quan tài liệu
Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa
Cấu trúc rễ lúa bao gồm rễ phôi và các loại rễ hậu phôi, tạo thành hệ thống rễ với năm loại chính: rễ phôi, rễ phụ phôi, rễ phụ hậu phôi, rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ phôi xuất hiện đầu tiên sau 2-3 ngày từ khi hạt nảy mầm, tiếp theo là năm rễ phụ phôi từ nốt bao lá mầm trong giai đoạn xuất hiện lá thứ nhất và thứ hai Rễ phụ hậu phôi hình thành từ các nốt thân và được sắp xếp trong cùng một hoặc hai hàng.
Hình 2.1 Cấu trúc và hình thái rễ lúa
(ra: rễ phôi, cr: rễ phụ, ecr: rễ phụ phôi, slr: rễ bên nhỏ, llr: rễ bên lớn)
Rễ bên có thể phát triển từ nhiều loại rễ sơ cấp, bao gồm rễ phụ phôi và rễ phụ, và được phân chia thành hai loại: rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ bên nhỏ, với số lượng lớn, đóng vai trò quan trọng hơn trong sự sinh trưởng của cây so với rễ bên lớn Trong khi rễ bên nhỏ phát triển kéo dài sang hai bên, rễ bên lớn lại hướng xuống dưới.
Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân
Cấu trúc giải phẫu đối xứng của bộ rễ lúa cho thấy khả năng thích nghi của chúng với môi trường ngập nước Các loại mô chuyên hóa trong rễ lúa giúp cây phát triển bình thường trong điều kiện này.
Rễ cây được cấu tạo từ nhiều lớp, bao gồm biểu bì, ngoại bì, cương mô, gỗ giữa hoặc trung bì, và nội bì, cùng với phần bó mạch trung tâm Các lớp biểu bì, ngoại bì, cương mô và nội bì đều được hình thành từ một lớp tế bào đơn và đồng nhất ở tất cả các loại rễ Lớp ngoại bì nằm bên trong lớp biểu bì và đảm nhận chức năng bảo vệ cho các rễ già khi lớp biểu bì bị mất, đồng thời lớp ngoại bì cũng có nhiệm vụ hấp thụ nước và chất dinh dưỡng.
Lớp cương mô lignin hóa giúp bảo vệ lớp ngoại bì và hạn chế sự khuếch tán oxy, góp phần vào khả năng chống chịu của cây trước tình trạng thiếu khí Trung bì gồm 4-5 lớp tế bào sắp xếp đối xứng, từ đó hình thành mô khí Mô khí có tế bào tự phân giải theo cơ chế lập trình hoặc di chuyển ra ngoài, tạo khoảng trống giữa các tế bào và phát triển thành gian bào, phục vụ cho quá trình trao đổi khí Mô khí cung cấp oxy cho hô hấp của cây, đặc biệt phát triển mạnh ở các loài thực vật sống trong môi trường ngập nước Tất cả các loại rễ lúa đều có mô khí, ngoại trừ rễ bên nhỏ do thiếu lớp tế bào trung bì.
Nội bì là mô cuối cùng trong hệ thống mô cơ bản, chứa vành đai casparian được cấu tạo từ suberin bao quanh tế bào Đai casparian phát triển mạnh trong môi trường đất, nhưng kém phát triển trong thủy canh Các tế bào nội bì đóng vai trò quan trọng như rào cản đối với nước và chất dinh dưỡng, điều chỉnh việc vận chuyển qua con đường apoplastic và chọn lọc chất qua con đường cell symplast giữa trung bì và bó mạch trung tâm.
Hình 2.3 Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa
Phần bó mạch trung tâm ở lớp một lá mầm bao gồm các bó mạch xylem và phloem xen kẽ Mạch xylem tạo ra vùng áp suất cao và phát triển thành protoxylem qua vùng trung trụ Sự phân hóa xylem và phloem diễn ra từ ngoài vào trong Ở rễ phôi, có một hoặc hai mạch xylem trung tâm nằm giữa phần trung trụ, bao quanh bởi 6-8 mạch xylem nhỏ hơn Bên cạnh đó, 6-7 ống phloem được xen kẽ với các mạch xylem, trong khi mạch phloem được cấu thành từ các tế bào tương tự từ mỗi ống protophloem, tạo nên cấu trúc đối xứng Khoảng không gian giữa xylem và phloem được lấp đầy bởi các sợi cương mô (Rebouillat et al., 2008).
