Khóa luận phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn diclomethan của nấm cổ cò ganoderma flexipes pat , họ ganodermataceae thu hái tại tây nguyên

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Ganoderma

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Ganoderma

Chi Ganoderma, thuộc họ Ganodermataceae Donk, bao gồm 219 loài được phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ Tại Việt Nam, các nghiên cứu của GS.TSKH Trịnh đã chỉ ra sự đa dạng của chi này trong hệ sinh thái địa phương.

Tam Kiệt là một chi nấm với khoảng 80 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới Tại vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên Việt Nam, đã xác định được 25 loài nấm thuộc chi Tam Kiệt.

Ganoderma chủ yếu phát triển dưới tán rừng lá rộng thường xanh, nhưng cũng có thể tìm thấy trong các sinh cảnh như rừng lá rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng và lá kim, cũng như rừng hỗ giao tre nứa Thời gian xuất hiện của các loài Ganoderma thường từ tháng 5 đến tháng 12 hàng năm.

Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) chi Garnoderma Karst thuộc:

Bộ nấm đa tầng (Polyporales)

Chi Ganoderma Karst [3] Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

Quả thể nấm có thể có cuống hoặc không, mọc trên gỗ với mũ nấm bóng láng, thường có hình dạng thận hoặc quạt, đôi khi tròn Thịt nấm có màu nâu, có kết cấu dai từ chất gỗ đến chất bì Hệ thống ống nấm chủ yếu là một tầng, nhưng cũng có một số ít hai tầng Bào tử nấm có hình dạng trứng nhụt ở một đầu, với vỏ bào tử gồm hai lớp: lớp ngoài nhẵn và lớp trong có gai nhẹ, mang màu vàng gỉ sắt Các đặc điểm hình thái của nấm có thể thay đổi do sự khác biệt trong canh tác ở các vùng địa lý và điều kiện khí hậu khác nhau, cũng như sự phát triển di truyền tự nhiên của từng loài.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Chi Ganoderma chứa gần 90% là nước, trong khi 10% khối lượng còn lại chủ yếu là protein (10 - 40%), carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và khoáng chất Protein từ nấm Ganoderma cung cấp đầy đủ các axit amin thiết yếu, đặc biệt giàu lysine và leucine Triterpen và polysaccharit là nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm thuộc chi này.

Terpen là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc carbon gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren, được chia thành bốn nhóm chính: mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (C10 và C15), diterpen ít bay hơi (C20), triterpen và sterol (C30), cùng với các sắc tố caroten (C40) Đặc biệt, nghiên cứu về nấm Linh chi chủ yếu tập trung vào các dạng triterpene và sterol ít bay hơi.

Triterpen là các hợp chất được hình thành từ 6 đơn vị isopren Đến nay, hàng trăm hợp chất triterpen đã được tách chiết từ các dung môi như methanol, ethanol, acetone và chloroform, lấy từ bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của nhiều loại nấm.

Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36]

Năm 1982, Kubota lần đầu tiên phân lập axit ganoderic A và B từ nấm Ganoderma lucidum (FR.) KARST Từ đó, đã có hơn 316 triterpen được chiết xuất từ cơ thể đậu quả, bào tử và sợi nấm của nhiều loại nấm Linh chi thuộc chi Ganoderma.

Cấu trúc hóa học của triterpen, dựa trên lanostane - một chất chuyển hóa của lanosterol, thường được phân loại thành hai nhóm chính là ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27) Nghiên cứu của Cole R J đã chỉ ra những đặc điểm quan trọng của các hợp chất này.

Schweikert M A đã phân lập hơn 130 hợp chất dẫn xuất của lannosterol từ nấm Linh chi, bao gồm acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, và acid lucidenic Các triterpen này tồn tại dưới dạng tự do, có cấu trúc vòng và mang nhiều nhóm chức như -OH, -OAc, -O- (eter), C=O, và nối đôi C=C Với cấu trúc hóa học phức tạp và mức độ oxy hóa cao, các hợp chất này có đặc tính chung là tính thân dầu.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU: Substances are well-soluble in hydrocarbon solvents such as petroleum ether, n-hexane, diethyl ether, and chloroform, but are only slightly soluble in water unless they combine with sugars to form glycosides.

Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây

6 Hình 1.1 Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1]

Bảng 1.1 Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma

STT Triterpen R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Nguồn gốc TLTK

7,9(11),24-trien- 3β,15α,22β- triacetoxy-26-oic β- OAc α- OAc β- OAc

4 Ganorbiformin G O H OAc H Me COOH G orbiforme [25]

7 Hình 1.2 Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1]

Bảng 1.2 Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma

STT Triterpen R1 R2 R3 R4 R5 Nguồn gốc TLTK

2 Acid lucidenic C β-OH β-OH β-OH Me

3 Acid 20-hydroxylucidenic N β-OH β-OH H OH COOH G lucidum

5 20-hydroxylucidenic acid A O OH β-OH COOH G sinense [39]

8 Hình 1.3 Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1]

Bảng 1.3 Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma

OAc β-OH α-Me O H COOH Me

3 Acid ganoderic V O α-OH H H α-OAc α-Me H Δ 24-25 Me COOH

4 Acid ganoderic W α-OAc α-OH H H α-OAc α-Me H Δ 24-25 Me COOH [1]

Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) đã lần đầu tiên phân lập thành công một sterol mới mang tên Ganoderin A từ dầu bào tử nấm Linh chi thông qua phương pháp chiết xuất CO2 siêu tới hạn Cấu trúc của Ganoderin A được xác nhận là chưa từng được biết đến trước đây.

Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi

Bảng 1.4 Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma

STT Sterol Nguồn gốc TLTK

3 5α-ergost-7-en-3β-ol, 5α- ergosta-7,22-dien-3β-ol

Polysaccharit của linh chi là các polymer thiên nhiên với cấu trúc đa dạng và phức tạp Đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma Các polysaccharit này chủ yếu gồm hai loại chính: GL – A (galactan) và GL – B (glucan) Các nghiên cứu cho thấy polysaccharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và các heteropolysaccharit khác với một số monosaccharit như glucose, galactose, mannose và fucose Hầu hết các polysaccharit này hình thành từ ba chuỗi monosaccharit với cấu trúc xoắn ốc ba chiều, tương tự như cấu trúc của ADN và ARN.

Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000

- 1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2]

Từ xa xưa, nấm Linh chi đã được ghi nhận trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng bảo vệ sức khỏe Ngày nay, với sự phát triển của khoa học hiện đại, đặc biệt trong lĩnh vực phân tử học và dược lý lâm sàng, hàng trăm nghiên cứu đã khẳng định công dụng của nấm Linh chi Các nghiên cứu cho thấy tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ yếu nhờ vào triterpen và polysaccharit.

1.1.3.1 Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

Nấm Linh chi đã thu hút sự chú ý trong nghiên cứu và ứng dụng nhờ vào tác dụng chống ung thư của nó Nhiều nghiên cứu khoa học đã được công bố, khẳng định hiệu quả của loại nấm này trong việc hỗ trợ điều trị ung thư.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò

Nấm Cổ cò, có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có nguồn gốc từ Việt Nam Nghiên cứu phát sinh gen trước đây đã chỉ ra rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012).

Ganoderma atrum, Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense và Ganoderma parviungulatum, được mô tả bởi Giáo sư Ji-Ding Zhao và các cộng sự vào những năm 1979 và 1986, đều được tìm thấy rộng rãi ở châu Á cận nhiệt đới và nhiệt đới Cao và cộng sự (2012) đã đề xuất rằng các loài này từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc là đồng nghĩa với G.flexipes.

Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat

Giới : Mycota hay Fungi Ngành : Eumycota

Lớp : Hymenomycetes Lớp phu ̣ : Hymenomycetidae

Họ : Ganodermataceae Chi : Ganoderma Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat

Hình 1.4 Nấm Cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên a Quả thể b Bào tử c Bào tầng

Quả thể nấm có màu nâu đỏ với kích thước khoảng 1,5-10 x 1,0-7,0 cm và độ dày từ 0,5-1,0 cm Mũ nấm khi còn non có hình dạng vòi, sau đó phát triển thành dạng quạt hoặc móng nhỏ Bề mặt mũ nấm gồ ghề, có cấu trúc vòng đồng tâm và vân thớ phóng xạ, mép mũ ít lượn sóng và không chia thùy Thước đo tự nhiên là 2cm, thước đo hiển vi 2àm và thước đo bào tầng là 0.5 mm.

Thịt nấm chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu

Hệ sợi dimitric bao gồm sợi không vách ngăn ngang và sợi bện, với kích thước từ 1,5-7,0 mm Trong môi trường nuôi cấy trên môi trường thạch (môi trường thuần khiết), hệ sợi này ban đầu có màu trắng và sau đó chuyển sang màu vàng nhạt.

Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4-7 ống, miệng ống nấm tròn đều Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt

Bào tử hình trứng nhụt một đầu có kích thước từ 6,5-7,5 x 7,5-9,0 (x10), với màng hai lớp, trong đó màng ngoài nhẵn và màng trong có gai nhẹ, có màu rỉ sắt Đảm đơn bào có hình chụy ngắn, kích thước từ 7-12 àm, với màng mỏng và nội chất trong suốt không màu Mỗi đảm chứa từ 3-4 cuống mang bào tử.

Nấm có cuống dài mọc rời gốc, đính bên, nấm mọc ký sinh hay hoại sinh trên cây gỗ mục gỗ màu trắng

Nấm phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy nhân tạo

Nấm mọc trên gốc cây sống hoặc đã chết của nhiều loài cây gỗ, đây là loài phân bố rộng ở các tỉnh Tây Nguyên [3, 52]

Tình hình nghiên cứu về nấm Cổ cò

Khi thực hiện tra cứu trên ba trang web Sciencedirect, ncbi.nlm.nih.gov và Scifinder với các từ khóa "Ganoderma", "Ganoderma lucidum" và "Ganoderma flexipes", chúng tôi thu được kết quả như trình bày trong bảng 1.5.

