo
Rhizopus Amylomyces Ấn Độ Marchaa Gạo Dạng bánh
Hansenula anomala Mucor fragilis Rhizopus arrhizus
Phillipines Bubod Gạo Dạng bánh Mucor, Rhizopus
(Haard, N F Fermented cereals: a global perspective, 1999)
Việt Nam có hai loại bánh men chính: bánh men thuốc bắc, được làm từ một số vị thuốc bắc kết hợp với bột gạo, và bánh men lá, được sản xuất từ bột gạo cùng với các loại lá, củ, quả.
12 rừng theo kinh nghiệm cổ truyền
Men thuốc bắc (MTB) là sự kết hợp giữa các vị thuốc bắc và bột gạo, giúp hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn nhờ thành phần hợp lý (Lương Đức Phẩm, 2012) Một số vị thuốc còn kích thích sự phát triển của nấm men và nấm mốc, cải thiện quá trình đường hóa và rượu hóa (Lương Đức Phẩm, 2012) Ở các vùng núi cao, men lá được ưa chuộng, thường sử dụng lá có nhiều tinh dầu và mùi thơm, tùy thuộc vào từng địa phương (Lương Đức Phẩm, 2012) Người K’Ho Tây Nguyên làm men lá bằng bột thân cây “đòng” và nước chiết cây “me-kà-zut” trộn với bột gạo, trong khi vùng tây Nghệ An sử dụng các loại lá như lá mít, lá mía, lá nhân và lá quế (Lương Đức Phẩm, 2009).
Phân loại bánh men rượu
Từ xa xưa, việc sử dụng thành phần của mẻ lên men trước vào mẻ lên men sau đã được áp dụng để rút ngắn thời gian và giảm hư hỏng trong quá trình lên men Hiện nay, người ta đã chủ động nuôi cấy các vi sinh vật chọn lọc để sản xuất các chế phẩm vi sinh, đáp ứng tốt yêu cầu của quá trình lên men rượu, được gọi là bánh men rượu.
Bánh men rượu chủ yếu được làm từ gạo, là nguyên liệu cung cấp tinh bột cần thiết cho quá trình sản xuất Men giống, các vi sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong việc đường hóa và rượu hóa Ngoài ra, bánh có thể được kết hợp với các loại thảo dược khác, tùy thuộc vào từng địa phương Hiện tại, bánh men rượu có thể được chia thành ba loại khác nhau.
Bánh men rượu không có thuốc bắc (Bánh men thường).
Bánh men rượu có thuốc bắc.
Bánh men rượu có lá rừng (Bánh men lá).
Gi ớ i thi ệ u v ề công ngh ệ s ả n xu ất bánh men rượ u truy ề n th ố ng
Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu
Gạo được chọn làm nguyên liệu chính để cung cấp tinh bột cho sản xuất bánh men
Thành phần hóa học của gạo chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố, bao gồm đất đai, khí hậu, loại phân bón sử dụng, giống lúa, cùng với kỹ thuật chế biến và bảo quản.
Tinh bột gạo là loại tinh bột phức tạp với kích thước rất nhỏ, bao gồm khoảng 17% amylose và 83% amylopectin Hạt tinh bột gạo có hình dạng đa giác, kích thước từ 2-10 μm, và do vị trí gần nhau, quá trình hồ hóa gặp khó khăn, cần nhiệt độ khoảng 70 - 80 °C Amylose có cấu trúc mạch thẳng, trong khi amylopectin có cấu trúc mạch nhánh, tỷ lệ này ảnh hưởng đến độ dẻo của hạt Các loại gạo Việt Nam có hàm lượng amylose dao động từ 15 - 35% Ngoài tinh bột, gạo còn chứa protein chiếm 6 – 8%, lipit khoảng 2,02% ở lớp vỏ và phôi, cùng với các vitamin, đặc biệt là vitamin B, trong đó vitamin B1 đạt 0,45 mg/100 hạt.
Thành phần chính của gạo:
- Các loại đường ( 2% – 5% chất khô)
Tinh bột gạo chiếm 90% - 95% tổng khối lượng các nguyên liệu dùng làm bánh men
Men giống được sử dụng trong sản xuất bánh men cổ truyền thường là các loại bánh men cũ phát triển từ tinh bột qua quá trình đường hóa và rượu hóa Ngoài ra, có thể sử dụng bột gạo và thuốc bắc để tạo ra men thuốc bắc, khi đó các vi sinh vật trong không khí sẽ xâm nhập vào bánh men Những chủng nấm mốc và nấm men không bị tiêu diệt bởi kháng sinh trong thuốc bắc sẽ phát triển, phân giải tinh bột thành glucose và lên men rượu Tuy nhiên, việc này sẽ kéo dài thời gian ủ bánh do các chủng nấm men cần thời gian để thích nghi và phát triển, đồng thời chất lượng giống cũng yếu hơn so với việc sử dụng bánh men cũ.
Trong môi trường nuôi cấy có tinh bột gạo và điều kiện thích hợp, các chủng nấm men và nấm mốc có khả năng sản xuất enzyme amylase, giúp thủy phân tinh bột thành đường đơn.
Các chủng nấm men rượu sử dụng đường khử để duy trì sự sống và phát triển, trong khi đó, 14 đường glucose cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này Sau khi đạt được thời điểm nuôi cấy, các vi sinh vật sẽ được sấy đến độ ẩm bảo quản và cùng tồn tại trong môi trường bánh men Thời gian cho một bánh men giống có khả năng lên men rượu cao phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại vi sinh vật (nấm mốc, nấm men), điều kiện ủ và chế độ sấy.
H ệ vi sinh v ậ t trong bánh men
Bánh men là một loại canh trường không thuần khiết chứa hệ vi sinh vật đa dạng, có khả năng tổng hợp enzyme đường hóa và lên men rượu Ba loại vi sinh vật phổ biến nhất trong bánh men bao gồm nấm men, nấm mốc và vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Nghiên cứu khoa học cho thấy bánh men Việt Nam có giá trị pH khoảng 5,76, độ ẩm 13,5%, với nấm mốc 3,4×10^6 và nấm men 5,8×10^7 cfu/g Trong 119 vi sinh vật phân lập, có 53 tế bào mốc, 51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn Các chủng nấm mốc được xác định bao gồm Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides, và Amylomyces rouxii, trong khi các chủng nấm men phổ biến gồm Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Sacchromycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candidas sp Việc nghiên cứu và tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men là cần thiết để nâng cao chất lượng và ổn định sản phẩm bánh men.
Tiêu chí để tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men như sau:
- Đối với các chủng nấm men:
Có hoạt lực lên men mạnh, hiệu suất lên men rượu cao, chịu được nồng độ đường cao.
