quan tài liệu
Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa
Cấu trúc rễ lúa bao gồm rễ phôi và các loại rễ hậu phôi, với tổng cộng 5 loại rễ chính: rễ phôi, rễ phụ phôi, rễ phụ hậu phôi, rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ phôi xuất hiện đầu tiên sau 2-3 ngày kể từ khi hạt nảy mầm, tiếp theo là sự hình thành 5 rễ phụ phôi từ nốt bao lá mầm trong giai đoạn xuất hiện lá thứ nhất và thứ hai Các rễ phụ hậu phôi hình thành từ các nốt thân và được sắp xếp theo một hoặc hai hàng.
Hình 2.1 Cấu trúc và hình thái rễ lúa (ra: rễ phôi, cr: rễ phụ, ecr: rễ phụ phôi, slr: rễ bên nhỏ, llr: rễ bên lớn)
Rễ bên có thể phát triển từ bất kỳ loại rễ sơ cấp nào, bao gồm rễ phụ phôi và rễ phụ Dựa vào hình thái giải phẫu, rễ bên được chia thành hai loại: rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ bên nhỏ có số lượng lớn và đóng vai trò quan trọng hơn trong sự sinh trưởng của cây so với rễ bên lớn Trong khi rễ bên nhỏ phát triển kéo dài về hai bên, rễ bên lớn lại kéo dài chủ yếu về phía bên dưới.
Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân
Bộ rễ lúa có cấu trúc giải phẫu đối xứng, cho thấy khả năng thích nghi tốt với môi trường ngập nước Các mô chuyên hóa trong bộ rễ giúp lúa sinh trưởng bình thường, đảm bảo sự phát triển bền vững trong điều kiện ngập úng.
Rễ cây cấu trúc từ nhiều lớp, bao gồm biểu bì, ngoại bì, cương mô, gỗ giữa (trung bì) và nội bì, cùng với phần bó mạch trung tâm Biểu bì, ngoại bì, cương mô và nội bì đều được tạo thành từ một lớp tế bào đơn giống nhau ở tất cả các loại rễ Lớp ngoại bì, nằm bên trong lớp biểu bì, có chức năng bảo vệ các rễ già khi lớp biểu bì mất đi, đồng thời đảm nhận vai trò hấp thụ nước và chất dinh dưỡng.
Lớp cương mô lignin hóa giúp bảo vệ lớp ngoại bì và hạn chế sự khuếch tán oxy, hỗ trợ cây chống lại tình trạng thiếu khí Trung bì gồm 4-5 lớp tế bào đối xứng, phân hóa thành mô khí với các tế bào tự phân giải hoặc di chuyển ra ngoài, tạo khoảng trống giữa các tế bào và phát triển thành gian bào Mô khí có chức năng trao đổi khí, cung cấp oxy cho quá trình hô hấp của cây Sự phát triển của mô khí phổ biến ở nhiều loài thực vật sống ngập nước, và có mặt ở tất cả các loại rễ lúa ngoại trừ rễ bên nhỏ do không có lớp tế bào trung bì.
Nội bì là mô cuối cùng trong hệ thống mô cơ bản, chứa vành đai casparian được cấu tạo từ suberin bao quanh tế bào Đai casparian phát triển mạnh mẽ khi rễ lúa sinh trưởng trong đất, nhưng kém phát triển hơn trong môi trường thủy canh Các tế bào nội bì đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra rào cản đối với nước và chất dinh dưỡng, đồng thời cho phép vận chuyển có chọn lọc các chất qua con đường liên tế bào giữa trung bì và bó mạch trung tâm.
Hình 2.3 Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa
Trong lớp một lá mầm, phần bó mạch trung tâm được tổ chức với các bó mạch xylem xen kẽ với mạch phloem, tạo thành vùng có áp suất cao Mạch xylem phát triển thành protoxylem xuyên qua vùng trung trụ, trong khi sự phân hóa xylem và phloem diễn ra từ ngoài vào trung tâm Ở rễ phôi, có một hoặc hai mạch xylem trung tâm được bao quanh bởi 6-8 mạch xylem nhỏ hơn và 6-7 ống phloem xen kẽ với các mạch xylem Mạch phloem được cấu thành từ các tế bào tương tự nhau, hình thành cấu trúc đối xứng từ các ống protophloem Khoảng không gian giữa xylem và phloem được lấp đầy bởi các sợi cương mô (Rebouillat et al., 2008).