Bảng 1.5 Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính đến tháng 7/2018

Từ khóa Sciencedirect ncbi.nlm.ih.gov Scifinder

Kết quả bảng cho thấy rằng có nhiều công bố nghiên cứu liên quan đến chi Ganoderma, chủ yếu tập trung vào loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), trong khi các nghiên cứu về nấm Cổ cò vẫn còn hạn chế Hai công bố trên các website liên quan đã được ghi nhận.

Theo nghiên cứu của Da Yu Cheng (2012), loài nấm Cổ cò được xác định phân bố tại vùng nhiệt đới trên xác thực vật hạt kín, trong bối cảnh đa dạng các loài nấm lỗ polypore ở Trung Quốc có chú thích địa lý.

Một nghiên cứu của Li Wei Zho và cộng sự (2015) đã phân tích đa dạng các loài nấm gỗ thuộc họ nấm lỗ polypore, xác định các loài như Ganoderma curtisii, Ganoderma flexipes, Ganoderma lingzhi và Ganoderma multipileum.

Ganoderma resinaceum, Ganoderma sessile, Ganoderma sichuanense và Ganoderma tropicum thuộc cùng một nhánh phát sinh (Clade A)

Nghiên cứu của Nguyễn Phương Đại Nguyên và Trịnh Tam Kiệt về loài nấm Cổ cò tại Việt Nam chủ yếu chỉ dừng lại ở việc mô tả thực vật và phân bố Từ đó, có thể thấy rằng các nghiên cứu trong và ngoài nước về loài nấm này còn rất hạn chế, chủ yếu tập trung vào công bố về thực vật và sinh thái mà chưa có nhiều thông tin sâu rộng.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào cơ thể đậu quả của nấm Cổ cò, được thu hái tại Tây Nguyên vào tháng 12 năm 2017 Mẫu nấm này đã được xác định tên khoa học là.

Ganoderma flexipes Pat được nghiên cứu bởi TS Nguyễn Phương Đại Nguyên thuộc Bộ môn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên Mẫu mã số DL 001, tiêu bản mẫu số GF1217 hiện đang được bảo quản tại Khoa Hóa học, Viện Dược liệu.

Hình 2 Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat.

Hóa chất, thiết bị

Các dung môi hóa chất được sử dụng trong phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV bao gồm: nước cất hai lần (H2O), dung môi ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH) và n-hexan.

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol để phát hiện vết chất

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi)

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Bếp điện, bếp đun cách thủy

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Máy siêu âm Power sonic 405

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

The mass volume of electron spray ionization mass spectrometry (ESI-MS) was measured using the AGILENT 1100 LC-MSD Trap at the Institute of Natural Compound Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

Nấm Cổ cò được chế biến bằng cách phơi khô và xay nhỏ toàn bộ nấm, sau đó chiết xuất nóng ở 65ºC với methanol trong ba lần, mỗi lần kéo dài 3 giờ Sau khi lọc để loại bỏ bã dược liệu, dịch chiết được gộp lại và dung môi được thu hồi dưới áp suất giảm để thu được cao tổng Cao này được hòa trong nước và chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, DCM và EtOAc, từ đó thu được các phân đoạn n-hexan, DCM, EtOAc và phân đoạn nước.

Các hợp chất trong các phân đoạn của nấm Cổ cò đã được phân lập thông qua phương pháp sắc ký cột, sử dụng silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) và pha đảo RP – 18.

Theo dõi và kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 và RP-18 (Merck) Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol làm thuốc thử.

Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp

Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng TLC, HPLC với các hệ dung môi phù hợp

Để rửa giải hiệu quả, việc lựa chọn hệ dung môi phù hợp là rất quan trọng Qua khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, cần xác định hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất để sử dụng làm dung môi rửa giải.

Để chuẩn bị cột sắc ký, bạn cần chọn cột có kích thước phù hợp, sau đó rửa sạch và sấy khô Cột nên được lắp thẳng đứng trên giá cố định, và nhớ lót một lớp bông xung quanh vị trí vít để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình sử dụng.

Cân một lượng chất nhồi cột phù hợp vào cốc có mỏ, sau đó thêm dung môi thích hợp và khuấy đều để loại bỏ bọt khí, tạo thành hỗn dịch Mở khóa cột và từ từ rót hỗn dịch lên cột, đồng thời gõ nhẹ xung quanh thân cột bằng quả bóp cao su để đảm bảo phân phối đều Sau khi pha tĩnh đã được đưa lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy qua cột liên tục cho đến khi cột ổn định hoàn toàn.

10 giờ) Chú ý không được để cột bị khô dung môi làm nứt cột

Nạp mẫu khô là quá trình trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, sau đó làm bay hơi dung môi cho đến khi thu được bột tơi mịn Cuối cùng, mẫu được đưa lên cột và rải thành một lớp đều đặn trên chất nhồi cột.

Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ nhàng dọc quanh thành cột

Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt tiếp xúc

Rửa giải là quá trình sử dụng dung môi phù hợp để tách các hợp chất Dịch rửa giải được thu thập vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích thích hợp Để kiểm tra các phân đoạn, sắc ký lớp mỏng được áp dụng để xác định sự tương đồng, từ đó gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, bao gồm cả những phân đoạn chứa chất cần tinh chế.