2.1.2 Chức năng bộ rễ lúa
Bộ rễ lúa không chỉ có chức năng vận chuyển nước và muối khoáng hòa tan cho cây, mà còn phát triển sâu vào lòng đất, tạo thành mỏ neo vững chắc giúp cây đứng vững Hệ thống rễ còn đóng vai trò quan trọng trong việc dự trữ và tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng như hormone auxin, ABA và ethylen, giúp truyền tín hiệu giữa chồi và rễ, từ đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây một cách hợp lý (Wu and Cheng, 2014; Gregory and Kirkegaard, 2017).
Xylem là cơ quan chuyên trách trong việc vận chuyển nước và chất dinh dưỡng cho cây, bao gồm bốn loại tế bào chính: tế bào ống, khung xương, sợi và nhu mô Tế bào ống và khung xương đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển nước và dinh dưỡng, trong khi xylem sợi và mô mềm hỗ trợ cấu trúc Các thành phần như xylem ống, xương và sợi là không sống, trong khi nhu mô là thành phần sống Xylem thứ cấp (gỗ) không chỉ vận chuyển chất dinh dưỡng mà còn thực hiện chức năng vận chuyển ở khoảng cách xa, đặc biệt là tới lá cây (Ulrich et al., 2016).
Nước và các chất dinh dưỡng được vận chuyển vào rễ qua hai con đường chính: hệ thống apoplastic và symplastic Trong hệ thống apoplastic, nước và chất dinh dưỡng di chuyển qua các thành vách tế bào thông qua hệ thống mao quản Tuy nhiên, khi đến vòng đai Casparin, chúng bị chặn lại và phải xuyên qua tế bào nội bì qua hệ thống chất nguyên sinh, trước khi vào mạch dẫn Động lực vận chuyển trong hệ thống apoplast chủ yếu đến từ lực hút của mao quản và lực trương của keo trong thành tế bào Trong khi đó, việc vận chuyển qua hệ thống symplast diễn ra nhờ lực hút trương của hệ thống keo nguyên sinh chất.
Hình 2.4 Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ
Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học 7 1 Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa 7 2 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn
2.2.1 Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa
Hạn được định nghĩa là sự thiếu hụt nước và khả năng trữ ẩm của đất, xảy ra khi nước trong đất bị bốc hơi liên tục trong điều kiện thời tiết khô nóng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng Stress hạn tác động lên cây lúa bằng cách dẫn tới quá trình đóng khí khổng và hạn chế trao đổi khí, được đánh giá qua sự giảm hàm lượng nước, thế năng nước của lá, áp suất trương, và hoạt động của khí khổng Ở mức độ nghiêm trọng, stress hạn có thể ngăn chặn quá trình quang hợp, gây rối loạn trao đổi chất và làm giảm khả năng sống sót của cây Stress hạn ảnh hưởng đến sự phát triển của cây thông qua các quá trình sinh lý và sinh hóa như quang hợp, hô hấp, vận chuyển và hấp thu ion, carbonhydrate, cũng như quá trình đồng hóa dinh dưỡng và các promoter sinh trưởng (Singh et al., 2012).
Hình 2.5 Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn
Stress mặn ảnh hưởng đến khoảng 380 triệu ha đất trồng, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác toàn cầu Đất mặn thường đi kèm với đất kiềm và ngập nước, với NaCl là muối chủ yếu gây ra mặn đất Đất được xác định là mặn khi có độ dẫn điện EC > 4.0 dS/m Lúa, một loại cây trồng nhạy cảm với đất mặn, chịu những tác động nghiêm trọng từ tình trạng này, như rối loạn quá trình đồng hóa ion, hỏng chức năng màng tế bào và ức chế trao đổi chất, dẫn đến giảm năng suất Mặn tác động đến cây qua hai loại stress: stress áp suất thẩm thấu ở giai đoạn đầu do nồng độ muối cao và stress ion ở giai đoạn sau gây ngộ độc Nồng độ ion Na+ cao làm giảm quá trình ra hoa, ảnh hưởng đến tính hữu dục của hoa và làm suy yếu sự phát triển của bông lúa, đồng thời ức chế hoạt động quang hợp.
