Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y (Key laboratory for Veterinary Biotechnology)- Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Thời gian: Từ tháng 12/2018 đến tháng 6/2019.
Nội dung nghiên cứu
Xác định sự có mặt của Parvovirus bằng phương pháp PCR
Giải trình tự gen các chủng Parvovirus và xây dựng cây phả hệ
Phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK
Xác định hiệu giá (TCID 50 ) bằng phương pháp Spearman-Karber.
Nghiên vật liệu
Kit PCR – (iNtRON- 2x PCR Master mix solution- i-Taq)
Đệm chạy điện di 1X TBE
Hóa chất nhuộm gel (iNtRON- Redsafe)
Hóa chất dùng cho nuôi cấy phân lập virus:
Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) – Gibco
FBS (Fetal Bovine Serum) – Sigma
3.4.2 Trang thiết bị máy móc
Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Biohazard safety Cabinet)
Pipette chớnh xỏc 10àl, 20àl, 200à, 1000àl
Đầu cụn tương ứng 10àl, 200àl, 1000àl
Eppendorf tube 1,5ml, 200à, ống ly tõm 15ml
Khay đựng ống Eppendorf, găng tay, bông cồn, cân…
Nồi hấp nhiệt tiệt trùng
Máy chạy PCR: Sytem 9700 (GeneAmp)
Máy điện di Wide Mini-Sub Cell BT (BIO-RAD)
Máy đọc và chụp ảnh gel
Máy ly tâm bản Eppendorf (Refrigerated Microcentrifuge)
Máy ly tâm lạnh Centrifuge
Máy vontex LaborA (Bioblock Scientific)
Các loại máy móc, vật liệu thông thường phòng thí nghiệm
Găng tay, khẩu trang, bông cồn…
Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính bằng kít test nhanh chúng tôi thực hiện lấy mẫu như sau:
Dùng pipette nhựa thu mẫu phân trực tiếp trên khay của chuồng nuôi, cho vào ống falcon 15ml, sau đó đem bảo quản trong tử -20ᵒC
3.5.2 Phương pháp tách DNA tổng số
Mẫu phân sau khi thu được đã được xử lý và bảo quản trong tủ -20ᵒC đến khi tiến hành thí nghiệm
Parvovirus có vật liệu di truyền là DNA, vì vậy để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử của virus, việc tách chiết DNA tổng số là cần thiết Để thực hiện điều này, Kit Genomic DNA Mini Kit Blood/Cultured Cell được sử dụng để tách chiết DNA hiệu quả.
Bổ sung 900 µl dung dịch RBC Lysis Buffer vào 300 µl mẫu bệnh phẩm và lắc đều Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 3000g trong 5 phút Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch nổi và thêm 100 µl dung dịch RBC Lysis Buffer, sau đó pipet hút lên xuống để đảm bảo đồng đều.
Bổ sung 200 µl dung dịch GB Buffer, lắc mạnh và ủ ở nhiệt độ 60 ºC trong 10 phút, đảo đều sau mỗi 3 phút Sau đó, để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, đồng thời ủ 200 µl dung dịch Elution Buffer ở nhiệt độ 60 ºC trong cùng khoảng thời gian.
Bổ sung 200 ml dung dịch Absolute Etbanol, lắc mạnh và spindown Hút hết dung dịch sang cột lọc, sau đó ly tâm ở 14-16000g trong 5 phút Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống mới, loại bỏ ống cũ cùng dung dịch trong ống đó.
Bổ sung 400 àl dung dịch W1 Buffer vào ống cú cột lọc, ly tõm 14- 16000g trong 1 phút, đổ dịch ra,
Bổ sung tiếp 600 àl dung dịch Wash Buffer, ly tõm 14-16000g trong 1 phút, đổ dịch ra, ly tâm khô 14-16000g trong 3 phút và chuyển cột lọc sang ống mới
Để thu được DNA, bổ sung 100 µl dung dịch Elution Buffer đã ủ từ bước thứ 2, sau đó ủ trong 3 phút Tiến hành ly tâm ở tốc độ 14.000-16.000g trong 1 phút, rồi bỏ cột lọc và đóng ống.
Sau khi đã có DNA, tiến hành phản ứng PCR
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Số lƣợng (àl)
Thông tin cặp mồi được sử dụng:
Mix các thành phần lại với nhau, trộn đều sau đó đem đi chạy PCR với chu trình nhiệt độ như sau:
Bảng 3.3 Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự mồi 5’-3’ Kích thước
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR
Các bước phản ứng Nhiệt độ Thời gian (phút) Chu kỳ
3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Để chuẩn bị thạch 1.2% Agarose, cần cân 1.2g agarose hòa tan trong 100ml dung dịch 1X TBE Sau đó, đun nóng hỗn hợp trong khoảng 2 phút cho đến khi agarose hoàn toàn tan và chuyển sang trạng thái trong suốt Cuối cùng, để hỗn hợp nguội xuống khoảng 45-50°C.