2.1.2 Chức năng bộ rễ lúa
Bộ rễ lúa có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển nước và muối khoáng hòa tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây Phát triển sâu vào lòng đất, rễ lúa hoạt động như một mỏ neo vững chắc, giúp cây đứng vững Hệ thống rễ còn thực hiện các chức năng phụ như dự trữ và tổng hợp hormone sinh trưởng, bao gồm auxin, ABA và ethylen, những chất này có vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu giữa chồi và rễ, từ đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây một cách hợp lý (Wu and Cheng, 2014; Gregory and Kirkegaard, 2017).
Xylem là cơ quan chuyên trách trong việc vận chuyển nước và chất dinh dưỡng cho cây, bao gồm bốn loại tế bào chính: tế bào ống, khung xương, sợi và nhu mô Trong đó, tế bào xylem ống và khung xương đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển, trong khi xylem sợi và mô mềm hỗ trợ cấu trúc Các thành phần xylem ống, xương và sợi là không sống, còn xylem mô mềm là thành phần sống Xylem thứ cấp (gỗ) không chỉ giúp vận chuyển chất dinh dưỡng mà còn hỗ trợ cây trong việc di chuyển chất đến lá cây.
Nước và các chất dinh dưỡng được vận chuyển vào rễ cây qua hai con đường chính: hệ thống apoplastic và symplastic Trong hệ thống apoplastic, nước và chất dinh dưỡng di chuyển qua các thành vách tế bào nhờ vào hệ thống mao quản liên thông Tuy nhiên, tại vòng đai Casparin, quá trình vận chuyển bị ngăn chặn, buộc nước và chất dinh dưỡng phải xuyên qua tế bào nội bì thông qua hệ thống chất nguyên sinh ở hai mặt chưa hóa bần Sau đó, chúng tiếp tục vào thành vách tế bào của tế bào nhu mô ruột để vào mạch dẫn Động lực vận chuyển trong hệ thống apoplast chủ yếu do lực hút của mao quản và lực trương của keo trong thành tế bào, trong khi hệ thống symplast sử dụng lực hút trương của keo nguyên sinh chất để thúc đẩy quá trình vận chuyển.
Hình 2.4 Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ
Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học
2.2.1 Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa
Hạn được định nghĩa là sự thiếu hụt nước và khả năng trữ ẩm của đất, xảy ra khi nước trong đất bốc hơi liên tục dưới điều kiện thời tiết khô nóng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng Stress hạn tác động lên cây lúa qua nhiều cơ chế khác nhau, dẫn đến quá trình đóng khí khổng và hạn chế trao đổi khí Đánh giá stress hạn dựa trên sự giảm hàm lượng nước, thế năng nước của lá, áp suất trương, hoạt động của khí khổng, cùng với sự giảm sinh trưởng và mở rộng tế bào Ở mức độ nghiêm trọng, stress hạn có thể ngưng quá trình quang hợp, gây rối loạn trao đổi chất và làm cây không còn khả năng sống sót Stress hạn ảnh hưởng đến sự phát triển của cây thông qua các quá trình sinh lý và sinh hóa như quang hợp, hô hấp, vận chuyển, hấp thu ion, carbonhydrate, đồng hóa dinh dưỡng và các promoter sinh trưởng (Singh et al., 2012).