Các stress phi sinh học khác
Ngập úng là một dạng stress phi sinh học phổ biến, gây giảm nhanh chóng tỷ lệ oxy hòa tan, dẫn đến khủng hoảng năng lượng trong tế bào và ức chế quá trình quang hợp (Bailey-Serres và Vosenek, 2008) Mặc dù cây lúa có khả năng chịu ngập, chỉ một số giống có thể vươn dài lóng để thích nghi (Niroula et al., 2012), trong khi hầu hết sẽ chết sau 14 ngày ngập hoàn toàn (Menguer et al., 2017) Các khu vực trồng lúa nhờ nước trời thường xuyên bị ngập úng, dẫn đến giảm năng suất đáng kể do ức chế quá trình trao đổi chất hiếu khí và quang hợp, làm giảm hàm lượng carbonhydrate và gây chết cây (Fukao và Bailey-Serres, 2004).
Stress lạnh là yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và năng suất cây trồng, đặc biệt ở vùng ôn đới và vĩ độ cao, khiến lúa gạo, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, gặp khó khăn (Cruz et al., 2013; Zhang et al., 2014) Nhiệt độ thấp ức chế quá trình nảy mầm, giảm tỷ lệ nảy mầm tới 25% và tạo điều kiện cho cỏ dại phát triển (Fujino et al., 2004) Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, stress lạnh gây vàng lá, ngừng sinh trưởng và giảm đẻ nhánh (Cruz et al., 2013) Ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực, nó ảnh hưởng đến chất lượng hạt và quá trình vào chắc, dẫn đến giảm năng suất (Jena et al., 2012; Cruz et al., 2014; Zhang et al., 2014).
Bộ rễ lúa đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất dưới điều kiện hạn hán, với cấu trúc và sự phát triển của nó quyết định chức năng của cây Trong khi các bộ phận trên mặt đất như lá và thân bị ức chế sinh trưởng do khô hạn, bộ rễ vẫn duy trì sự phát triển Khả năng điều chỉnh của bộ rễ, như thiết lập lại thế năng nước qua thay đổi áp suất thẩm thấu và nới lỏng thành vách tế bào, cho phép bộ rễ phục hồi sinh trưởng trong điều kiện khô hạn (Pandey và Shukla, 2015).
Sự phát triển của hệ thống rễ được chi phối bởi các yếu tố nội tại, xác định cấu trúc tổng thể của bộ rễ Tiềm năng di truyền của các tính trạng bộ rễ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phản ứng với các stress môi trường như khô hạn, ngập úng và thiếu dinh dưỡng, từ đó tạo ra tính linh hoạt trong sự phát triển của bộ rễ (Courtois et al., 2009).
Các tính trạng rễ quan trọng cho việc duy trì năng suất cây trồng trong điều kiện khô hạn bao gồm đường kính rễ nhỏ, chiều dài rễ, và mật độ rễ dài sâu trong lòng đất Khả năng sinh trưởng của các rễ ăn sâu và đường kính xylem của chúng có vai trò then chốt trong việc hấp thu nước Tại cấp độ toàn cơ thể, khả năng chống chịu hạn liên quan tới tổng sinh khối và kích thước bộ rễ so với các bộ phận khác như lá và chồi Ở cấp độ cơ quan, các yếu tố như đường kính rễ, chiều dài rễ chính, diện tích bề mặt rễ, và mật độ mô rễ đều ảnh hưởng đến khả năng chống chịu hạn Tại cấp độ mô và tế bào, đường kính xylem, hoạt động của aquaporin, và sự khôi phục bóng khí thông qua áp suất rễ cũng rất quan trọng Cuối cùng, ở cấp độ hệ thống cơ quan, sự phân bố sâu của hệ thống rễ và khả năng phục hồi sinh trưởng sau khi có nước trở lại là các yếu tố quyết định Tóm lại, các tính trạng và gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn bao gồm chiều dài rễ, sinh khối rễ, số lượng rễ, tốc độ kéo dài rễ, sự phân nhánh rễ, góc rễ, đường kính xylem và hoạt động của aquaporin.
2.2.3 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn
Khả năng chống chịu với mặn của cây không chỉ phụ thuộc vào một tính trạng đơn lẻ mà cần hiểu rõ cơ chế phản ứng của cây dưới điều kiện stress mặn Các nghiên cứu thường tập trung vào phản ứng sinh lý của cây khi gặp stress mặn, với tác động đầu tiên thể hiện qua áp suất thẩm thấu và sau đó là nồng độ ion cao gây ngộ độc ion Lục lạp và ty thể là hai cơ quan dễ bị tổn thương nhất bởi mặn, do đó, việc nghiên cứu hàm lượng diệp lục, sự thay đổi bước sóng diệp lục và tính thấm của màng là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả quang hợp của cây (Ghosh et al., 2016).