Thờm 10àl thuốc nhuộm Redsafe, lắc đều; đổ gel vào khuụn đó cắm lược, giữ tĩnh ở nhiệt độ phòng khoảng 25-30 phút tới khi gel đông, tháo lược ra
Đổ dung dịch đệm chạy điện di 1X TBE vào khoang điện di sao cho ngập bản gel
Lấy 5 µl sản phẩm PCR và cho vào các giếng, sau đó thêm 5 µl marker vào giữa giếng theo thứ tự: đối chứng âm và đối chứng dương Chạy điện di ở 100V trong 25 phút, sau đó đọc kết quả điện di và chụp lại bằng máy chụp gel để in ảnh.
3.5.5 Phương pháp giải trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự DNA là quá trình xác định và thu thập thành phần nucleotide của một đoạn DNA Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã gửi sản phẩm PCR tinh sạch đến một công ty tại Malaysia để thực hiện giải trình tự gen, sử dụng phương pháp Sanger để đảm bảo độ chính xác cao.
Phương pháp xác định trình tự gen dideoxy, do Frederick Sanger, Smith và Coulson phát hiện vào năm 1977, dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật Sanger đã hoàn thành việc giải trình tự bộ gen của thực khuẩn thể X174 ký sinh trên E.coli, đánh dấu bộ gen đầu tiên được xác định trình tự Phương pháp này sử dụng 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) như các nhân tố kết thúc quá trình kéo dài DNA, cho phép kết hợp vào chuỗi DNA nhưng không tiếp tục kết hợp với deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo Khi trộn lẫn ddNTP với 4 loại dNTP và tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzyme polymerase, sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau, được kết thúc bởi gốc dideoxy nucleotid Qua điện di các đoạn DNA, ta có thể xác định được trình tự của đoạn gen nghiên cứu.
Bước 1: Biến tính DNA khuôn, điện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) thu các mạch đơn DNA
Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA
Lấy 4 ống eppendorf cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống ( DNA khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ, enzyme DNA polymeraze và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch đệm thích hợp) Bổ sung vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (1%) một loại ddNTP nhất định (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt
Bước 4: Điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn
Phương pháp giải trình tự gen do F Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác cao, đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các máy giải trình tự gen tự động.
3.5.6 Phương pháp mở giống tế bào CRFK
Làm ấm môi trường trong bể ổn nhiệt ở 37°C
Lấy ống cất tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng (-196°C), giải đông nhanh trong bể ổn nhiệt 37°C trong 2 phút
Chuẩn bị 5ml môi trường DMEM trong ống falcon 15ml, sau đó hút toàn bộ dịch tế bào từ ống cất tế bào và cho vào ống falcon đã chuẩn bị, cuối cùng đảo đều hỗn dịch.
Ly tâm dịch tế bào ở 1000 vòng/phút trong 5 phút
Để tách tế bào hiệu quả, trước tiên cần loại bỏ dịch và thu cặn tế bào Sau đó, thêm 5ml môi trường nuôi cấy DMEM chứa 5% FBS vào ống và sử dụng pipet điện để hút lên xuống nhiều lần, giúp các tế bào tách rời nhau Cuối cùng, chuyển huyễn dịch tế bào vào chai nuôi cấy tế bào T25, nếu sử dụng chai T75 thì cần 15-20ml môi trường nuôi cấy.
Tế bào nuôi trong tủ ấm 37°C, với 5% CO 2 ; hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào
3.5.7 Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK
Quan sát tế bào bằng kính hiển vi soi ngược hàng ngày, đến khi tế bào phủ đáy khoảng 90% có thể tiến hành cấy chuyển tế bào như sau:
Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa bề mặt tế bào bằng 1X PBS (2 lần)
Thờm 500àl Trypsin với chai T25 ( với chai T75 cần 1-2ml Trypsin), láng đều bề mặt tế bào để tế bào co lại
Đặt chai nuôi cấy vào tủ 37ᵒC ủ 3 phút cho tế bào co lại
Loại bỏ Trypsin, soi thấy tế bào co lại, tiến hành vỗ mạnh chai cho tế bào bong hết ra khỏi bề mặt chai
Thêm môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS đã làm ấm vào chai nuôi, trộn đều tế bào; huyển tế bào vào các chai nuôi cấy khác nhau
3.5.8 Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK
Mẫu bệnh phẩm dương tính với Parvovirus sau khi kiểm tra bằng phương pháp PCR được chọn để gây nhiễm tế bào Trước khi tiến hành gây nhiễm, mẫu được lọc qua màng lọc vi khuẩn có kích thước 0,45 µm.
Quy trình phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK như sau:
Chuẩn bị 2 chai tế bào T25 đã phủ 70% bề mặt, 1 chai để gây nhiễm,
1 chai để làm đối chứng tế bào
Với cả 2 chai: Hút bỏ môi trường, rửa bề mặt tế bào bằng 1X PBS
Dùng pipet hút 500µl môi trường DMEM cho vào chai đối chứng và 500µl virus vào chai cần gây nhiễm (đối với chai T25) Láng nhẹ dịch khắp bề mặt chai và ủ lắc nhẹ trong khoảng 1 giờ ở 37°C với 5% CO2.
Sau 1h, loại bỏ virus trong chai
Thêm môi trường duy trì DMEM 2% FBS vào các chai; nuôi trong tủ ấm 37°C, 2% CO2
Quan sát hàng ngày để theo dõi sự nhân lên của virus trên tế bào
Có hai tường hợp xảy ra:
