Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot được thực hiện với mục tiêu nhằm sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot. Mời các bạn cùng tham khảo.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ
Vật liệu
11 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ cung cấp
3 chủng vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Streptococcus aureus (ATCC 65338)
2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
- Peptone, cao nấm men, cao thịt, NaOH, NaCl, glucose, (NH 4 ) 2 SO 4 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 , FeSO 4 7H 2 O, MnCl 2 4H 2 O, ZnCl 2 , CuCl 2 , CoCl 2 6H 2 O,
- Thuốc nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachite…
Trong quá trình thí nghiệm, các dụng cụ như cấy vòng, ống nghiệm, đĩa petri, và pipetman với các dung tích 100μl, 1000μl, 5000μl là rất cần thiết Ngoài ra, các thiết bị như becher 100ml, 500ml, erlen 250ml, 1L, đèn cồn, bật lửa, ống đong, chai nắp xanh cũng không thể thiếu Để đảm bảo sự chính xác trong thí nghiệm, cần sử dụng bông thấm nước, bông không thấm, lame và lamel đúng cách.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển, các loại máy móc quan trọng bao gồm tủ ấm, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy, máy đo OD và kính hiển vi quang học Ngoài ra, cân phân tích điện tử và tủ lạnh cũng đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo quản mẫu Máy đo pH và tủ giữ giống là những thiết bị không thể thiếu, cùng với bồn lên men 5l Biostat và máy ly tâm Avanti JXN Series, tất cả đều góp phần nâng cao hiệu quả trong quy trình nghiên cứu và sản xuất.
Môi trường nghiên cứu
- Môi trường 1: (Môi trường LB) (MT1) (g/l)
Dung dịch muối khoáng :10 ml
Cao thịt hoặc cao nấm men 5g/l
- MT8: ( MT định tính khả năng sinh amylase) (g/l)
- MT9( MT định tính khả năng sinh protease) (g/l)
- MT10 (MT định tính khả năng sinh cellulase ) (g/l)
Các chất môi trường được hòa vào nước theo thứ tự, với các thành phần khoáng được hòa tan trong nước cất trước Sau đó, hỗn hợp môi trường được chuẩn bị theo công thức, điều chỉnh pH phù hợp và hấp khử trùng ở 121 độ C trong 15 phút.
Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Bacillus có đặc tính probiotic tốt
Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày Khảo sát khả năng chịu muối mật Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định
Dựng đường cong tăng trưởng Khảo sát các môi trường tạo bào tử
Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất
Sản xuất bào tử quy mô pilot
Phương pháp nhuộm Gram
Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào được xử lý ban đầu bằng tím kết tinh và iot, dẫn đến sự hình thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào.
Khi vi khuẩn Gram âm tiếp xúc với cồn, lipit trong lớp màng ngoài bị hòa tan, làm tăng tính thấm của màng và dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iod, khiến vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm, tạo ra màu đỏ vàng với Safranin hoặc đỏ tía với Fuchsin.
- Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào màu tím
Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame
Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal Violet trong 30 giây
Tẩy cồn 96 0 trong 20 – 30 giây, để ngiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu
Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây
Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton
Bào tử có cấu trúc đặc biệt với lớp vỏ dày, chắc chắn và khó bắt màu do chứa nhiều lipit Để làm cho tế bào chất của bào tử dễ dàng bắt màu, cần thực hiện xử lý bằng nhiệt và axit.
- Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh
Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm lại bằng thuốc nhuộm bổ sung giúp tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu một cách phân biệt.
- Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame
- Đặt 1 cốc nước trên bếp từ và đun sôi Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc
- Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút
- Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây
- Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60 – 90 giây
- Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô
- Quan sát dưới kính viển vi Đọc kết quả
- Tế bào sinh dưỡng màu đỏ [11, 16]
Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL được hình thành từ một TB duy nhất
Để chuẩn bị dung dịch pha loãng, sử dụng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy và chuyển vào ống nghiệm chứa 9ml NaCl 0,85%, tạo ra độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thực hiện các bước pha loãng để đạt được các độ pha loãng 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 và 10^-6.
- Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận
- Cấy và dàn đều dịch pha loãng
Dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10 -4 , 10 -5 ,
10 -6 cho vào mỗi đĩa Petri, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa
Dùng que trang trang mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng
TB Ghi vào nắp hộp Petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy, chủng cấy mẫu
- Lật ngược các đĩa Petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 o C
- Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ
Số lượng tế bào VK trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức:
Trong đó: X: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (trong khoảng
25 – 250 khuẩn lạc) n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng
2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang
Phương pháp này dựa trên tính chất hấp phụ của các dung dịch chứa vật chất lơ lửng, cho phép làm lệch một phần ánh sáng Vi khuẩn và vi sinh vật (VSV) trong môi trường nuôi cấy có khả năng hấp thu ánh sáng, từ đó tạo ra những ảnh hưởng nhất định đến quá trình phát triển và sinh trưởng của chúng.
Độ đục của dịch nuôi cấy, được đo bằng giá trị OD (Optical Density) tại bước sóng 600nm, phản ánh mối quan hệ thuận giữa số lượng vi sinh vật (VSV) và ánh sáng bị hấp thu hoặc phân tán Sự giảm ánh sáng truyền qua tương ứng với sự gia tăng mật độ tế bào (cfu/ml), cho thấy tầm quan trọng của việc đo OD 600nm trong nghiên cứu vi sinh vật.
2.7.1.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB (đường chuẩn)
Pha loãng huyền phù chứa chủng Bacillus cần được phân chia thành các huyền phù khác nhau với độ đục đo ở OD 600nm đạt các giá trị 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; và 0,5 Việc xác định giá trị thực tế OD 600nm của các huyền phù vừa được pha là rất quan trọng, và cần ghi nhận số đo thực tế để đảm bảo độ chính xác trong nghiên cứu.
- Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (cfu/ml) của các huyền phù này
Tính toán giá trị log N (cfu/ml) cho từng mật độ tương ứng với độ đục, sau đó vẽ đường chuẩn biểu diễn log N (cfu/ml) theo OD 600nm Xác định khoảng tuyến tính giữa log N (cfu/ml) và OD 600nm để phân tích mối quan hệ giữa chúng.
- Dùng phần mền Microsoft office Excel 2010 để phân tích sự tuyến tính giữa log
N (cfu /ml) - giá trị OD 600nm và dựng đường chuẩn bằng công cụ Insert Charts
2.7.1.2 Xác định mật độ TB theo độ đục và OD 600nm
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng với các điều kiện thích hợp, cần lấy dịch nuôi cấy để đo OD 600nm Lưu ý rằng dịch nuôi cấy vi khuẩn cần được pha loãng trước khi tiến hành đo OD 600nm.
- Từ giá trị OD 600nm đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (cfu /ml) của mẫu và nhân với độ pha loãng
2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng
Chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được tăng sinh trong 50ml môi trường LB ở 37 o C, 24 giờ
Cấy 1 lượng dịch vi khuẩn Bacillus thử nghiệm đã huyền phù vào erlen chứa
450ml môi trường LB sao cho OD xấp xỉ khoảng 0,1 - 0,5; đem nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 37 o C
Xác định đường cong tăng trưởng: đo OD dịch nuôi cấy lắc sau mỗi 2 giờ nuôi cấy, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn
2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử
Kiểm tra mật độ bào tử được thực hiện bằng cách xử lý nhiệt ở 80 độ C trong 15 phút trong bể điều nhiệt Sau đó, tiến hành pha loãng và cấy trang tại các độ pha loãng phù hợp.
Khảo sát các đặc điểm probiotic
2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày
Dạ dày của gia súc có độ pH thấp từ 1 đến 3, ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của các vi sinh vật (VSV) được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi.
Dựa vào khả năng chịu pH thấp từ 1 đến 3 của dạ dày và khả năng tồn tại sau 1 đến 3 giờ tiêu hóa, việc tuyển chọn các chủng probiotic trở nên khả thi và hiệu quả.