Các nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ muối cao làm giảm diện tích lá và gây biến đổi cấu trúc lá ở cây lúa trồng in vitro cũng như trong nhà lưới Mặn có thể gây tổn thương tế bào thịt lá và làm giãn mô lá, ảnh hưởng đến các bó mạch Tuy nhiên, cây lúa có thể giảm thiểu tác động độc hại từ việc tích tụ ion Na+ thông qua một số cơ chế như đào thải muối và hấp thụ chọn lọc các ion.
(3) điều hòa hoạt động tỷ lệ K + /Na + (Mickelbart et al., 2015).
Nghiên cứu trên cây mô hình đã chỉ ra rằng HKT1 (Kênh vận chuyển K + ái lực cao), SOS1 (SALT OVERLY SENSITIVE 1) và NHX (Na + /H + EXCHANGER) là những yếu tố quan trọng trong việc duy trì cân bằng ion Na + Cụ thể, gen HKT1 và SOS1 điều chỉnh dòng chảy ion qua màng sinh chất, trong khi gen NHX kiểm soát sự di chuyển ion vào trong không bào.
Hình 2.6 Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa
Gần đây, nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen HKT1 và các alen của nó đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống chịu mặn của cây ngũ cốc Cụ thể, HKT1;5 là kênh vận chuyển Na+ trên màng sinh chất, giúp phân phối Na+ từ mạch xylem rễ đến các tế bào nhu mô và trung bì Việc giảm lượng Na+ trong mạch xylem hạn chế sự vận chuyển đến chồi Sự khác biệt về tính chống chịu mặn ở cây lúa non liên quan đến alen OsHKT1;5, trong đó sự thay thế 4 amino acid tại vùng loop của OsHKT1;5 tạo ra giống kháng mặn với khả năng tích lũy ion Na+ thấp hơn so với giống mẫn cảm Koshihikari (Hình 2.6) (Zhong-Hai et al., 2005).
Gen OsHKT1;5 có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng K + /Na + nhờ vào các biến đổi amino acid đặc thù, giúp tăng cường vận chuyển K + vào xylem rễ hơn Na + Gen này nằm trong QTL Saltol, được xác định từ giống lúa cạn Pokkali, là công cụ thiết yếu để đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con trên đồng ruộng và được ứng dụng trong các chương trình chọn tạo giống Tuy nhiên, việc nghiên cứu các alen của gen OsHKT1;5 và nồng độ Na +, K + trong mô cho thấy chức năng di truyền của gen này trong việc giảm thiểu tác hại của ion Na + ở cây con của Oryza sativa và Oryza glaberrima vẫn chưa được xác định rõ ràng (Mickelbart et al., 2015).
Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa 12 Phần 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Auxin nội sinh là hormone quan trọng cho sự phát triển bộ rễ lúa và cây trồng nói chung Việc xử lý auxin ngoại sinh kích thích sự phát sinh rễ phụ và rễ bên Nhiều gen liên quan đến đường truyền tín hiệu auxin đóng vai trò trong quá trình hình thành và phát triển bộ rễ Sự tích lũy và vận chuyển auxin trong cây được thực hiện bởi protein PIN, với PIN1 được kích hoạt bởi gen CRL4 (OsGNOM1) Gen CRL4 giúp điều hòa và duy trì gradient auxin tại phần gốc thân cây, cần thiết cho sự hình thành rễ phụ ở lúa Gen OsGNOM1 tương đồng với GNOM1 ở Arabidopsis, liên quan đến việc điều hòa protein PIN1 trong vận chuyển auxin phân cực, là tín hiệu cho sự phân chia bất đối xứng của tế bào nhu mô trong sự phát triển mô phân sinh rễ phụ.
Hình 2.7 Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa
Trên cây lúa, hoạt động truyền tín hiệu auxin tới các gen cảm ứng auxin được điều chỉnh bởi sự tương tác giữa hai họ protein AUX/IAA và ARF Khi nồng độ auxin nội sinh thấp, protein AUX/IAA liên kết với gen ARF, ức chế biểu hiện của chúng Ngược lại, khi nồng độ auxin tăng cao, tín hiệu auxin làm phân hủy protein AUX/IAA, từ đó kích hoạt gen sinh tổng hợp protein ARF.
