Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu
Nghıên cứu được tıến hành từ 9/2018 đến 04/2019
Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý khoa Thú Y, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
- Một số cơ sở chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Hưng Yên
3.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Lợn siêu nạc các lứa tuổi, gồm các giống lợn: Landrace, Yorshire mắc nhóm bệnh phổi tại Văn Giang_ Hưng Yên.
3.4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Tổng hợp và so sánh đặc điểm bệnh lý chủ yếu nhóm bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi
3.4.2.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
Để xác định lợn mắc bệnh phổi, cần dựa vào triệu chứng lâm sàng và các bệnh tích đặc trưng Việc theo dõi thường xuyên, quan sát từng ô chuồng và kiểm tra từng cá thể lợn là rất quan trọng nhằm phát hiện lợn bị bệnh phổi hoặc các bệnh lý khác.
Để nhận biết lợn mắc bệnh phổi, hãy chú ý đến các dấu hiệu như: con vật ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, da xanh, khịt mũi, thở khò khè, khó thở, hắt hơi và ho khan.
Sau khi ghi chép cẩn thận vào nhật ký về số lượng tai, số lượng nái, nhóm tuổi và ô chuồng vào ngày tháng có bệnh, chúng ta có thể dự đoán các nguyên nhân gây bệnh Điều này giúp xác định những vấn đề cần lưu ý khi kết thúc thí nghiệm.
Số lợn con mắc bệnh phổi
Tỷ lệ mắc bệnh phổi = x 100
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010)
Mổ khám lợn mắc bệnh phổi là cần thiết để xác định các biến đổi đại thể của các cơ quan và tổ chức Quy trình bắt đầu bằng việc cố định lợn bệnh và lấy máu từ tĩnh mạch cổ Sau đó, tiến hành lột da để bộc lộ xoang ngực và bụng, tách các cơ quan nội tạng để quan sát và chụp ảnh Các mẫu như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột và hạch được thu thập cho các mục đích nghiên cứu khác nhau, trong đó một số mẫu được bảo quản trong dung dịch formol 10% ít nhất một thời gian nhất định.
1 tuần) để làm tiêu bản vi thể (Cao Xuân Ngọc, 1997)
Phương pháp lấy bệnh phẩm
Sử dụng kéo để cắt lấy các bộ phận có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ở lợn mắc bệnh phổi, như mẫu phổi, gan và ruột, với kích thước khoảng 3cm Sau đó, cho các mẫu này vào lọ chứa dung dịch formol 10%.
3.4.2.3 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Các mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong dung dịch formol 10% để tạo tiêu bản, từ đó xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh.
Tiêu bản vi thể được thực hiện theo phương pháp của Prophet (1992) bao gồm các bước cơ bản sau: lấy mẫu, khử nước và làm trong, tẩm parafin, đúc block, cắt dán mảnh, nhuộm Hematoxilin và Eosin, sau đó gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi.
* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Các mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể Việc làm tiêu bản là cần thiết để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE).
Để kiểm tra bệnh ở lợn, chúng tôi lấy mẫu từ mỗi cơ quan với hai miếng bệnh phẩm và đúc thành hai block Mỗi block sẽ được cắt và nhuộm để tạo tiêu bản, từ đó chọn ra tiêu bản đẹp nhất Sau khi soi dưới kính hiển vi, nếu có hai tiêu bản trong một block đều cho thấy bệnh tích vi thể, thì được coi là dương tính.
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất như lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 độ C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm từ 48 đến 52 độ C, xylem, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trọng 24h
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi rổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được, nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ
Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C
Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C
Mục đích của quá trình khử xylen trong tổ chức là để chỉ còn lại paraffin thấm trong các kẽ mô bào Nếu nhiệt độ vượt quá 56 độ C, tổ chức sẽ trở nên giòn, dễ vỡ và khó cắt Việc đúc block nhằm đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin để tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: máy đúc block, paraffin
Phương pháp thực hiện bao gồm việc đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào giữa khuôn block, sau đó nhanh chóng đổ paraffin lỏng vào khuôn Sau khi đổ, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy để làm đông Đợi cho đến khi block đông cứng hoàn toàn là hoàn tất quá trình.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 – 52 o C, phiến kính, pank kẹp…
Cắt mảnh: bằng mỏy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 àm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức
Để xử lý mảnh cắt, hãy dùng pank kẹp mảnh và đặt vào nước lạnh, nhẹ nhàng dàn đều sao cho mặt dưới của mảnh cắt được ướt hoàn toàn Sau đó, sử dụng phiến kính để hớt mảnh cắt và chuyển sang nước ấm.
48 - 52 o C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để ở tủ ấm 37 o C trong vòng 24h
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành:
Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết paraffin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản, kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loại bỏ hết haematoxylin thừa:
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng 5 –
10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa
Tẩy nước: Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 o mỗi lọ 1 phút
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3 – 5 phút
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume Canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính 10, cần chú ý đến màu sắc và độ trong suốt Nếu tiêu bản hiển thị màu xanh tím và bào tương có màu đỏ tươi, đồng thời tiêu bản trong sáng, không có nước hay bọt khí, thì tiêu bản đạt yêu cầu.