Chịu được môi trường có nồng độ axit cao.
Tạo hương thơm và sinh ít tạp chất.
Sinh trưởng tốt trên môi trường nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
Có khả năng sinh tổng hợp hệ emzyme amylase cao, trong một thời gian ngắn.
Nấm men là vi sinh vật đơn bào có nhân chuẩn, thường sinh sản bằng cách nảy chồi và có hình dạng đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình bầu dục hoặc hình tam giác Trong quá trình sống, nấm men đồng hóa monosacarit trong điều kiện yếm khí, sản sinh rượu etylic và khí cacbonic nhờ vào các enzyme Đặc điểm này đã được người dân ứng dụng từ lâu để sản xuất rượu bằng bánh men.
Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men Gồm 2 chi chủ yếu là:
- Endomycopsis (chủ yếu là Endo Fibuligenes): là nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase Do đó vừa có khả năng rượu hóa vừa có khả năng đường hóa
Sacharomyces, đặc biệt là S.Cerevisiae, là nấm men quan trọng trong quá trình rượu hóa, có khả năng lên men nhiều loại đường như glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose và galactose Loài nấm men này có thể hoạt động ở nhiệt độ cao từ 36 - 40°C và chịu được axit Đặc biệt, S.Cerevisiae có khả năng lên men nguyên liệu đa dạng như gạo, ngô, khoai, sắn với nồng độ đường trong dung dịch từ 12 – 14%, thậm chí có thể lên tới 16 – 18% Nồng độ rượu trong dịch lên men dao động từ 10 – 12%, trong khi nhiệt độ lên men lý tưởng là 28 – 32°C.
Ngoài hai loại nấm men chính, bánh men còn chứa nhiều loại nấm dại khác nhau, có khả năng thủy phân tinh bột và chuyển hóa đường thành cồn, mặc dù mức độ chuyển hóa còn hạn chế Đặc biệt, các loài nấm men dại này có thể chịu được nhiệt độ cao lên tới 60-65°C và kháng lại chất sát trùng với nồng độ từ 0,05% đến 1%.
Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc Aspergillus,
Penicillium, Mucor và Rhizopus là những loại nấm mốc có thành phần và tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào loại bánh men, vùng sản xuất và từng hộ gia đình Nấm mốc đóng vai trò quan trọng trong bánh men rượu bằng cách cung cấp enzym amylase, giúp chuyển hóa tinh bột thành đường Khi phát triển trong môi trường có tinh bột, các loại nấm này có khả năng sinh tổng hợp các enzym cần thiết cho quá trình lên men.
16 enzym amylase để thủy phân tinh bột thành đường, nhưng trong đó, Mucor và Rhizopus thấy phát triển nhiều hơn cả (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
Vi khuẩn là vi sinh vật đơn bào với cấu trúc đơn giản và kích thước rất nhỏ, có khả năng hoạt động sống độc lập.
Vi khuẩn trong men rượu thường là vi khuẩn lactic và axetic (Lương Đức Phẩm,
2012) Sự đa dạng vi khuẩn trong bánh men rượu của Việt Nam đã được nghiên cứu Chúng chủ yếu thuộc các chi Bacillus, Lactobacillus, Acetobacter, (Thanh et al., 2008)
Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, giúp nâng cao dinh dưỡng cho nấm men và tăng hiệu suất tạo ra rượu Chúng có khả năng lên men đường để tạo ra các axit hữu cơ như axit lactic, axit axetic và axit pyruvic, góp phần tạo hương vị cho rượu Khi hàm lượng axit hữu cơ đạt mức nhất định, chúng sẽ mang lại hương vị và mùi thơm cho rượu, nhưng nếu nồng độ quá cao, sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng rượu, làm cho rượu bị chua.
Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống
Bánh men là loại men rượu thủ công nổi tiếng tại Việt Nam, với mỗi vùng miền và dân tộc sở hữu phương pháp sản xuất riêng Quá trình sản xuất bánh men tạo ra hỗn hợp vi sinh vật cần thiết cho việc sản xuất rượu Đặc điểm nổi bật của bánh men Việt Nam là nấm mốc và nấm men được nuôi cấy đồng thời trên môi trường tinh bột sống, tạo nên sự khác biệt so với các loại bánh men khác.
Bánh men là sản phẩm được tạo ra từ việc nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trong môi trường tinh bột ở trạng thái khô Qua quá trình làm bánh, ủ và sấy đến độ ẩm bảo quản, vi sinh vật chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái ngủ nghỉ Khi gặp điều kiện môi trường thích hợp, chúng sẽ tái hoạt động, sản sinh và phát triển, đồng thời tổng hợp các enzyme cần thiết cho quá trình đường hóa và rượu hóa.
2.2.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ
Hình 2.1: Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
Gạo vo sạch, để ráo
Hong khô Bánh men gốc
Mục đích: Việc làm sạch nhằm loại bỏ bớt tạp chất và tránh tạp nhiễm khỏi bánh men
Mục đích của việc ngâm gạo là làm mềm hạt gạo, giúp quá trình nghiền bột trở nên dễ dàng hơn, tạo ra bột dẻo và mịn Gạo cần được ngâm trong nước với lượng vừa đủ để ngập hoàn toàn, trong khoảng thời gian thích hợp, nhằm đảm bảo nước thấm đều vào từng hạt Đồng thời, cần chú ý tránh sự sinh trưởng của vi khuẩn trong nguyên liệu.
Cách thực hiện: Gạo sau khi được làm sạch đem ngâm với tỉ lệ nước gạo tương ứng là 1:2 Thời gian ngâm 1,5 – 2h ở nhiệt độ 28°C
Mục đích của việc giảm kích thước hạt là nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phối trộn với men giống và thuốc bắc, đồng thời giúp nấm men và nấm mốc dễ dàng tiếp cận với tinh bột Đặc biệt, không sử dụng phương pháp nghiền khô để tránh làm tăng nhiệt độ của khối bột do ma sát giữa các hạt và thiết bị, điều này giúp bảo vệ chất lượng tinh bột và ảnh hưởng tích cực đến chất lượng bánh men.
Để thực hiện quá trình xay, bạn cần sử dụng máy nghiền cối đá Sau khi hoàn tất việc nghiền ướt, hãy lọc bột để giảm độ ẩm, vì độ ẩm tối ưu cho nấm mốc phát triển là từ 50 đến 55%.
Mục đích của quá trình này là trộn đều gạo xay thành bột với bột thuốc bắc và men giống đã nghiền nhuyễn, theo tỉ lệ nhất định Việc này giúp nguyên liệu hòa quyện với nhau, đảm bảo men giống tiếp xúc đồng đều với thuốc bắc, từ đó tinh bột hỗ trợ sự phát triển đồng đều của nấm men và nấm mốc trong bánh men.