Các protein ARF đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt quá trình phiên mã trong tín hiệu auxin, gắn kết với vùng cảm ứng auxin trên promoter của các gen liên quan, từ đó thúc đẩy biểu hiện của các gen này trong mạng lưới điều hòa sự hình thành rễ phụ và rễ bên ở cây lúa Ngoài ra, đã có 31 gen tương đồng mã hóa họ protein AUX/IAA được phát hiện ở cây lúa.
Nghiên cứu chỉ ra rằng ARF1 liên kết với vùng cảm ứng auxin AuxRE2 trên trình tự promoter của gen crl1 (Crown rootless 1), qua đó điều hòa biểu hiện của gen này (Inukai et al., 2005) Gene crl1, mã hóa yếu tố phiên mã LBD/LOB, khi bị đột biến điểm ở giống lúa Taichung65, đã tạo ra thể đột biến crl1 không có sự hình thành rễ phụ Kết quả cho thấy gene crl1 phản ứng sớm với auxin và biểu hiện tại vị trí gốc thân cây lúa, nơi cũng có sự đáp ứng tín hiệu của auxin (Inukai et al., 2005).
Nhóm nghiên cứu của Liu H et al (2005) đã tạo ra thể đột biến soma arl1 với đoạn gen ARL1 bị mất 20 bp, dẫn đến việc không phát sinh rễ phụ Gen ARL1, mã hóa cho protein thuộc họ LOB, được biểu hiện ở mô phân sinh rễ phụ, rễ bên, mô phân sinh chồi và mô mạch dẫn ARL1 phản ứng với auxin, và cơ chế biểu hiện của nó ở rễ tương đồng với sự phân bố auxin Mặc dù hai gen crl1 và ARL1 được công bố tại hai thời điểm khác nhau, nhưng chúng thực chất là cùng một gene.
Nghiên cứu của Coudert J et al (2011) chỉ ra rằng gen crl1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa mạng lưới gen liên quan đến sự hình thành rễ phụ Bằng phương pháp Affymetrix microarray, nhóm nghiên cứu đã so sánh sự biểu hiện gen ở vùng gốc thân cây lúa đột biến crl1 và cây wildtype Taichung65, phát hiện 250 gen, trong đó 236 gen được điều hòa xuôi và ngược ở cây đột biến Để xác định các gen cảm ứng sớm với auxin, họ đã đánh giá mức độ biểu hiện của một bộ gen tại các thời điểm khác nhau sau khi xử lý với auxin ngoại sinh Kết quả cho thấy hầu hết các gen liên quan đến hormone, nước và dinh dưỡng không được điều hòa trực tiếp bởi gen crl1 khi không có sự hình thành rễ phụ Đặc biệt, ba gen phản ứng với auxin phụ thuộc vào crl1 là FSM/FAS1, GTE4 và MAP protein liên kết với vi ống, trong đó FSM/FAS1 và GTE4 đã được xác nhận liên quan đến sự duy trì mô phân sinh rễ ở lúa và Arabidopsis thông qua tái sắp xếp chất nhiễm sắc và điều hòa chu kỳ tế bào.
Hình 2.8 Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1
Trong nghiên cứu của Coudert et al (2015), hệ thống cảm ứng đã được sử dụng để khôi phục biểu hiện gen crl1 trong cây đột biến bằng cách chuyển gen này dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng với DEX Các nhà nghiên cứu đã tách chiết mRNA trước khi xử lý và sau 4h, 8h xử lý với DEX để phân tích transcriptome Kết quả cho thấy crl1 đã điều hòa tăng cường biểu hiện của 277 gen, bao gồm các gen chủ chốt liên quan đến sự phân chia mô phân sinh, phản phân hóa tế bào và cân bằng hormone Từ 277 gen này, nhóm LMI RICE-2 đã chọn 13 gen có mức độ biểu hiện mạnh để nghiên cứu chức năng trong sự hình thành rễ phụ, ký hiệu từ CR1 đến CR13, trong đó gen CR7 mã hóa cho yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF.
PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là các dòng lúa chuyển gen được cung cấp bởi phòng thí nghiệm liên kết Việt-Pháp (LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp, gồm:
Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào giống Taichung65 (TC65) và thể đột biến (crl1) ở các thế hệ T0, T1, T2 được nghiên cứu với cấu trúc gen chuyển bao gồm phần cds (coding sequence) của gen CR7, được điều khiển bởi promoter Ubiquitin, ký hiệu là pUBi::cdsCR7.
- Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65.
Dạng đột biến crl1 được phát triển từ giống lúa TC65, có đặc điểm hình thái thân lá bình thường, nhưng lại giảm tính hướng trọng lực Bộ rễ của dạng đột biến này chỉ bao gồm một rễ chính từ phôi hạt, và từ giai đoạn 3 tuần tuổi, có khả năng hình thành thêm một vài rễ phụ.
Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng
A Cây lúa Taichung65 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm có nhiều rễ phụ ở bộ rễ
B Cây lúa crl1 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm chỉ có 1 rễ chính
3.1.2 Mồi và các vật tư khác Để PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen, mồi xuôi được thiết kế nằm trên đoạn promoter và mồi ngược nằm trên trình tự cds của gen đích (Bảng 3.1). Để đánh giá sự biểu hiện của gen CR7 trong các dòng chuyển gen bằng phương pháp qPCR, thiết kế cặp mồi sao cho mồi xuôi bắc qua intron và nằm trên vùng ORF của gen CR7, mồi còn lại nằm sau mã kết thúc TAG trên trình tự 3’UTR Biểu hiện của gen actin được dùng làm tham chiếu (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Gen nghiên cứu
Gen chọn lọc thực vật HPT
Tên mồi R7-P-F GUS-R CR7-R FBUBI CR7-RT-F CR7-RT-R ACTF ACTR HPT-PC-F HPT-PC-R
Để thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử, cần chuẩn bị một số vật tư và dụng cụ thiết yếu như máy PCR, máy RT-PCR, máy li tâm, máy điện di, máy soi UV và máy cắt tiêu bản vibratome Bên cạnh đó, các hóa chất phục vụ cho việc tách chiết DNA, RNA, PCR, cDNA, qPCR và nhuộm GUS cũng là những thành phần quan trọng không thể thiếu.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu hoạt động của promoter CR7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa
- Chọn lọc những dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen proCR7::GUS dựa trên mức độ phân ly di truyền.
- Chọn lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc promoter CR7.
- Đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị GUS.
3.2.2 Nghiên cứu vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa
- Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR.
- Sàng lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen pUBi::cdsCR7 thông qua sự phân ly di truyền.
- Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen pUBi::cdsCR7.
- Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen CR7
3.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian: Từ tháng 1/2017 đến tháng 10/2017
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR 3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu tách chiết RNA
Mẫu lá khoảng 500 mg từ các dòng lúa chuyển gen pUBi::cdsCR7 và dòng đối chứng không chuyển gen được thu thập từ cây T0 đã được đánh dấu Các mẫu này được gói trong giấy bạc và ghi nhãn, sau đó nhanh chóng được bảo quản trong nitơ lỏng Mẫu lá có thể được sử dụng ngay lập tức hoặc được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -80°C.
3.4.1.2 Tách chiết RNA tổng số
RNA được tách chiết từ lá non của cây lúa 2 tuần tuổi bằng phương pháp Trizol LS, sử dụng các hóa chất như Trizol LS Reagent, isopropanol, chloroform, ethanol và nước Mili-Q Quy trình tách chiết RNA được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả.
1 Nghiền mịn 500 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối sứ Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml đã được làm lạnh.
2 Thêm 1,2 ml Trizol LS cho vào mỗi ống, sau đó vortex mạnh.
3 Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút.
4 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 10 phút, sau khi ly tâm xong, hút hết dịch nổi sang ống mới.
5 Thờm 320 àl chloroform, sau đú lắc mạnh trong vũng 30 giõy.
6 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút.
7 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 15 phút.
8 Nhẹ nhàng hút hết dịch nổi phía trên sang ống 1,5 ml mới Bổ sung 0,75 ml isopropanol lạnh, đảo nhẹ nhàng để dịch được trộn đều.
9 Ủ 30 phút ở -20 0 C (hoặc ủ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng) Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0 C, loại bỏ dịch để thu phần kết tủa
10 Bổ sung 1.2 ml ethanol 75%, vortex nhẹ.
11 Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút ở 4 0 C Sau đó loại bỏ ethanol để thu phần kết tủa.
12 Hũa tan RNA bằng 50 àl nước Mili-Q, li tõm xuống đỏy rồi cho ngay vào đá Giữ RNA ở -20 0 C (nếu dùng luôn) hoặc -80 0 C (nếu muốn bảo quản trong thời gian dài).
RNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% ở 80V trong 30 phút Soi dưới máy chụp gel để kiểm tra số lượng và chất lượng RNA tách chiết được
RNA sau khi tách chiết sẽ được xử lý bằng DNase I ở nhiệt độ 37 độ C trong 10 phút để loại bỏ DNA Sau khi xử lý, các mẫu RNA sẽ trải qua phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp thành các sợi đôi cDNA Mỗi mẫu sẽ được sử dụng cho quá trình này.
Để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với thể tích 20 µl, cần sử dụng 4 µg RNA tổng số và các thành phần phản ứng bao gồm: 4 µl 5X Reaction buffer, 2 µl enzyme Maxima và nước H2O Quy trình nhiệt cho phản ứng được thực hiện như sau: ủ ở 25°C trong 10 phút, sao chép ngược ở 50°C trong 54 phút, và kết thúc phản ứng ở 85°C trong 10 phút Cuối cùng, hỗn hợp cần được pha loãng xuống nồng độ 0,05 µg/µl.
Sau khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược, RNA được chuyển đổi thành cDNA Để xác nhận sự hiện diện của cDNA, sản phẩm phiên mã ngược được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen actin, được sử dụng làm đối chứng dương Gen actin, mã hóa cho protein actin, là một thành phần quan trọng của bộ khung xương tế bào và có mức độ biểu hiện cao Cặp mồi này được thiết kế để bao gồm một đoạn intron, cho phép nhận diện cDNA của gen actin với kích thước 212 bp, đồng thời kiểm tra sự lẫn tạp của genomic DNA, với sản phẩm khuếch đại có kích thước 369 bp.
Pha thành phần phản ứng qPCR 10 àl/phản ứng (nồng độ 0,02 àg RNA/àl phản ứng) gồm: 5 àl GoTaq đ Green Master Mix, 0,4 àl Primers mix (2 àmol/àl),
Để thực hiện phản ứng qPCR, cần chuẩn bị hỗn hợp bao gồm 0,6 µl H2O và 4 µl cDNA, sau đó tiến hành chu trình nhiệt với các điều kiện: 95°C trong 2 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ với 95°C - 2 phút, 55°C - 1 phút và 72°C - 1 phút, kết thúc với 72°C trong 5 phút Hóa chất phát huỳnh quang sử dụng là SYBR, và kết quả phân tích sẽ được đọc trên máy tính và xử lý bằng phần mềm Excel 2013 Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển sẽ được thực hiện ở thế hệ T1 và T2, với việc chọn lọc dòng lúa T1 mang một bản sao của cấu trúc gen biến nạp.
Để chọn các dòng lúa mang gen biến nạp, các dòng lúa chuyển gen ở thế hệ T1 được phân tích Mỗi cấu trúc chuyển gen có 3-5 dòng T0 được kiểm tra sự phân ly di truyền bằng phương pháp PCR Mỗi dòng chuyển gen được gieo 15-20 hạt in vitro trong môi trường 1/2MS, sau một tuần, mẫu lá được cắt để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phân tích PCR Kết quả PCR được sử dụng để đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền của gen biến nạp theo phương pháp phân phối Khi bình phương (χ²) Các cây dương tính T1 có tỷ lệ phân ly 3:1 được trồng riêng trong từng chậu trong nhà lưới để thu hạt cho các nghiên cứu tiếp theo Hạt từ cây T1 nảy mầm trong ống nghiệm tạo ra cây T2, sau đó tiếp tục đánh giá các cây T2.
Hạt được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS với thành phần như trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS
- Hạt thóc được bóc vỏ, sau đó khử trùng:
+ Lắc trong dung dịch ethanol 70% trong 1 phút.
+ Ngâm 20 phút trong dung dịch nước Javen (NaClO) 3,8%.
+ Rửa thật kỹ 6 lần bằng nước cất khử trùng.
Sau khi khử trùng hạt giống, cấy hạt vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng Đặt ống nghiệm trong phòng nuôi cây với chế độ chiếu sáng 12 giờ sáng và 12 giờ tối, duy trì nhiệt độ phòng ở mức 28 độ C trong khoảng 7-10 ngày.
Tách chiết DNA từ lá lúa
DNA tổng số từ lá cây lúa chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Xin Xu et al (2005) có cải tiến.
- 100 ml Dung dịch I gồm: 10g sodium lauryl sarcosine và 100 ml SDS 10%
- 100 ml Dung dịch II gồm: 2 g CTAB, 10 ml 1M Tris-HCl pH 8,0,
4 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 và 28 ml 5M NaCl.
- Dung dịch đệm tách chiết được pha trước khi tiến hành tách chiết theo tỷ lệ 13 Dung dịch I : 7 Dung dịch II.
- Cắt 1 đoạn lá khoảng 5 cm cây lúa 7-10 ngày tuổi được nảy mầm trong ống nghiệm.
Để chuẩn bị mẫu, cắt nhỏ đoạn lá lúa và cho vào ống eppendorf 2 ml, mỗi ống cần bổ sung một bi nghiền Sau đó, ngâm ống trong nitơ lỏng khoảng 5 phút và nghiền mẫu bằng máy lắc.
- Bổ sung 150 àl dung dịch đệm tỏch chiết, đảo đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 65 0 C trong 30 phút.
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1.660 g (~ 4.200 rpm) trong 10 phút
- Bổ sung 20 àl chloroform và lắc nhẹ trong 10 giõy, sau đú bổ sung 20 àl 5M kali axetat và lắc nhẹ trong 10 giõy.
- Ly tâm 1.660 g ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Cẩn thận hỳt 100 àl lớp dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung 100 àl isopropanol lạnh, đảo đầu ống vài lần Làm lạnh 30 phỳt ở -20 0 C.
- Ly tâm 3.000 g (~ 5.700 rpm) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Loại bỏ dịch lỏng, rửa tủa DNA bằng 200 ml ethanol 70% 2 lần Mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 3.000g trong 5 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
- Làm khụ tủa DNA và hũa tan bằng 50 àl nước Milli-Q hoặc TE cú bổ sung 20 àg/ml RNAase Ủ 30 phỳt ở nhiệt độ 37 0 C.
- Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 30 phút Phương pháp PCR kiểm tra dòng chuyển gen
Phương pháp PCR được áp dụng để xác định sự hiện diện của cấu trúc gen chuyển mục tiêu pUbi::cdsCR7 hoặc proCR7::GUS trong các dòng lúa chuyển gen Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng là CR7-R/FBUBI và R7-P-F/pcGUS-R, cùng với hpt-pc-F/hpt-pc-R.
Thành phần và chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR 20 àl thể hiện lần lượt ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Dream Taq Buffer 10X dNTPs
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
3.4.2.2 Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen biến nạp
Kết quả từ việc chọn lọc các dòng chuyển gen T1 với một bản sao cấu trúc gen biến nạp đã dẫn đến việc tiếp tục sàng lọc ở thế hệ T2 nhằm xác định ít nhất 2 dòng đồng hợp tử độc lập dựa trên mức độ phân ly di truyền Các dòng chuyển gen T2 đồng hợp tử có 100% cây kiểm tra mang cấu trúc gen biến nạp Để đơn giản hóa quy trình, chúng tôi đã áp dụng phương pháp chọn lọc cây mang gen bằng kháng sinh hoặc thông qua phương pháp nhuộm X-gluc đối với promoter CR7.
- Với mỗi dòng kiểm tra đem gieo 20-30 hạt trên môi trường dinh dưỡng
- Sau 3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung 50 mg/l hygromycin.
Sau 10 ngày thực hiện việc đếm số cây kháng kháng sinh (cây sống) và không kháng (cây chết), chúng tôi đã tính toán tỷ lệ cây kháng kháng sinh Tiếp theo, chúng tôi tiến hành điện di để kiểm tra sản phẩm khuếch đại.
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 35 phút.
Hóa chất sử dụng: agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0.5X; ethidium bromide nồng độ 0,5 àg/ml (EtBr).
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 1 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-
Để thực hiện quá trình điện di, đầu tiên hãy làm nóng dung dịch đến 60 độ C và đổ vào khay điện di đã được cài sẵn răng lược, sao cho dung dịch ngập khoảng 2/3 chiều dài răng lược Sau đó, để gel đông cứng hoàn toàn Khi gel đã đông cứng, rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, sau đó đổ dung dịch TAE sao cho ngập hoàn toàn bản gel.
- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với ladder 1 kb để kiểm tra kích thước.
Nhuộm bản gel là quy trình quan trọng trong phân tích DNA, trong đó bản gel được lấy ra từ khuôn và ngâm trong dung dịch nước chứa EtBr trong khoảng 20-30 phút Sau đó, bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, và hình ảnh được chụp bằng thiết bị soi gel.
3.4.3 Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen CR7