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc

Nhận dạng các chất phân lập được thực hiện dựa vào số liệu từ các phổ cộng hưởng hạt nhân một chiều và hai chiều như 1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY, cùng với phổ khối (MS) và các đặc trưng lý hóa như điểm chảy và cảm quan Phổ khối lượng (MS) đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc và tính chất của các hợp chất.

Phổ khối lượng cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử thông qua tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion, ký hiệu là m/z Để xác định khối lượng phân tử (M), cần biết số điện tích của ion.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Tùy thuộc vào mục đích và độ phức tạp của cấu trúc, có thể tiến hành đo một hoặc nhiều loại phổ khác nhau Việc xác định phổ cho cùng một loại hạt nhân, chẳng hạn như hạt nhân 1H, là rất quan trọng trong nghiên cứu.

13C) như trong các phổ một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữacác loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phổ proton (1H-NMR) cung cấp thông tin về môi trường hóa học của các proton trong phân tử, với mỗi proton có môi trường khác nhau sẽ dẫn đến sự dịch chuyển hóa học khác nhau Trên phổ, các proton hoặc nhóm proton có cùng môi trường hóa học sẽ xuất hiện dưới dạng một đỉnh, có thể là đỉnh đơn, đôi, ba hoặc nhiều hơn, lên tới 7 đỉnh thành phần Diện tích của mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton tương ứng, do đó, bằng cách phân tích diện tích đỉnh, ta có thể xác định số lượng proton của đỉnh đó.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp thông tin quan trọng về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố có sự dịch chuyển trong khoảng 0-60 ppm, trong khi carbon liên kết đơn với oxy (như alcol và ether) có dịch chuyển từ 45-85 ppm Đối với carbon lai hóa sp2, sự dịch chuyển nằm trong khoảng 100-150 ppm, và nếu có liên kết đôi với oxy, dịch chuyển có thể lên tới 240 ppm Kỹ thuật đo phổ hiện tại cho thấy phổ NMR của carbon gồm các vạch đơn, mỗi vạch tương ứng với một carbon, và có thể có nhiều carbon nếu chúng có cùng môi trường hóa học.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn diclomethan

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò

Nấm Cổ cò được chế biến bằng cách phơi khô và xay nhỏ cả tán và thân nấm (5,7 kg), sau đó chiết nóng ở 65ºC với MeOH trong 3 lần, mỗi lần 3 giờ Dịch chiết thu được được gộp lại và cất dưới áp suất giảm, cho ra cao tổng 245 g với hiệu suất 4,3% Tiếp theo, 240 g cao tổng được bổ sung với 1 lít nước và chiết phân bố bằng các dung môi n-hexan, DCM, và EtOAc Sau khi loại bỏ dung môi, các phân đoạn thu được gồm n-hexan (HNCC, 12,2 g), DCM (DNCC, 46,4 g), EtOAc (ENCC, 23,1 g), và nước (WNCC, 157,3 g) Quy trình chiết xuất được minh họa trong hình 3.1.

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Nấm Cổ cò

Kết quả phần chiết xuất như hình 3.1 cho thấy:

+ Hàm lượng cao tổng thấp chiếm 4,3% so với khối lượng mẫu dược liệu khô

+ Lượng cao phân đoạn được sắp xếp như sau: cao phân đoạn nước

> cao phân đoạn DCM > cao phân đoạn EtOAc > cao phân đoạn n-hexan

Lượng cao phân đoạn DCM trong nghiên cứu về nấm Cổ cò cho thấy hàm lượng các chất có độ phân cực trung bình khá cao, chỉ sau phân đoạn nước Mặc dù chưa có công bố về thành phần hóa học của nấm Cổ cò, nhưng các nghiên cứu về loài nấm cùng chi như Ganoderma lucidum cho thấy các hợp chất này thường là ergosterol hoặc lanostan-triterpen Để xác định hệ dung môi sắc ký cột, tiến hành sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn n-hexan, DCM, EtOAc và cao tổng.

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn nấm Cổ cò

(Hình A: Sắc ký đồ TLC dưới ánh sáng thường, sau khi phun thuốc thử

H 2 SO 4 10% trong cồn tuyệt đối, tº

Hình B: Sắc ký đồ TLC tại bước sóng 366 nm, sau khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, tº)

Hệ dung môi triển khai: n-hexan/EtOAc/MeOH (20/5/3)

Kết quả sắc ký đồ TLC với hệ dung môi n-hexan/EtOAc/MeOH = 20/5/3, các vết cho sự phân tách khá tốt, đặc biệt là phân đoạn DCM

Sắc ký đồ TLC và kết quả chiết xuất cho thấy phân đoạn DCM có tiềm năng lớn, vì vậy nhóm nghiên cứu quyết định chọn phân đoạn này để tiến hành sắc ký cột nhằm phân lập các chất tinh khiết.