Vật lý: Khối bột, thuốc bắc, men giống được trộn đều vào với nhau
Nấm men và nấm mốc hấp thụ thuốc bắc và tinh bột làm nguồn dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển, dẫn đến sự gia tăng khối lượng vi sinh vật.
Cách thực hiện: Sau khi đã lọc bớt nước từ khối bột rắc đều hỗn hợp men giống và
Sử dụng 19 loại thuốc bắc với tỉ lệ 100g gạo, 1g thuốc bắc và 1,5g men giống, trộn đều hỗn hợp Thêm nước với tỉ lệ phù hợp để đạt độ ẩm khoảng 53% Cuối cùng, định hình hỗn hợp thành viên và đặt vào các khay.
Mục đích của việc cung cấp dinh dưỡng từ tinh bột và thuốc bắc là tạo điều kiện cho hệ nấm men và nấm mốc sinh trưởng và phát triển trong môi trường tối ưu.
Vật lý: Khối bột nở xốp ra, bề mặt nhăn do độ xốp tăng cộng với sự phát triển của nấm mốc
Bào tử nấm men và nấm mốc phát triển mạnh mẽ khi nhiệt độ tăng cao, tạo ra một mùi thơm rượu dịu nhẹ đặc trưng.
Sau khi tạo hình khối bột thành các viên trên khay lót trấu, chúng ta đặt một khay lên trên để giữ nhiệt Tiếp theo, quấn khối bột bằng chăn hoặc vải để tạo môi trường ấm áp và ẩm cho nấm men và nấm mốc phát triển Giữ ấm khối bột ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ, nhưng ở các làng nghề truyền thống, do ủ thủ công không thể kiểm soát nhiệt độ nên thời gian ủ không được cố định.
Mục đích: Nhằm giảm độ ẩm của bánh men để tiện cho quá trình bao gói và bảo quản được lâu dài.
Cách thực hiện: Sau khi kết thúc quá trình ủ đem các bánh men thành phẩm để trong nơi thoáng mát trong phòng từ 1 đến 2 ngày rồi đem sấy khô.
N ấ m m ố c – Vi sinh v ậ t có kh ả năng đườ ng hoá
Cấu tạo và hình thức sinh sản
Màng tế bào nấm chủ yếu được cấu tạo từ kitin, trong khi chất dự trữ hydrat carbon của nấm là glycogen Đặc biệt, tế bào nấm chứa nhiều enzyme và kháng sinh có hoạt tính sinh học cao (Nguyễn Đức Lượng, 1996).
Cấu tạo thành tế bào: polisaccharite (80÷90%), lipit (3÷8%), hexozamin (1÷3%), protein (4%), chất màu (melanin)
Nấm mốc có vách ngăn được hình thành từ chuỗi tế bào liên kết, với mỗi tế bào được ngăn cách bởi một màng vách Mỗi tế bào nấm có đầy đủ các cơ quan cần thiết, trong đó nhân là thành phần quan trọng.
+ Loại nấm không có vách ngăn: Đây là những loại nấm đa hạch không có màng ngăn
Khuẩn ty của nấm mốc bao gồm một hoặc nhiều tế bào hình cầu được bao bọc bởi màng dày, chứa nhiều chất dự trữ Khi điều kiện môi trường thuận lợi, các tế bào này sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới.
Sinh sản bằng hạch nấm là một quá trình đặc biệt ở một số loài nấm, trong đó hạch nấm hình thành từ tổ chức sợi xốp màu trắng Hạch nấm giúp nấm tồn tại qua những điều kiện khó khăn và khi gặp môi trường thuận lợi, chúng sẽ phát triển trở lại bình thường.
- Sinh sản vô tính: Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thểđược tạo thành từ những phương pháp sau:
+ Do sự cắt đoạn của các sợi nấm
Tế bào sinh bào tử có khả năng nảy chồi, cho phép chúng tạo ra các bào tử mới Các bào tử này cũng có thể tiếp tục nảy chồi để hình thành thêm bào tử kế tiếp.
Bào tử được hình thành bằng cách ngăn vách với tế bào ngay khi bào tử mới xuất hiện, và chúng không có khả năng sinh sản bào tử tiếp theo.
- Sinh sản hữu tính: hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau rồi mọc lên một cơ thể mới (Nguyễn Đức Lượng, 1996).
M ộ t s ố n ấ m m ố c có kh ả năng đườ ng hóa trong s ả n xu ất rượ u
Rhizopus là một chi nấm có nhiều loài như R.japonicus, R.oryzae, R.peka II và R.tonkinensis Đặc điểm nổi bật của Rhizopus là khả năng sinh trưởng “giả chi”, cho phép chúng lan rộng trên bề mặt môi trường Tại các vị trí có giả căn, thân bò tiếp tục phát triển và tạo ra các cuống bào tử nang chứa nhiều bào tử Bào tử của Rhizopus có hình trứng hoặc bán cầu, bề mặt nhăn nheo và kích thước từ 5 đến 8 micromet, với màu sắc thay đổi từ trắng sang đen khi trưởng thành Nhiệt độ phát triển lý tưởng của chúng là từ 32 đến 34°C Rhizopus thường được nuôi cấy trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng và có thông khí, với hệ enzyme amylase tương đối hoàn chỉnh, và thường được ứng dụng trong sản xuất rượu theo phương pháp amyloza cũng như nuôi cấy nấm mốc lỏng.
Mucor có nhiều điểm tương đồng với Rhizopus, nhưng có thể phân biệt qua ba đặc điểm chính: Mucor không có giả căn, cuống bào tử nang có thể phát sinh ở bất kỳ vị trí nào và nang trụ không có hình bán cầu, không sát vách bào tử nang Trong sản xuất rượu, Mucor rouxii thường gặp ở Việt Nam, với hệ enzyme amylase và enzyme rượu hóa, cho phép chuyển hóa đường thành rượu trong điều kiện yếm khí Khuẩn ty của Mucor rouxii phân nhánh nhiều, không có vách ngăn, với khuẩn lạc cao và không nếp nhăn Cuống bào tử nang phân nhánh ngẫu nhiên, bào tử nang thường trụn, đường kính 60-80 µm, trong khi nang trụ có đường kính 20-50 µm và bào tử trụn có đường kính 6-7 µm Màu sắc của khuẩn ty non là trắng, khi già có màu xám nhạt, và bào tử nang chuyển từ trắng sang vàng nhạt, đỏ xám, đen, làm cho khuẩn lạc có màu xám dần.