Hình 2.5 Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn
Theo Singh et al (2012), khoảng 380 triệu ha đất trồng trọt trên thế giới bị ảnh hưởng bởi stress mặn, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác Đất mặn thường đi kèm với đất kiềm và ngập nước (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003), với NaCl là muối chủ yếu gây ra tình trạng này Đất mặn được xác định có độ dẫn điện EC > 4.0 dS/m Lúa là loại cây nhạy cảm với độ mặn, khi đất có độ mặn cao sẽ gây ra những tác động không thể phục hồi như rối loạn quá trình đồng hóa ion, làm hỏng chức năng màng tế bào, và ức chế quá trình trao đổi chất, dẫn đến giảm sinh trưởng và năng suất (Ji-Ping et al., 2007) Ảnh hưởng lớn nhất của mặn là giảm năng suất và sản lượng cây trồng, thông qua hai loại stress: stress áp suất thẩm thấu ở giai đoạn đầu do nồng độ muối cao và stress ion ở giai đoạn sau gây ngộ độc cho cây Nồng độ ion Na+ cao làm giảm quá trình ra hoa, ảnh hưởng đến tính hữu dục của hoa, khiến bông lúa phát triển kém và ức chế hoạt động quang hợp.
Các stress phi sinh học khác
Ngập úng là một dạng stress phi sinh học phổ biến, gây ra sự giảm nhanh chóng tỷ lệ oxy hòa tan trong nước, dẫn đến nồng độ oxy trong tế bào giảm sút và khủng hoảng năng lượng Tình trạng này trở nên nghiêm trọng hơn khi quá trình quang hợp bị ức chế và ngừng lại hoàn toàn.
Cây lúa, mặc dù có khả năng chịu ngập úng, nhưng chỉ một số giống có thể vươn dài lóng để sống sót, trong khi hầu hết sẽ chết sau 14 ngày ngập hoàn toàn Ngập úng thường xảy ra ở các khu vực trồng lúa nhờ nước trời, dẫn đến giảm năng suất đáng kể Hiện tượng này ức chế quá trình trao đổi chất hiếu khí và quang hợp, làm giảm hàm lượng carbohydrate và gây chết cây.
Stress lạnh là yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, năng suất và phân bố địa lý của cây trồng, đặc biệt ở vùng ôn đới và vùng vĩ độ cao Điều này giải thích tại sao lúa gạo có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nhiệt độ thấp tác động tiêu cực đến sự phát triển của cây lúa ở mọi giai đoạn, từ nảy mầm đến quá trình chín hạt Trong giai đoạn nảy mầm, nhiệt độ thấp không chỉ ức chế tỷ lệ nảy mầm mà còn có thể giảm năng suất đến 25% và tạo điều kiện cho cỏ dại phát triển.
Stress lạnh trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng có thể gây ra vàng lá, ngừng sinh trưởng và giảm số lượng nhánh của cây con (Cruz et al., 2013) Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, stress lạnh ảnh hưởng đến chất lượng hạt và quá trình vào chắc, dẫn đến giảm năng suất (Jena et al., 2012; Cruz et al., 2014; Zhang et al., 2014).
2.2.2 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn
Bộ rễ của cây lúa đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất dưới điều kiện hạn hán Cấu trúc và sự phát triển của hệ thống rễ quyết định chức năng của cây trong môi trường khô hạn Trong khi các bộ phận trên mặt đất như lá và thân bị ức chế sinh trưởng, bộ rễ vẫn duy trì sự phát triển nhờ khả năng điều chỉnh tốt Cụ thể, bộ rễ có thể thiết lập lại thế năng nước thông qua thay đổi áp suất thẩm thấu và nới lỏng thành tế bào, cho phép cây phục hồi sinh trưởng ngay cả trong điều kiện khô hạn (Pandey and Shukla, 2015).
Sự phát triển của hệ thống rễ được kiểm soát bởi các yếu tố nội tại, quyết định cấu trúc tổng thể của bộ rễ Tiềm năng di truyền của các tính trạng rễ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng phản ứng của cây trước các stress môi trường như khô hạn, ngập úng và thiếu dinh dưỡng, đồng thời tạo ra tính linh hoạt trong quá trình phát triển của bộ rễ (Courtois et al., 2009).
Các tính trạng rễ đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì năng suất cây trồng trong điều kiện khô hạn, bao gồm đường kính rễ nhỏ, chiều dài rễ và mật độ rễ dài sâu trong lòng đất nơi có nước Khả năng sinh trưởng của rễ ăn sâu và đường kính xylem của chúng ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước Ở cấp độ toàn cơ thể, khả năng chống chịu hạn liên quan đến tổng sinh khối và kích thước bộ rễ so với các bộ phận khác như lá và chồi Ở cấp độ cơ quan, các yếu tố như đường kính rễ, chiều dài rễ chính, diện tích bề mặt rễ chính và mật độ mô rễ cũng rất quan trọng Ở cấp độ mô và tế bào, đường kính xylem, hoạt động của aquaporin, sự hình thành mô khí và khôi phục bóng khí qua áp suất rễ có ảnh hưởng lớn Cuối cùng, ở cấp độ hệ thống cơ quan, sự phân bố sâu của hệ thống rễ, khả năng phục hồi sinh trưởng của rễ khi có nước và số lượng chóp rễ trên chiều dài hệ rễ đều góp phần vào khả năng chống chịu hạn Các tính trạng này liên quan đến các QTLs và gen như chiều dài rễ, sinh khối rễ, số lượng rễ, tốc độ kéo dài rễ, sự phân nhánh rễ, góc rễ, đường kính xylem và hoạt động của aquaporin (Comas et al., 2013).
2.2.3 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn
Khả năng chống chịu với mặn của cây không chỉ phụ thuộc vào một tính trạng đơn lẻ, mà cần phải hiểu rõ phản ứng của cây dưới điều kiện stress mặn Các nghiên cứu thường đánh giá phản ứng sinh lý của cây trong môi trường mặn, trong đó áp suất thẩm thấu và nồng độ ion cao gây ra hiện tượng ngộ độc ion là những tác động chính Lục lạp và ty thể được xác định là hai cơ quan dễ bị tổn thương nhất bởi mặn, vì vậy, nghiên cứu về hàm lượng diệp lục, sự thay đổi bước sóng diệp lục và tính thấm của màng là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả quang hợp của cây (Ghosh et al., 2016).
Các nghiên cứu cho thấy mặn làm giảm diện tích lá và thay đổi cấu trúc giải phẫu của cây lúa, cả trong điều kiện in vitro và trong nhà lưới Sự xuất hiện của mặn gây ra các tác động gây chết cho mô tế bào thịt lá và có thể làm giãn mô thịt lá, ảnh hưởng đến các bó mạch Để giảm thiểu ảnh hưởng độc hại do sự tích lũy ion Na+, cây lúa có thể áp dụng một số cơ chế như đào thải muối, hấp thụ chọn lọc các ion và điều hòa tỷ lệ K+/Na+ (Mickelbart et al., 2015).
Những nghiên cứu trên cây mô hình đã xác định HKT1 (Kênh vận chuyển
K + ái lực cao (HIGH-AFFINITY K + TRANSPORTER 1), SOS1 (SALT OVERLY SENSITIVE 1) và NHX (Na + /H + EXCHANGER) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng ion Na + Các gen HKT1 và SOS1 điều chỉnh dòng chảy ion qua màng sinh chất, trong khi gen NHX kiểm soát sự di chuyển ion vào không bào, góp phần vào khả năng thích ứng với điều kiện môi trường (Hasegawa, 2013; Munns và Tester, 2008; Schroeder et al., 2013).
Hình 2.6 Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa
Gần đây, gen HKT1 và các alen của nó đã được xác định là yếu tố quan trọng trong khả năng chống chịu mặn của cây ngũ cốc Cụ thể, HKT1;5 hoạt động như một kênh vận chuyển Na+ trên màng sinh chất, giúp phân phối Na+ từ mạch xylem rễ đến các tế bào nhu mô và trung bì Việc giảm lượng Na+ trong mạch xylem có tác dụng hạn chế dòng vận chuyển tới chồi Sự khác biệt trong khả năng chống chịu mặn ở cây lúa non liên quan đến alen OsHKT1;5, cho thấy vai trò quan trọng của biến thể này trong quá trình này.