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn DCM của nấm Cổ cò

Cân 45 g cao phân đoạn DCM của nấm Cổ cò (DNCC) tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: n-hexan:EtOAc:MeOH (100% - 5:1:1 - 0:2:1) thu được 7 phân đoạn nhỏ ký hiệu là DNCC1-7

Tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel RP-18 phân đoạn

DNCC4 (19.3 g) với hệ dung môi rửa giải Aceton:H2O (2:1 - 20:1), thu được 2 phân đoạn ký hiệu là DNCC4.1-4.2

Phân đoạn DNCC4.2 (6.3 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi Aceton:H2O (7:1 - 25:1) thu được 2 hợp chất ký hiệu là

NCC03 (15 mg) và NCC06 (10 mg)

Bằng các kỹ thuật chiết xuất và sắc ký như sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột, hai hợp chất NCC03 và NCC06 đã được phân lập thành công từ phân đoạn.

DNCC cần được kiểm tra độ tinh khiết thông qua sắc ký HPLC trước khi tiến hành đo phổ NMR và MS để xác định cấu trúc hóa học.

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao nấm Cổ cò phân đoạn DCM 3.1.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết

Sau khi thực hiện phân lập TLC để kiểm tra độ tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành chạy HPLC nhằm xác định chính xác hơn độ tinh sạch của NCC03 và NCC06.

Các thông số kỹ thuật của chương trình chạy HPLC:

- Hệ thống sắc ký HPLC-DAD Shimadu

- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút

- Pha động: Acetonitril (ACN) – Acid phosphoric 0.1% trong nước

Chương trình HPLC cho các chất NCC03 và NCC06 là:

- Chương trình KT ACN80: ACN 80%

- Chương trình KT ACN100: ACN 100%

Hình 3.4 Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2 hợp chất

Hợp chất NCC03 phát hiện tại PDA là 243 nm, có thời gian lưu tại 16 phút và đạt độ tinh sạch là 90,336% tính theo diện tích píc

Hợp chất NCC06 phát hiện tại PDA là 244 nm, có thời gian lưu tại 27,5 phút và đạt độ tinh sạch là 90,62% tính theo diện tích píc

Bằng phương pháp sắc ký đồ HPLC, hai hợp chất NCC03 và NCC06 đã được xác định là sạch và đủ tiêu chuẩn để tiến hành đo phổ NMR và MS, phục vụ cho việc xác định cấu trúc hóa học.

Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06

Hợp chất NCC03 phân lập được có dạng bột không màu Nhiệt độ nóng chảy của hợp chất trong khoảng: 168-170ºC

Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC03 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 505,0 [M+Na] + cho gợi ý một công thức phân tử là C32H50O3 có khối lượng tính toán là 482,4

Trong phổ 1 H-NMR của hợp chất NCC03, có 8 nhóm methyl được ghi nhận, trong đó bao gồm một nhóm acetoxyl tại δ H 2,05 Bên cạnh đó, có 6 tín hiệu singlet tại các vị trí δ H 0,57, 1,00, 0,89, 0,96, 0,88 và 1,67 Ngoài ra, có 1 tín hiệu douplet tại δ H 0,92 (d, J = 6,5 Hz) và 3 tín hiệu proton của 3 olefin tại δ H 5,46 (1H, br s, H-7), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-11) và 5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24) Cuối cùng, có 3 tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thấp tại δ H 4,51 (1H, dd, J = 4,5 & 11,5 Hz, H-3), 4,00 (2H, s, H-26) đặc trưng cho các liên kết với oxy

Các tín hiệu proton này hoàn toàn trùng khớp khi phân tích phổ

Phổ 13C-NMR và DEPT đã ghi nhận tín hiệu của 32 carbon, bao gồm 01 tín hiệu acetyl tại δ C 171,0 và 21,3; 7 tín hiệu nhóm methyl tại δ C 15,7, 22,8, 28,1, 16,9, 25,6, 13,7 và 18,4; cùng 3 cặp olefin tại δ C 119,9, 142,8, 145,7, 116,6, 127,0, và 134,4 Phân tích tương tác H→C trên phổ HSQC cho phép xác định vị trí C3 tại δ C 80.9 và tín hiệu hydromethylen tại δ C 69,1.

Bằng tương tác xa H → C trên phổ HMBC cho xác định các tương tác sau:

+Các tương tác của các nhóm methyl trong cấu trúc của lanostan (xem

+ Tương tác H3 (δ H 4,51) → COO (δ C 171,0); cho xác định vị trí acetyl hóa tại C3

69,1) cho xác định vị trí hydroxy tại C26

Kết quả phân tích phổ 1D, 2D-NMR và phổ ESI-MS, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [31], cho thấy rằng hợp chất NCC03 đã được xác định.

3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol có cấu trúc như hình 3.5

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03 (3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol) 3.2.2 Hợp chất NCC06

Hợp chất NCC06 phân lập được có dạng bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ: 179–181 o C

Phổ khối ESI-MS của hợp chất NCC06 cho tín hiệu píc ion tại m/z: 441,3 [M+H] + cho gợi ý một công thức phân tử là C30H48O2 có khối lượng tính toán là 440,3

Trên phổ 1D-NMR (1H-, 13C-NMR, DEPT) của hợp chất NCC06, tín hiệu thu được tương tự như của hợp chất NCC03, tuy nhiên, hợp chất NCC06 không xuất hiện tín hiệu của nhóm acetyl.