Mucor rouxii thường được dùng cho phương pháp amyloza (Nguyễn Lân Dũng, 2002)
Penicillium sp là một loại nấm mốc đa bào, với hệ sợi có vách ngăn và cấu trúc bào tử phân nhánh hình chổi Cuống của nấm có thể phân nhánh từ một đến ba tầng, trên đó có các thể bình và bào tử đính Loại nấm này còn có khả năng sinh cellulose.
Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc đa bào với hệ sợi có vách ngăn, bắt đầu phát triển với màu trắng và dần chuyển sang màu lục, cuối cùng là vàng hoa cau khi trưởng thành Nấm này có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 15°C đến 40°C, với nhiệt độ tối ưu là từ 30°C đến 32°C Đặc biệt, Aspergillus oryzae nổi bật với khả năng sinh enzyme mạnh mẽ, chủ yếu là các loại enzyme amylase, protease và maltase.
Aspergillus niger là một loại nấm mốc đa bào với hệ sợi có vách ngăn, ban đầu có màu trắng và sau đó chuyển sang màu sẫm, nhưng không hoàn toàn đen Bào tử của nấm có màu đen tuyền, với cuống đầu tiên mọc ra 2÷4 nhánh cuống nhỏ trước khi hình thành các đính bào tử Loại nấm này có khả năng sản xuất nhiều enzyme khác nhau như amylase, maltase, protease, pectinase và cellulose Aspergillus niger có thể phát triển trong môi trường pH thấp, với nhiệt độ tối ưu từ 30 đến 32°C, đặc biệt trên môi trường tinh bột.
Aspergillus flavus là một loại nấm mốc đa bào với cấu trúc hệ sợi có vách ngăn Ban đầu, khuẩn lạc của nó có màu vàng sáng, sau đó chuyển sang màu nâu oliu Loại nấm này có kích thước nhỏ hơn so với nhiều loại nấm mốc khác.
Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc có cuống hình chùy và bào tử với màu xanh lục nổi bật Loại nấm này sản sinh ra các enzyme tương tự như Aspergillus oryzae, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học.
Phương pháp nuôi cấy
2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề sâu.
Nấm mốc được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng có không khí, dẫn đến sự hình thành và phân bố của khuẩn ty thể trong môi trường Đặc biệt, trong quá trình này, enzyme amylase được khuếch tán ra môi trường, góp phần vào quá trình phát triển và chuyển hóa chất dinh dưỡng.
Trong sản xuất bánh men rượu truyền thống ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy bề mặt được ưa chuộng hơn cả nhờ vào sự đơn giản và tính phù hợp với sản xuất thủ công Phương pháp này không yêu cầu kỹ thuật nuôi cấy cao, giúp người dân dễ dàng áp dụng trong điều kiện sản xuất còn hạn chế.
2.3.3.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Trong sản xuất, việc nhân giống mốc giống ban đầu là rất quan trọng trước khi đưa vào môi trường sản xuất Mốc giống được nuôi cấy trên môi trường thạch – malt trong 7 đến 8 ngày, sau đó chuyển vào bình tam giác 500ml chứa môi trường cám mì (hoặc ngô, tấm gạo) đã được tiệt trùng trong 1 giờ Quá trình nuôi tiếp tục diễn ra ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày, trước khi chuyển sang nuôi trên khay.
Nuôi mốc trên khay trong môi trường có nhiệt độ từ 28 đến 32°C và độ ẩm không khí đạt 90 đến 95% là rất quan trọng Thời gian nuôi mốc kéo dài từ 36 đến 48 giờ, kết thúc khi mốc sinh bào tử nhiều, tạo ra mốc trung gian để cấy trộn vào môi trường sản xuất tiếp theo Trong quá trình nuôi, cần chú ý lật và bẻ nhỏ cám để ngăn chặn sự kết thành bánh do hệ sợi mốc phát triển.
Môi trường nuôi cấy nấm mốc cần có tỉ lệ và chất lượng các thành phần phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme thô (glucoamilase) với hoạt lực cao nhất Đối với một số ứng dụng đặc biệt, nấm mốc được nuôi trực tiếp trên bề mặt hạt gạo hoặc hạt mì đã được tiệt trùng Vi sinh vật lấy dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy trong không khí để hô hấp Do đó, môi trường nuôi cấy phải đảm bảo đủ chất dinh dưỡng, có cấu trúc tơi xốp, ẩm ướt và nhiệt độ thích hợp để hỗ trợ sự phát triển của nấm mốc.
Ảnh hưở ng c ủ a điề u ki ệ n nuôi c ấ y
Trong điều kiện sản xuát độ ẩm ban đầu thích hợp đối với giống Aspergillus là
Để duy trì sự phát triển tối ưu trong quá trình nuôi, độ ẩm cần được giữ ở mức 58÷60% Nếu độ ẩm vượt quá 70%, sẽ dẫn đến giảm độ thoáng khí, trong khi nếu thấp hơn 50÷55%, sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật và quá trình tạo ra glucoamilase (Rodzevich, 1973).
Toàn bộ chu trình phát triển của nấm mốc trên môi trường cám có thể chia thành ba thời kì sau:
Trong khoảng thời gian 10 đến 14 giờ đầu, bào tử sẽ trương đính và bắt đầu mọc nấm Để đảm bảo sự phát triển ban đầu của nấm mốc không bị kìm hãm, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy cần duy trì ở mức tối thiểu 28 đến 30°C.
Trong khoảng thời gian từ 14 đến 18 giờ, hệ sợi nấm phát triển nhanh chóng, tiêu thụ nhiều chất dinh dưỡng và hô hấp mạnh mẽ, dẫn đến việc tỏa ra lượng nhiệt lớn Nhiệt độ trong lớp canh trường có thể tăng lên đến 37-40°C hoặc cao hơn tùy thuộc vào độ dày của lớp Do đó, cần duy trì không khí có nhiệt độ không thấp hơn 28-29°C và độ ẩm tương đối tối đa để đảm bảo điều kiện phát triển tối ưu cho nấm.
Thời kỳ thứ ba kéo dài từ 10 đến 20 giờ, trong đó quá trình trao đổi chất diễn ra yếu dần và lượng nhiệt thoát ra giảm Giai đoạn này tạo ra enzyme mạnh mẽ và kéo dài, phụ thuộc vào tính chất sinh lý và sự kết thúc tổng hợp enzyme, có thể ngừng sự phát triển của nấm mốc Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp amylase trên môi trường rắn là từ 28 đến 32°C; nhiệt độ dưới 24°C hoặc trên 45°C làm chậm sự phát triển của nấm mốc, kéo dài thời gian nuôi và giảm khả năng sinh tổng hợp amylase (Đặng Thị Thu, 1989).