4 amino acid ở vùng loop của OsHKT1;5 tạo ra giống kháng mặn tích lũy ít ion
Na + hơn giống mẫn cảm Koshihikari (Hình 2.6) (Zhong-Hai et al., 2005)
Một số alen OsHKT1;5 có khả năng duy trì cân bằng K+/Na+ thông qua các biến đổi amino acid đặc thù, giúp tăng cường vận chuyển K+ vào xylem rễ hơn so với Na+ Gen HKT1;5 nằm trong QTL Saltol, được xác định từ giống lúa cạn Pokkali, là công cụ quan trọng trong việc xác định khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con và đã được ứng dụng trong các chương trình chọn tạo giống Tuy nhiên, việc đánh giá các alen của gen OsHKT1;5 và nồng độ Na+, K+ trong mô cho thấy gen này vẫn chưa được xác định rõ chức năng di truyền trong việc giảm thiểu tác hại của ion Na+ ở cây con Oryza sativa và Oryza glaberrima (Mickelbart et al., 2015).
Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa
Auxin nội sinh là hormone thiết yếu cho sự phát triển bộ rễ lúa và cây trồng Việc xử lý auxin ngoại sinh kích thích sự phát sinh rễ phụ và rễ bên Nhiều gen liên quan đến đường truyền tín hiệu auxin đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển bộ rễ Protein PIN, đặc biệt là PIN1, chịu trách nhiệm cho sự tích lũy và vận chuyển auxin trong cây, được kích hoạt bởi gen CRL4 (OsGNOM1) Gen CRL4 giúp duy trì gradient auxin thích hợp tại phần gốc thân, cần thiết cho sự hình thành rễ phụ ở lúa Gen OsGNOM1 tương đồng với GNOM1 ở Arabidopsis, có vai trò trong việc điều hòa protein PIN1, từ đó ảnh hưởng đến sự phân chia bất đối xứng của tế bào nhu mô và sự phát triển mô phân sinh rễ phụ.
Hình 2.7 Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa
In rice plants, the signaling of auxin to auxin-responsive genes is regulated by the interaction between two protein families: AUX/IAA (Auxin/Indole-3-acetic Acid) and ARF (Auxin Response Factor).
Khi nồng độ auxin nội sinh thấp, protein AUX/IAA liên kết với gen ARF, ức chế sự biểu hiện của chúng Ngược lại, khi nồng độ auxin tăng cao, tín hiệu auxin kích thích phân hủy protein AUX/IAA, từ đó kích hoạt gen sinh tổng hợp protein ARF.
Các protein ARF đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt quá trình phiên mã trong đường truyền tín hiệu auxin bằng cách gắn vào vùng cảm ứng auxin trên promoter của các gen cảm ứng auxin Điều này giúp tăng cường biểu hiện của các gen liên quan trong mạng lưới điều hòa sự hình thành rễ phụ và rễ bên ở cây lúa Ngoài ra, đã có 31 gen tương đồng mã hóa họ protein AUX/IAA được phát hiện trên cây lúa.
Nghiên cứu của Inukai et al (2005) chỉ ra rằng ARF1 gắn vào vùng cảm ứng auxin AuxRE2 trên trình tự promoter của gen crl1 (Crown rootless 1), từ đó điều hòa biểu hiện của gen này Gen crl1 mã hóa yếu tố phiên mã LBD/LOB, và việc đột biến điểm trên gen crl1 ở giống lúa Taichung65 đã được thực hiện để nghiên cứu thêm về chức năng của nó.