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NCC06, có 7 nhóm methyl với 6 tín hiệu singlet tại δ H 0,57, 1,01, 0,88, 0,99, 0,88 và 1,67, cùng với 1 tín hiệu doublet tại δ H 0,92 (d, J = 6,5 Hz) Ngoài ra, còn có ba tín hiệu proton của 3 olefin tại δ H.

5,47 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz), 5,40 (1H, t, J = 7,0 Hz); ba tín hiệu proton có độ dịch chuyển về trường thấp tại δ H 3,25 (1H, J = 4,5 &

11,5Hz), 4,00 (2H, s) đặc trưng cho các liên kết với oxy

Các tín hiệu proton này hoàn toàn trùng khớp khi phân tích phổ

Phổ 13C-NMR và DEPT đã cho tín hiệu của 30 carbon, trong đó có 7 tín hiệu nhóm methyl tại các δ C 15,7, 22,8, 25,6, 28,1, 15,8, 13,7 và 18,4 Ngoài ra, tín hiệu nhóm hydroxymethin tại δ C 79,0 và tín hiệu nhóm hydroxymethylen tại δ C 69,1 cũng được ghi nhận Vị trí các carbon khác được xác định dựa trên tín hiệu từ phổ thực nghiệm và so sánh với tài liệu tham khảo về hợp chất ganodermadiol Kết quả phân tích dữ liệu phổ cho phép kết luận rằng hợp chất NCC06 đã được xác định.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU là lanostan 7,9(11),24-triene-3β,26-diol, còn gọi là ganodermadiol, có công thức như hình 3.6

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06

Bảng 3 Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06

NCC03 ( 500MHz, CDCl3 ) NCC06 ( 500MHz, CDCl3 )

Bàn luận

Đề tài nghiên cứu phương pháp chiết nóng dược liệu khô đã nghiền nhỏ nhằm thu được lượng cao tổng nhanh chóng và hiệu quả Ở nhiệt độ cao, quá trình khuếch tán các chất trong dược liệu diễn ra nhanh và triệt để hơn Dung môi MeOH được lựa chọn vì dễ kiếm, giá thành rẻ và có khả năng hòa tan nhiều nhóm chất trong dược liệu Ngoài ra, phương pháp lỏng - lỏng với dicloromethan cũng được sử dụng do dung môi này có độ phân cực trung bình yếu, giúp hòa tan tốt các thành phần cần thiết.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU nhóm chất steroid và triterpen Hai nhóm chất này đều rất đặc trưng cho chi

Ganoderma Thực tế thí nghiệm cũng cho thấy lượng cao phân đoạn dicloromethan cũng cao nhất

3.3.2 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất

Bằng phương pháp sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo, nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập hai hợp chất tinh khiết từ phân đoạn DCM của dịch chiết nấm Cổ cò Đây là lần đầu tiên hai hợp chất này được phân lập từ loài G flexipes.

Sử dụng các phương pháp truyền thống trong nhận dạng cấu trúc, bao gồm đặc tính lý hóa và các phổ cộng hưởng từ hạt nhân, đã giúp xác định cấu trúc của hai hợp chất.

Hợp chất NCC03: từ kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với tài liệu tham khảo [31] xác định được NCC03 có cấu trúc lanostan triterpen:

Hợp chất NCC06: cũng thuộc nhóm cấu trúc lanostan triterpen: lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol, chính là ganodermadiol Hợp chất này trước đó đã được phân lập từ G.lucidum, G.pfeifferi [34], G.curtisii [26]

Hoạt tính sinh học của hợp chất NCC06 (lanostan-7,9(11),24-trien- 3β,26-diol)

Năm 2003, Mothana R A A [34] phân lập được hợp chất NCC06 từ loài

Ganoderma pfeifferi và hoạt tính kháng virus của các hợp chất lanostan triterpen đã được nghiên cứu Qua phương pháp nhuộm tế bào, các tác giả phát hiện ganodermadiol có khả năng bảo vệ tế bào Vero khỏi virus HSV type.

1 với giá trị ED50 0,068 mmol/l và tế bào MDCK chống lại virut cúm A với giá trị lớn hơn 0,22 mmol/L Trong một nghiên cứu khác của Jiao Y và cộng sự

Hợp chất này đã được phân lập từ loài Ganoderma curtisii và được xác định có khả năng ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào tiểu thần kinh đệm do LPS gây ra.

IC50 13,72 ± 0,61 àM (sử dụng quercetin làm chứng với IC50 là 15,13 ± 0,62 àM)

Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất đã làm rõ thành phần hóa học của loài G flexipes, đồng thời cung cấp thêm dữ liệu cho chi Ganoderma Kết quả này cũng đóng vai trò là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bản quyền @ Trường Đại học Y Dược, VNU, nhằm định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng của loài nấm dược liệu này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Đã phân lập được hai hợp chất tinh khiết là NCC03 (15 mg) và NCC06

Xác định được hợp chất NCC03, NCC06 lần lượt là :3β-acetoxyl- lanosta-7,9(11),24-triene-26-ol và lanostan-7,9(11),24-triene-3β,26-diol (ganodermadiol).

Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Kết quả của đề tài mới chỉ dừng lại ở phân lập, xác định được 2 hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn DCM của nấm Cổ cò

Do đó, nhóm nghiên cứu kiến nghị tiếp tục thực hiện các nghiên cứu về:

Thành phần hóa học bao gồm định tính, phân lập, định lượng Từ đó xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, cao dược liệu của loài

Tác dụng sinh học của loài, làm cơ sở cho việc sử dụng loài nấm quý này trong lâm sàng

1 Vũ Thị Vân Anh (2014), Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xây dựng dấu vân tay hóa học nấm linh chi (Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.)

P Karst (Ganodermataceae), luận văn thạc sĩ dược học, Học viện

2 Nguyễn Minh Khang (2005), Khảo sát sinh trưởng nấm linh chi đen (amauroderma subresinosum, corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Nông lâm TP

3 Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập I (Tái bản lần thứ 2), NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ

4 Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, tập II, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 205-206

5 Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học

6 Nguyễn Phương Đại Nguyên (2015), “Đa dạng thành phần loài của chi Ganoderma ở Vườn quốc gia Kon Ka Kinh tỉnh Gia Lai, Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 738-742

7 Lê Xuân Thảm (2014), Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật

8 Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học, tập I, NXB Y học

9 Lê Lý Thùy Trâm, Võ Công Tuấn, Phạm Thi Kim Thảo (2016), Nghiên cứu nhân giống và cải thiện qui trình nuôi trồng nấm linh chi (Ganoderma lucidum) nhằm hỗ trợ chương trình phát triển nông thôn mới tại Đà Nẵng,Trung tâm thông tin học liệu và truyền thông, Đại học Đà Nẵng

10 Lê Thùy Trang (2014), Nghiên cứu thành phần hoạt chất polysaccharide, triterpenoid và hoạt tính sinh học của nấm lim Ganoderma sp thiên nhiên thu hái tại tỉnh Quảng Bình, luận văn thạc sĩ ngành Hóa học,

Trung tâm thông tin thư viện, Đại học khoa học Huế

11 Arisawa M, et al (1986), “Three new lanostanoids from Ganoderma lucidum”, Journal of Natural Products, 49(4), 621-625

12 Bao F, et al (2018), “New natural inhibitors of hexokinase 2 (HK2):

Steroids from Ganoderma sinense”, Fitoterapia, 125, 123-129

13 Benzie IFF, Wachtel-Galor S (2011), Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, NXB Taylor & Francis

14 Chiu HF, et al (2017), “Triterpenoids and polysaccharide peptides- enriched Ganoderma lucidum: a randomized, double-blind placebo-controlled crossover study of its antioxidation and hepatoprotective efficacy in healthy volunteers”, Pharmaceutical Biology, 55(1), 1041-1046

15 Cửr D, Knez Ž, & Knez Hrnčič M (2018) “Antitumour, Antimicrobial, Antioxidant and Antiacetylcholinesterase Effect of Ganoderma Lucidum Terpenoids and Polysaccharides: A Review”, Molecules, 23(3), 649

16 Dai, Y.-C (2012), “Polypore diversity in China with an annotated checklist of Chinese polypores”, Mycoscience, 53(1), 49–80

17 El-Mekkawy S M R, et al (1998), "AntiHIV-1 and Anti-HIV-1-Protease substances from Ganoderm lucidum", Phytochemistry, 49(6), 1651-

18 Ferreira, et al (2015), “Chemical features of Ganoderma polysaccharides with antioxidant, antitumor and antimicrobial activities”,

19 Ge F.H, et al (2017), “Ganoderin A, a novel 9,11-secosterol from

Ganoderma lucidum spores oil”, Journal of Asian Natural Products Research, 19(12), 1252-1257

20 González A.G, et al (1999), "Lanostanoids triterpenes from Ganoderma lucidum", Journal of Natural Products, 62(12), 1700-1701

21 Hajjaj H, et al (2005), "Effect of 26-Oxygenosterols from Ganoderma lucidum and their activity as cholesterol synthesis inhibitors", Applied and Environmental Microbiology, 71(7), 3653-3658

22 Heleno SA, et al (2013), “Antimicrobial and demelanizing activity of

Ganoderma lucidum extract, p-hydroxybenzoic and cinnamic acids and their synthetic acetylated glucuronide methyl esters”, Food and Chemical Toxicology, 58, 95-100

23 Huang S, et al (2017), “Polysaccharides from Ganoderma lucidum

Promote Cognitive Function and Neural Progenitor Proliferation in Mouse Model of Alzheimer’s Disease”, Stem Cell Reports, 8(1), 84-94

24 Huie CW, et al (2004), “Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components”, Journal of Chromatography B, 812, 241-257