Quá trình nuôi nấm mốc kéo dài từ 35 đến 48 giờ, tùy thuộc vào thời gian tạo ra enzyme Ở một số loài Aspergillus, sự hình thành enzyme tối đa thường trùng với giai đoạn bắt đầu tạo bào tử, vì vậy dừng quá trình phát triển vào thời điểm này là hợp lý Trong một số trường hợp khác, enzyme vẫn có thể tiếp tục tích lũy mạnh mẽ trong suốt thời gian tạo bào tử.
Sự ngừng tổng hợp enzyme ở vi sinh vật có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc, vì vậy việc chọn thời điểm thu hoạch mốc giống là rất quan trọng Để tối ưu hóa sinh khối bào tử, cần nuôi cấy nấm mốc trong giai đoạn phát triển mạnh nhất Khi đưa vào bánh men, nấm mốc sẽ thích nghi nhanh chóng và phát triển mạnh mẽ, từ đó tạo ra nhiều glucoamilase có hoạt lực cao trong điều kiện thích hợp.
Nuôi bằng phương pháp bề mặt thì pH không thay đổi đáng kể trong quá trình nuôi do môi trường có dung lượng cao và hàm ẩm thấp
Để nuôi cấy mốc hiệu quả, cần duy trì nhiệt độ trong khoảng 28-32°C, đảm bảo thông gió và độ ẩm không khí từ 90-95% Trong quá trình nuôi cấy, cần thường xuyên lật và bẻ nhỏ cám để ngăn chặn sự kết tụ của cơ chất do sự phát triển của sợi mốc Khi mốc gần đến giai đoạn tạo bào tử, độ ẩm cần được điều chỉnh xuống 40-50% Sau đó, sấy khô mốc ở nhiệt độ không quá 45°C cho đến khi đạt độ ẩm 10-12%, rồi nghiền nhỏ Cuối cùng, bảo quản mốc trong các bao hoặc thùng kín ở nơi mát (≤20°C) để sử dụng dần.
T ầ m quan tr ọ ng c ủ a vi ệ c s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m bánh men vi sinh thu ầ n
Trước đây, sản xuất rượu ở hầu hết các nước chủ yếu dựa vào kinh nghiệm gia truyền và quy mô nhỏ, với phương pháp thủ công và nguồn vi sinh vật tự nhiên Điều này dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định, phụ thuộc vào thời tiết, môi trường và kinh nghiệm của người sản xuất Việc quản lý nguồn vi sinh vật cho quá trình lên men còn hạn chế, và điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm thường không được đảm bảo, tạo ra nhiều mối nguy trong quy trình sản xuất.
Hiện nay, sự phát triển của khoa học công nghệ đã giúp các nước phát triển duy trì và phát triển bền vững sản phẩm lên men truyền thống thông qua việc ứng dụng các thành tựu kỹ thuật vào sản xuất Một trong những kỹ thuật phổ biến là sử dụng giống khởi động thuần chủng Tuy nhiên, tại Việt Nam, chưa có cơ sở sản xuất bánh men rượu truyền thống quy mô công nghiệp, chủ yếu là các hộ kinh doanh nhỏ lẻ, dẫn đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm không đảm bảo, chất lượng bánh men không ổn định và hiệu quả lên men thấp.
Việc áp dụng các chế phẩm bánh men vi sinh vật thuần chủng trong sản xuất không chỉ giúp quá trình sản xuất trở nên dễ dàng hơn và dễ kiểm soát, mà còn đảm bảo sản phẩm có chất lượng ổn định, vệ sinh an toàn thực phẩm, đồng thời vẫn giữ được các đặc điểm truyền thống của sản phẩm.
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Mẫu men gốc Đức Ngọ và men Thái Nguyên được lấy từ xưởng sản xuất Bộ môn Công nghệ đồ uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.
Ph ạ m vi nghiên c ứ u
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Kính hiển vi điện tử Nikon eclipe e800 (Nhật Bản)
- Máy nuôi lắc ổn nhiệt SHELLAB 1575R (Mỹ)
- Nuôi ổn nhiệt Heraus (Đức)
- Nồi hấp khử trùng HIRAYAMA ( HICLAVE HV-110) ( Nhật Bản)
- Tủ cấy vi sinh Sanyo BIOCLEAN BENCH ( Nhật Bản)
- Cân 4 số Meter TOLEDO A B204-S ( Thụy Điển)
- Cân 3 số Sartorius BL310 ( Đức)
- Tủ sấy dụng cụ thiết bị BINDER ( Đức)
- Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
- Ống đong hình trụ bằng thủy tinh
- Bình định mức 50ml, 100ml, 500ml
- Buret 25ml khắc vạch 0,1ml
- Bình schott, ống nghiệm, đĩa petri, ống falcon
- Lọ nhựa, rổ, khay nhựa
- NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, FeSO4.
Môi trường cần chuẩn bị:
+ Môi trường Czapeck-dox : NaNO 3 - 2g , KH2PO4 - 1g, KCl – 1g, MgSO 4 7H2O - 0,5g, FeSO4.7H2O - 0,01g, Agar – 20g , Nước cất – 1000ml, Saccarose – 30g (TCVN 9298:2014)
Địa điể m nghiên c ứ u
Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ đồ uống – Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.
Th ờ i gian nghiên c ứ u
Thời gian nghiên cứu đề tài từ 01/2019 đến tháng 5/2019.
N ộ i dung nghiên c ứ u
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và
Aspergilluscó khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống
Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu của quá trình lên men rượu
Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được.
Phương pháp nghiên cứ u
Phương pháp bố trí thí nghi ệ m
3.4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus ,
Penicillium và Aspergilluscó khảnăng đường hóa cao từbánh men rượu truyền thống
Men Đức Ngọ và men Thái Nguyên được mang về phòng thí nghiệm tiến hành đem phân lập chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus trên môi trường
Czapeck - dox Tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus phân giải tinh bột tốt nhất
Các chỉ tiêu theo dõi: Phân lập ra chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium,
Aspergillus đánh giá và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột tốt nhất bằng vòng thủy phân tinh bột
3.4.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
Sau khi phân lập thành công các chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus với khả năng đường hóa cao, chúng tôi tiến hành nhân sinh khối của các loại nấm mốc này.
Tiến hành thí nghiệm cấy truyền một ống nghiệm giống mốc vào bình tam giác chứa 100ml môi trường nuôi cấy Czapeck-dox Sau khi nuôi lắc, mẫu được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút để thu sinh khối và cân lượng thu được Trộn 1 ống sinh khối vừa ly tâm với 100g gạo để thu được bột mốc Các thông số điều kiện nuôi lắc như số vòng lắc, nhiệt độ, và thời gian được thay đổi theo từng thí nghiệm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn.
Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân sinh khối
(giờ) Nhiệt độ nuôi (°C) Số vòng lắc
Bảng 3.2: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi lắc nhân sinh khối
Số vòng lắc (vòng/phút)
Thời gian được chọn ở thí nghiệm bảng 3.1 150
Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc nhân sinh khối
Công thức Số vòng lắc
Nhiệt độđược chọn ở thí nghiệm bảng 3.2
Thời gian được chọn ở thí nghiệm bảng
- Lượng sinh khối thu được
3.4.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu
- Hoạt hóa men khô: 0,5g men : 0,5g Glucose Nhiệt độ 30°C-33°C trong vòng 30 phút
Nấu 100g gạo nứt với 120g nước, sau đó trộn với bột mốc theo tỷ lệ trong bảng 1 Đặt cơm rượu vào rổ và đậy khăn ẩm, ủ lên men ở nhiệt độ 30°C.
24 h đầu, 24 h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24 h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình lên men ở nhiệt độ 28°C
Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu
Công thức Tỷ lệ bột mốc (gam)
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Độ cồn của dịch lên men
- Độ chua của dịch lên men
- Hàm lượng chất khô (TSS)
3.4.1.4 Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
Mẫu 1 (CT4.1): Hoạt hóa men khô: 1g men : 1g Glucose Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30 phút
Nấu 100g gạo nứt với 120g nước, sau đó trộn với lượng bột mốc theo tỷ lệ từ thí nghiệm 3 Đặt cơm rượu vào rổ và đậy khăn ẩm để ủ lên men ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ đầu Sau 24 giờ tiếp theo, chuyển cơm rượu vào bình và sau 24 giờ, thêm 200ml nước vào bình để tiếp tục quá trình lên men.
Mẫu 2 (CT4.2): Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g lượng bánh men gốc ban đầu, cho cơm rượu vào rổ đậy khăn ẩm ủ lên men ẩm ở 30°C trong 24 h đầu,
24 h tiếp theo cho cơm rượu vào bình, sau 24 h đem lên men dịch cho 200ml nước vào bình
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Độ cồn của dịch lên men
- Độ chua của dịch lên men
- Hàm lượng chất khô (TSS)
Phương pháp phân tích
3.4.2.1 Các phương pháp vi sinh a Phân lập vi sinh vật
Nguyên lý: Một lượng nhỏ vi sinh vật đã được pha loãng trước được dàn đều lên trên bề mặt hộp petri có chứa môi trường phân lập
Để tiến hành phân lập vi sinh vật, trước tiên, môi trường agar nóng chảy được đổ vào hộp petri đã vô trùng và để cho đặc lại Sử dụng pipetman hút 100µl dung dịch hỗn hợp vi sinh ở các nồng độ khác nhau và cho vào hộp petri chứa môi trường agar Sau đó, dùng que vô khuẩn để dàn đều dung dịch trên bề mặt agar Hộp petri được lật ngược và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30℃ Sau khoảng 24 giờ, tiến hành theo dõi và tách rời các khuẩn lạc trên môi trường đặc Cuối cùng, mô tả các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, hình dạng bào tử và đính bào tử của các chủng nấm mốc.
Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường Czapeck-dox, hình dạng khuẩn lạc được quan sát cả ở mặt trước và mặt sau Sau 48 giờ, hình thái tế bào, khuẩn ty và đính bào tử được kiểm tra dưới kính hiển vi Việc phân loại chủng nấm mốc phân lập được thực hiện dựa vào khóa phân loại nấm mốc và tài liệu của Barnett (1973) Phương pháp xác định số lượng nấm mốc trong chế phẩm cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.
Số lượng vi sinh vật được xác định thông qua phương pháp cấy trên đĩa petri với các môi trường phù hợp, có cơ chất đặc hiệu cho từng loài Sau thời gian nuôi cấy, số khuẩn lạc phát triển sẽ được đếm, và từ tỉ lệ pha loãng cùng với thể tích mẫu ban đầu, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu.
Dùng môi trường Czapeck-dox để định lượng nấm mốc d Giữ giống vi sinh vật
Chuẩn bị ống thạch nghiêng với môi trường agar đông đặc, sau đó cấy truyền vi sinh vật vào ống nghiệm Để ống nghiệm ở nhiệt độ tối ưu để vi sinh vật phát triển, sau đó bảo quản ở nhiệt độ lạnh khoảng 4℃.
3.4.2.2 Các phương pháp hóa sinh a Xác định độrượu: Sử dụng bộ cất cồn
Hàm lượng cồn trong rượu được xác định bằng bộ xác định độ cồn thông qua đo
32 điểm sôi của dung dịch (Lê Thanh Mai, 2005)
Trong quá trình lên men, dịch thường chứa cồn và một số chất bay hơi khi được đun nóng Do cồn có nhiệt độ sôi thấp hơn nước cất, nên dung dịch sẽ có độ sôi nhất định Từ đó, có thể tra bảng đã được tính sẵn để xác định độ cồn trong dịch theo thể tích.
Để tiến hành đo nhiệt độ sôi, đầu tiên cần đo nhiệt độ sôi của nước cất Chuẩn bị nước làm mát cho ống sinh hàn và lắp nhiệt kế vào đầu bình gia nhiệt, đảm bảo đầu trên của thanh gia nhiệt cách bầu thủy phân từ 1,5 - 2 cm Sử dụng nước cất hai lần để tráng bình cất, sau đó cho nước cất vào bình đến khi bề mặt lõm tiếp xúc với mép trên của vạch định mức (khoảng 50 ml) Bật lửa để đốt đèn cồn, sau 6 - 10 phút khi nhiệt độ ổn định, ghi lại nhiệt độ sôi và tắt máy Tiếp theo, tráng bình cất mẫu rượu và thực hiện cất rượu theo quy trình tương tự như với nước.
Để xác định độ rượu, sử dụng bảng chuẩn tra kết hợp với máy đo, xoay vòng để nhiệt độ sôi của nước cất hai lần trùng với giá trị 0% (v/v) Từ đó, đọc giá trị nhiệt độ sôi của mẫu rượu trên nhiệt kế để suy ra nồng độ rượu theo % (v/v) Đối với việc xác định độ chua của dịch lên men, áp dụng phương pháp trung hòa.
Nguyên lý đo độ chua trong dịch giấm dựa trên lượng NaOH 1N cần thiết để trung hòa axit tự do Cụ thể, một độ chua tương ứng với 1 ml NaOH 1N trong 20 ml dịch giấm, và khi số ml NaOH quy về 1N bằng 1, dịch giấm được xem là có độ chua bằng 1 Độ chua này cũng tương đương với 2,45g H2SO4 trên mỗi lít.