3.4.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm microsoft excel 2010 và phần mềm thống kê EpiTools Epidemiological Calculators (Ausvet, Australia)
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau
- Sai số của số trung bình: m x X : số trung bình Trong đó: xi: số hạng thứ i n: dung lượng mẫu.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Tổng hợp và so sánh đặc điểm bệnh lý chủ yếu nhóm bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi
3.4.2.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
Để xác định lợn mắc bệnh phổi, cần dựa vào triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng Việc theo dõi thường xuyên, quan sát từng ô chuồng và kiểm tra từng cá thể lợn là rất quan trọng nhằm phát hiện sớm các trường hợp mắc bệnh phổi hoặc các bệnh khác.
Để nhận biết lợn mắc bệnh phổi, bạn cần chú ý đến những dấu hiệu như con vật ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, da xanh, khịt mũi, thở khò khè, khó thở, hắt hơi và ho khan.
Sau khi theo dõi và ghi chép vào nhật ký về số lượng tai, số lượng nái, nhóm tuổi và ô chuồng cùng với ngày tháng xảy ra bệnh, chúng ta có thể dự đoán các nguyên nhân gây bệnh Điều này giúp xác định những vấn đề cần lưu ý khi kết thúc thí nghiệm.
Số lợn con mắc bệnh phổi
Tỷ lệ mắc bệnh phổi = x 100
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010)
Mổ khám lợn mắc bệnh phổi nhằm xác định biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức có triệu chứng lâm sàng Quy trình bắt đầu bằng việc cố định lợn bệnh và lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Sau đó, tiến hành lột da để bộc lộ xoang ngực và bụng, tách các cơ quan nội tạng để quan sát và chụp ảnh Mẫu các cơ quan như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột, hạch được thu thập cho các mục đích nghiên cứu khác nhau, một số mẫu được bảo quản trong formol 10% ít nhất.
1 tuần) để làm tiêu bản vi thể (Cao Xuân Ngọc, 1997)
Phương pháp lấy bệnh phẩm
Sử dụng kéo để cắt một số bộ phận có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ở cơ quan lợn mắc bệnh phổi, như mẫu phổi, gan, ruột, với kích thước khoảng 3cm, sau đó cho vào lọ chứa formol 10%.
3.4.2.3 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong dung dịch formol 10% để tạo tiêu bản, giúp xác định các bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh.
Tiêu bản vi thể được thực hiện theo phương pháp của Prophet, E.B (1992) bao gồm các bước sau: lấy mẫu, khử nước và làm trong, tẩm parafin, đúc block, cắt dán mảnh, nhuộm Hematoxilin và Eosin, sau đó gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi.
* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể Việc làm tiêu bản là cần thiết để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE).
Để chẩn đoán bệnh ở lợn, chúng tôi lấy mẫu từ mỗi cơ quan, mỗi mẫu gồm hai miếng bệnh phẩm được đúc thành hai block Sau đó, chúng tôi cắt và nhuộm tiêu bản từ mỗi block, chọn ra những tiêu bản đẹp nhất để soi dưới kính hiển vi Kết quả bệnh tích vi thể được đọc và nếu cả hai tiêu bản trong một block đều có bệnh tích, block đó sẽ được coi là dương tính.
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất như: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 o C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52 o C, xylem, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trọng 24h
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi rổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được, nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ
Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C
Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C
Mục đích của quá trình khử xylen trong tổ chức là để chỉ còn lại paraffin thấm trong các kẽ mô bào, giúp bảo quản mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên, nếu nhiệt độ vượt quá 56 độ C, tổ chức sẽ trở nên giòn, dễ vỡ và khó cắt Do đó, việc đúc block nhằm đưa mẫu bệnh phẩm vào khối paraffin để tạo thành một thể thống nhất là rất quan trọng.
Chuẩn bị: máy đúc block, paraffin
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang ở giữa khuôn block, sau đó nhanh chóng đổ paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block và để nguội cho đến khi block đông cứng hoàn toàn.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 – 52 o C, phiến kính, pank kẹp…
Cắt mảnh: bằng mỏy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 àm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức
Để xử lý mảnh cắt, hãy sử dụng pank kẹp và đặt mảnh cắt vào nước lạnh, dàn đều để mặt dưới của mảnh cắt ướt hoàn toàn Sau đó, dùng phiến kính để hớt mảnh cắt và chuyển sang nước ấm.
48 - 52 o C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để ở tủ ấm 37 o C trong vòng 24h
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành:
Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết paraffin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản, kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loại bỏ hết haematoxylin thừa:
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng 5 –
10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa
Tẩy nước: Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 o mỗi lọ 1 phút
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3 – 5 phút
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume Canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản
Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với vật kính 10 Nếu quan sát thấy màu xanh tím và bào tương có màu đỏ tươi, tiêu bản sẽ trong sáng Đảm bảo không có nước và bọt khí xuất hiện.
3.4.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm microsoft excel 2010 và phần mềm thống kê EpiTools Epidemiological Calculators (Ausvet, Australia)
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau
- Sai số của số trung bình: m x X : số trung bình Trong đó: xi: số hạng thứ i n: dung lượng mẫu.