25 Isaka M, et al (2013), “Lanostane triterpenes from cultures of the Basidiomycete Ganoderma orbiforme BCC 22324”, Phytochemistry,

26 Jiao Y, et al (2016), “Lanostane triterpenoids from Ganoderma curtisii and their NO production inhibitory activities of LPS-induced microglia”,

27 Kao P.F, et al (2012), “Structural Characterization and Antioxidative Activity of Low-Molecular-Weights Beta-1,3-Glucan from the Residue of extracted Ganoderma lucidum fruiting bodies”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, 1-8

28 Kim Y.S, et al (2000), “Antiherpetic activities of acidic protein bound polysacchride isolated from Ganoderma lucidum alone and in combinations with interferons”, Journal of Ethnopharmacology,72,

29 Ko H.H, et al (2008), “Antiinflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma lucidum and G Tsugae”, Phytochemistry, 69(1),

30 Komoda Y, et al (1989), “Ganoderic acid and its derivatives as cholesterol synthesis inhibitors”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 37(2),

31 Liefeng M, et al (2016), “Triterpenoid, preparation method and application”, Patent application in China, CN 106220701A

32 Ma B, et al (2011), “Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum”, North American Journal of Medical Sciences, 495-498

33 Matsuzaki H, et al (2013), “Antidepressant-like effects of a water- soluble extract from the culture medium of Ganoderma lucidum mycelia in rats”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 13(1)

34 Mothana R A, et al (2003), “Antiviral lanostanoid triterpenes from the fungus Ganoderma pfeifferi”, Fitoterapia, 74(1-2), 177-180

35 Nebojša V, et al (2016), “Ganoderma: insights into anticancer effects”,

European Jourmal of Cancer Prevention, 25(5), 462-471

36 Ngai P.H.K, et al (2004), “A mushroom (Ganoderma capense) lectin with spectacular thermostability, potent mitogenic activity on splenocytes, and antiproliferative activity toward tumor cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 314, 988-993

37 Pan K, et al (2013), “Optimization extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides and its immunity and antioxidant activities”,

International Journal of Biological Macromolecules, 55, 301-306

38 Russell M, Paterson (2006), “Ganoderma - A therapeutic fungal biofactory”, Phytochemistry, 67(18), 1985-2001

39 Sato N, et al (2009), “Anti-human Immunodeficiency Virus-1 Protease Activity of New Lanostane-Type Triterpenoids from Ganoderma sinense”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 57(10), 1076–1080

40 Shiao M.S (2003), "Natural products of the medicinal fungus Ganoderma lucidum: Occurrence, biological activities, and pharmacological functions", The Chemical Record, 3(3), 172-180

41 Shimizu A, et al (1985), “Isolation of an inhibitor of platelet aggregation from a fungus, Ganoderma lucidum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33, 3012-3015

42 Siwulski M (2012), “Biological study on carboxymethylated (1→3)-α-D- glucans from fruiting bodies of Ganoderma lucidum”, International Journal of Biological Macromolecules, 51, 1014-1023

43 Smania E.F.A, et al (2003), “Antifungal activity of sterols and triterpenes isolated from Ganoderma annulare”, Fitoterapia, 74(4), 375–377

44 Sun L.X, et al (2010), “Promoting Effects of Ganoderma lucidum

Polysaccharides on B16F10 Cells to Activate Lymphocytes”, Basic &

45 Tang W, et al (2006), “Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells”, Life Sciences, 80(3), 205-211

46 Wang H, & Ng T.B (2006), “Ganodermin, an antifungal protein from fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganoderma lucidum”, Peptides, 27(1), 27-30

47 Xia Q, et al (2014), “A Comprehensive Review of the Structure Elucidation and Biological Activity of Triterpenoids from Ganoderma spp”, Molecules, 19(11), 17478-17535

48 Xu Z, et al (2011), “Ganoderma lucidum Polysaccharides:

Immunomodulation and Potential Anti-Tumor Activities”, The

American Journal of Chinese Medicine, 39, 15-27

49 Zhang H, et al (2017), “Characterization of a bioactive polysaccharide from

Ganoderma atrum: Re-elucidation of the fine structure”, Carbohydrate Polymers, 158, 58-67

50 Zhang X.Q, et al (2011), “Triterpenoids with neurotrophic activity from

Ganoderma lucidum”, Natural Product Research, 25(17), 1607-1613

51 Zheng M, et al (2018), “Steroids from Ganoderma sinense as new natural inhibitors of cancer-associated mutant IDH1”, Bioorganic Chemistry,

52 Zhou L.W, et al (2015), “Global diversity of the Ganoderma lucidum complex (Ganodermataceae, Polyporales) in ferred from morphology and multilocus phylogeny”, Phytochemistry, 114, 7-15.

Tiêu đề	Phân Lập Và Xác Định Cấu Trúc Một Số Hợp Chất Lanostan Triterpen Từ Phân Đoạn Diclomethan Của Nấm Cổ Cò - Ganoderma Flexipes Pat., Họ Ganodermataceae Thu Hái Tại Tây Nguyên
Tác giả	Đặng Thị Quỳnh
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Duyên, TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	2,66 MB