Để tiến hành, lấy 20ml dung dịch giấm chín hoặc dịch lên men cho vào bình tam giác chứa 50ml nước cất Sau đó, sử dụng NaOH 0,1N để chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, với phenolphtalein làm chất chỉ thị.
Tính kết quả: Độ chua được tính theo công thức: Độ chua = 10 n (độ)
Trong đó: n: Là số ml NAOH 0,1N tiêu hao khi định phân 20ml dịch lọc
Trong điều kiện lên men bình thường, độ chua (độ axit) của dịch giấm chín tăng
33 khoảng 0,5 đến 0,7 g/l so với độ chua của dịch đường hóa (Lê Thanh Mai, 2005) c Xác định nồng độ chất hòa tan (TSS)
Xác định TSS trong thời gian lên men dịch: xác định bằng chiết quang kế tự động DIGITAL REFACTOMETER – ATAGO (Nhật Bản) 0-53% Brix (± 0.2) theo TCVN 7771:2007
Nguyên lý khúc xạ ánh sáng cho thấy khi ánh sáng đi từ không khí vào môi trường chất lỏng, tia sáng sẽ bị lệch Sự lệch này cho phép chúng ta xác định nồng độ chất hòa tan trong dung dịch.
Để tiến hành đo hàm lượng chất khô, nhỏ vài giọt nước cất vào chiết quang kế điện tử và nhấn nút start để điều chỉnh về mức 0.0 Sau đó, lau sạch nước và nhỏ vài giọt mẫu lên chiết quang kế, nhấn start một lần nữa và đọc kết quả hiển thị trên thiết bị.
Tính kết quả: Đọc kết quả hiển thị, đó chính là hàm lượng chất khô tính theo % của mẫu đem phân tích d Xác định khảnăng phân giải tinh bột
Xác định bằng đường kính vòng thủy phân tinh bột của các chủng trên môi trường thạch đĩa có chứa tinh bột
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Czapeck (0,5% tinh bột) cho 40 đĩa petri 20ml (800ml) Hấp khử trùng 121℃ trong 30 phút, pH 5.0-5.5
Cho 20ml môi trường trên vào đĩa peptri đã vô trùng, các đĩa petri bằng nhau
Làm nguội, dùng que cấy chấm nhẹ các mẫu mốc vào giữa đĩa petri
Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ Cho thuốc thử và đo đường kính vòng phân giải
Thuốc thử lugol : 1g I2 và 0,5g KI trong 100ml nước cất, lắc cho tan hết e Phương pháp trích ly enzyme amylase.
Cân 5 gam sinh khối/ chế phẩm cho vào ống Falcon 50ml, bổ sung thêm 30ml nước cất, nuôi lắc 3 giờ tốc độ 180 vòng/ phút Ly tâm 6000 vòng /phút trong 10 phút Lấy dịch ở phía trên thu được dịch chiết ly enzym
3.4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Excel và Minitab 18
IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chủng giống bánh men đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định chất lượng và nồng độ rượu Do đó, việc lựa chọn loại bánh men giống là bước đầu tiên cần thiết để đảm bảo thành phẩm đạt yêu cầu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai mẫu men Đức Ngọ và Thái Nguyên cho độ rượu tốt và mùi thơm đặc trưng.
Phân l ậ p và tuy ể n ch ọ n ch ủ ng n ấ m m ố c Mucor, Rhizopus, Penicillium và
Phân lập nấm mốc trong bánh men
Hệ vi sinh vật trong bánh men bao gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, trong đó nấm mốc đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme amylaza, giúp thủy phân tinh bột thành đường, từ đó quyết định lượng cồn sinh ra trong quá trình lên men Để tối ưu hóa quá trình này, tôi sẽ tập trung vào phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao Quá trình bắt đầu bằng việc phân lập nấm mốc từ bánh men, sử dụng môi trường Czapeck-dox để nuôi cấy Sau khi tách được các khuẩn lạc riêng biệt, tôi sẽ tạo giống thuần chủng và tiến hành quan sát dưới kính hiển vi, kết hợp với việc phân loại dựa trên hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào theo tài liệu của Barnett (1973).
Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từbánh men Đức Ngọ
STT Kí hiệu Chủng vi sinh vật Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào
Hệ sợi rất phát triển, ban đầu màu trắng, sau đó sẫm hơn và ngả sang màu đen
Khuẩn ty đơn bào không có vách ngăn, bào tửkín Đầu sợi nấm là cuống bào tử nang Nang bào tử hình cầu, khi thành
35 của nang bào tử nứt ra giải phóng bào tử
Khuẩn lạc hình tròn, sợi mảnh, ngắn, có màu vàng hoa cau, khi già có màu xanh lục
Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn ngang, với bào tử trần và cuống mang bào tử phát triển từ tế bào chân Phần cuối của cuống phồng lên thành một bọng (vesicle), trên đó mọc lên các thể bình, từ các thể bình này sinh ra các chuỗi bào tử xòe ra giống như bông hoa cúc.
3 ĐN05 ĐN06 ĐN07 ĐN08 ĐN09
Khuẩn lạc hình tròn, sợi mảnh, ngắn, có màu đen
Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn ngang và bào tử trần, với cuống mang bào tử phát triển từ tế bào chân Phần cuối của cuống phồng lên thành một bọng (vesicle), trên đó mọc lên các thể bình Từ các thể bình này, chuỗi bào tử được sinh ra, xòe ra như bông hoa cúc.
4 ĐN10 ĐN11 Nấm mốc Penicilium
Khuẩn lạc hình tròn sợi rất ngắn, có màu xanh nhạt,ở trung
Khuẩn ty đa nhân có vách ngăn, bào tử trần, cuống mang bào tử
36 tâm lồi lên, có những rãnh từ trung tâm đi ra hình thành ngay lớp thể bình và các bào tử
Khuẩn ty có màu đen, rễ cắm sâu vào cơ chất, ban đầu có màu trắng, sau đó có màu đen hoàn toàn
Khuẩn ty đơn bào, hông có vách ngăn, bào tử kín Trên khuẩn ty hình thành những nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất
Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên
STT Kí hiệu Chủng vi sinh vật Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào
Khuẩn lạc hình tròn sợi rất ngắn, có màu xanh nhạt,ở trung tâm lồi lên, có những rãnh từ trung tâm đi ra
Khuẩn ty đa nhân có vách ngăn, bào tử trần, cuống mang bào tử hình thành ngay lớp thể bình và các bào tử
Khuẩn ty có màu đen, rễ cắm sâu vào cơ chất, ban đầu có màu trắng, sau đó có
Khuẩn ty đơn bào, hông có vách ngăn, bào tử kín Trên khuẩn ty hình thành những
37 màu đen hoàn toàn nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất
Khuẩn lạc hình tròn, sợi mảnh, ngắn, có màu vàng hoa cau, khi già có màu xanh lục
Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn ngang và bào tử trần, với cuống mang bào tử phát triển từ tế bào chân Phần cuối của cuống phồng lên thành một bọng (vesicle), trên đó mọc lên các thể bình Từ các thể bình này, chuỗi bào tử sinh ra và xòe ra như bông hoa cúc.