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong
MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37 o C
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có pH=2 được điều chỉnh bằng HCl 1N Thí nghiệm lặp lại 3 lần
- Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị
- Ủ mẫu ở 37 o C Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3
- Ủ mẫu sau khi trang ở 37 o C, 24 giờ Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau
- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)
𝑁 𝑜 × 100 Trong đó: N i : mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)
N o : mật độ TB ở thời điểm 0 phút
- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở pH 2 và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus
2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật
Các chủng VSV probiotic khi qua ruột non sẽ chịu tác động của muối mật trong đường ruột
Dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác động của muối mật trong đường ruột làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic [15, 23]
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong
MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37 o C
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có bổ sung 2% muối mật Thí nghiệm lặp lại 3 lần
- Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị
- Ủ mẫu ở 37 o C Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3
- Ủ mẫu sau khi trang ở 37 o C, 24 giờ Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau
- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)
Trong đó: N i : mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)
N o : mật độ TB ở thời điểm 0 phút
- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở muối mất 2% và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus
2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
2.8.3.1 Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
Nghiên cứu xác định chủng Bacillus có khả năng sản sinh enzyme protease thủy phân gelatin, cho thấy enzyme này tác động lên cơ chất trong môi trường thạch Quá trình phân hủy cơ chất tạo ra vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan, và kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme.
- Nuôi VK trong MT9 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37 o C
Sau 24 giờ, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu thập dịch nổi Tiếp theo, lọc dịch qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn các tế bào còn sót lại.
Đổ 1% gelatin vào đĩa petri để tạo môi trường thạch Sau khi môi trường nguội và đông lại, sử dụng khuyên đục lỗ có đường kính 0,7cm để đục 3 lỗ trên bề mặt thạch, tạo thành các giếng.
Sử dụng pipetMan để hút 20μl dịch và cho vào mỗi lỗ thạch, sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ Tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm lugol để quan sát vòng kháng khuẩn; nếu vi khuẩn sản sinh protease, sẽ xuất hiện vòng trong suốt quanh lỗ thạch Qua đó, đánh giá khả năng tạo thành enzym nhằm tuyển chọn các giống có hoạt tính enzym cao.
Lật đĩa petri và sử dụng thước để đo đường kính vòng phân giải (D) cùng với đường kính giếng (d) Đánh giá khả năng hình thành enzym cho thấy rằng tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều.
2.8.3.2 Xác định hoạt tính amylase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [19]
Nghiên cứu đã xác định chủng Bacillus có khả năng sản sinh enzyme amylase, có tác dụng thủy phân tinh bột thành glucose Khi enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, quá trình phân hủy diễn ra, tạo ra vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme.
- Nuôi VK trong MT8 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37 o C
Sau 24 giờ, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu được dịch nổi Sau đó, lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn các tế bào còn sót lại.
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên hãy đổ môi trường thạch đĩa chứa 1% tinh bột tan vào đĩa petri Sau khi môi trường nguội và đông lại, sử dụng khuyên đục lỗ có đường kính 0,7 cm để đục 3 lỗ trên bề mặt môi trường thạch, tạo thành các giếng.
Sử dụng pipetMan để hút 20μl dịch và cho vào mỗi lỗ thạch, sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ Tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm lugol để quan sát vòng kháng khuẩn; nếu vi khuẩn sinh amylase, sẽ xuất hiện vòng trong suốt quanh lỗ thạch Phương pháp này giúp đánh giá khả năng tạo thành enzym và tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao.
Lật đĩa petri và sử dụng thước để đo đường kính vòng phân giải (D) cùng với đường kính giếng (d) Đánh giá khả năng hình thành enzym cho thấy rằng tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng cao.
2.8.3.3 Xác định hoạt tính cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [11]
Enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, dẫn đến sự phân hủy và hình thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vòng trong suốt này phản ánh mức độ hoạt tính của enzyme.
- Nuôi VK trong MT10 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37 o C
Sau 24 giờ, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu được dịch nổi Tiếp theo, lọc dịch qua màng cellulose hoặc phi lọc nhằm loại bỏ hoàn toàn các tế bào còn sót lại.
Để thực hiện thí nghiệm, trước tiên, đổ môi trường thạch đĩa chứa 1% CMC vào đĩa petri Sau khi môi trường nguội và đông lại, sử dụng khuyên đục lỗ có đường kính 0,7 cm để đục 3 lỗ trên bề mặt thạch, tạo thành các giếng.