Sau khi hoàn thành quá trình phân lập từ hai mẫu bánh men Đức Ngọ và Thái Nguyên, chúng tôi đã thu được 1 chủng Mucor, 2 chủng Rhizopus, 8 chủng Penicillium, 10 chủng Aspergillus oryzae và 5 chủng Aspergillus niger.
Hình 4.1: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc
Hình 4.3: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Penicilium.
Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc
Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor
Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc
Hình 4.7: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Rhizopus
Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc
Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger
Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc
Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được
Các chủng nấm mốc được phân lập sẽ được kiểm tra khả năng phân giải tinh bột bằng phương pháp cấy chấm điểm mốc trên môi trường Czapeck có bổ sung tinh bột Dịch chiết enzyme amylase từ các chủng nấm mốc sẽ được sử dụng để đánh giá hoạt tính phân giải tinh bột, với điều kiện nuôi ở nhiệt độ 30°C.
Sau 48 giờ kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử Lugol, đường kính vòng thủy phân tinh bột được đo lường Đường kính này tỉ lệ thuận với khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc, nghĩa là đường kính càng lớn thì khả năng phân giải tinh bột của chủng nấm mốc càng cao Kết quả thu được cho thấy mối liên hệ rõ ràng giữa kích thước vòng thủy phân và hiệu quả phân giải tinh bột.
Bảng 4.3: Khảnăng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc
STT Chủng mốc Đường kính vòng thủy phân tinh bột
Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae
Hình 4.52: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus niger
Hình 4.63: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium
Hình 4.74: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Mucor
Hình 4.85: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus
Bảng 3.4 cho thấy các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột khác nhau Trong đó, chủng nấm Mucor có khả năng phân giải tốt nhất với đường kính vòng thủy phân tinh bột đạt 1,4 cm, tiếp theo là Rhizopus (1,2 cm), Penicillium (0,9 cm) và Aspergillus có khả năng phân giải kém nhất với 0,7 cm Do đó, chủng nấm Mucor (ĐN01) được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
K ế t qu ả nghiên c ứu xác định điề u ki ệ n nhân sinh kh ố i t ừ ch ủ ng n ấ m m ố c đã tuyể n ch ọ n
Ảnh hưở ng c ủ a th ờ i gian lên quá trình nhân sinh kh ố i t ừ ch ủ ng n ấ m m ố c đã tuyể n ch ọ n
Trong nuôi sinh khối lỏng, các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và số vòng lắc có tác động trực tiếp đến sự phát triển của nấm mốc Chúng tôi đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để xác định lượng sinh khối thu được sau khi kết thúc quá trình nuôi.
4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
Nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 được thực hiện trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C với tốc độ lắc 150 vòng/phút Sau khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, mẫu được lấy ra để cân lượng sinh khối thu được, và kết quả được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quảảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l)
Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Lư ợn g sin h kh ối (g am )
Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Lượng sinh khối thu được (gam)
Từ bảng 4.4 và đồ thị 4.16, có thể nhận thấy rằng trong khoảng thời gian từ 24 đến 36 giờ, chủng nấm mốc ĐN01 phát triển mạnh nhất với lượng sinh khối gia tăng đạt 4,13g Tuy nhiên, từ 36 đến 48 giờ, sự phát triển của chủng nấm này chậm lại, chỉ tăng thêm 0,25g sinh khối Do đó, thời gian nuôi sinh khối tối ưu nên được chọn là từ 24 đến 36 giờ để đạt được lượng sinh khối lớn nhất và rút ngắn thời gian nuôi.
Ảnh hưở ng c ủ a nhi ệt độ lên quá trình nhân sinh kh ố i t ừ ch ủ ng n ấ m m ố c đã tuyể n ch ọ n
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành nuôi sinh khối của chủng nấm mốc ĐN01 trong môi trường Czapeck lỏng trong 36 giờ, với tốc độ lắc 150 vòng/phút và nhiệt độ nuôi lần lượt là 28°C, 30°C và 32°C Sau khi kết thúc quá trình nuôi, chúng tôi đã thu thập mẫu và cân trọng lượng sinh khối thu được Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quảảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l)
Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Theo bảng 4.5 và đồ thị 4.16, chủng nấm mốc ĐN01 phát triển tốt nhất ở khoảng nhiệt độ 30÷32°C, với lượng sinh khối cao nhất Trong khi đó, nhiệt độ từ 28°C đến dưới 30°C và trên 32°C không phải là điều kiện tối ưu, dẫn đến lượng sinh khối thấp hơn so với nhiệt độ 30÷32°C Cụ thể, ở nhiệt độ 30°C, chủng nấm mốc ĐN01 cho thấy khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất.
4.2.2 Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
Nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 được thực hiện trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C trong 36 giờ, với các tốc độ lắc lần lượt là 100, 150 và 200 vòng/phút Sau khi kết thúc quá trình nuôi, mẫu sinh khối thu được được cân và kết quả được trình bày trong bảng 4.6.
Lư ợn g sin h kh ối (g am )
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Lượng sinh khối thu được(gam)
Bảng 4.6: Kết quảảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn
STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l)
Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Theo bảng 4.6 và đồ thị 4.18, nuôi lắc nấm mốc ở tốc độ 200 vòng/phút cho lượng sinh khối trung bình lớn nhất Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật cần đủ oxy; nếu thiếu, chúng sẽ chết hoặc chuyển sang trạng thái yếm khí Tỷ lệ tăng trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật hiếu khí và kị khí phụ thuộc vào lượng oxy hòa tan trong môi trường Rung lắc bình giúp tăng diện tích tiếp xúc với không khí, từ đó tăng lượng oxy hòa tan Tuy nhiên, cần tránh tăng tốc độ lắc quá cao vì có thể gây ra ứng suất cắt.
Lư ợn g sin h kh ối (g am )
Số vòng lắc (vòng/phút )
Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01
Lượng sinh khối thu được (gam)
Ảnh hưở ng c ủ a s ố vòng l ắ c lên quá trình nhân sinh kh ố i t ừ ch ủ ng n ấ m
có thể gây hại cho tế bào vi sinh vật Bởi vậy, ta chọn số vòng lắc khi nuôi nấm mốc là 200 vòng/phút.