Y et al (2005) đã tạo được thể đột biến crl1 không có sự hình thành rễ phụ Kết quả đánh giá chỉ cho thấy gene crl1 đáp ứng rất sớm với auxin và tại vị trí gốc thân cây lúa crl1 cũng biểu hiện ở vùng trả lời tín hiệu của auxin (Inukai et al., 2005)
Nhóm nghiên cứu của Liu H et al (2005) đã tạo ra thể đột biến soma arl1 với đoạn 20 bp bị mất trên gen ARL1 (Adventitious rootless 1), dẫn đến việc hoàn toàn không phát sinh rễ phụ Gen ARL1 mã hóa cho protein thuộc họ LOB, được biểu hiện ở mô phân sinh rễ phụ, rễ bên, mô phân sinh chồi và mô mạch dẫn ARL1 phản ứng với auxin, và cơ chế biểu hiện của nó ở rễ tương đồng với sự phân bố auxin Mặc dù hai gen crl1 và ARL1 được công bố tại hai thời điểm khác nhau, nhưng thực chất chúng là một gene.
Nghiên cứu của Coudert J et al (2011) cho thấy gen crl1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa mạng lưới gen liên quan đến sự hình thành rễ phụ ở cây lúa Qua phương pháp Affymetrix microarray, nhóm nghiên cứu đã phát hiện 250 gen, trong đó 236 gen được điều hòa xuôi và ngược ở cây đột biến crl1 so với cây wildtype Taichung65 Đặc biệt, các gen phản ứng sớm với auxin đã được xác định, cho thấy rằng phần lớn các gen liên quan đến hormone, nước và dinh dưỡng không bị điều hòa trực tiếp bởi gen crl1 khi không có sự hình thành rễ phụ Ba gen phụ thuộc vào crl1 phản ứng với auxin bao gồm FSM/FAS1, GTE4 và MAP protein liên kết với vi ống, trong đó FSM/FAS1 và GTE4 đã được chứng minh có liên quan đến sự duy trì mô phân sinh rễ ở cả lúa và Arabidopsis thông qua quá trình tái sắp xếp chất nhiễm sắc và điều hòa chu kỳ tế bào.
Hình 2.8 Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1
Coudert J et al (2015) đã nghiên cứu việc khôi phục sự biểu hiện của gen crl1 trong cây đột biến bằng cách chuyển gen này dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng với DEX Họ đã tách chiết mRNA trước khi xử lý, 4h và 8h sau khi xử lý với DEX để phân tích transcriptome Kết quả cho thấy crl1 điều hòa tăng cường biểu hiện của 277 gen, bao gồm các gen quan trọng liên quan đến phân chia mô phân sinh, phản phân hóa tế bào và cân bằng hormone Nhóm nghiên cứu đã chọn 13 gen có mức độ biểu hiện mạnh, ký hiệu từ CR1 đến CR13, để nghiên cứu chức năng liên quan đến hình thành rễ phụ, trong đó gen CR7 mã hóa cho yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là các dòng lúa chuyển gen được cung cấp bởi phòng thí nghiệm liên kết Việt-Pháp (LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp, gồm:
Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào giống Taichung65 (TC65) và thể đột biến (crl1) ở các thế hệ T0, T1, T2 có cấu trúc gen chuyển bao gồm phần cds (coding sequence) của gen CR7, được điều khiển bởi promoter Ubiquitin, ký hiệu là pUBi::cdsCR7.
- Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65.
Dạng đột biến crl1, được phát triển từ giống lúa TC65, có hình thái thân lá bình thường nhưng giảm tính hướng trọng lực Bộ rễ của dạng đột biến này chủ yếu bao gồm một rễ chính phát triển từ phôi hạt, và từ giai đoạn 3 tuần tuổi, có thể hình thành thêm một số rễ phụ.
Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng
A Cây lúa Taichung65 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm có nhiều rễ phụ ở bộ rễ
B Cây lúa crl1 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm chỉ có 1 rễ chính
3.1.2 Mồi và các vật tư khác Để PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen, mồi xuôi được thiết kế nằm trên đoạn promoter và mồi ngược nằm
Để đánh giá sự biểu hiện của gen CR7 trong các dòng chuyển gen, phương pháp qPCR được áp dụng với cặp mồi thiết kế đặc biệt: mồi xuôi bắc qua intron và nằm trên vùng ORF của gen CR7, trong khi mồi còn lại nằm sau mã kết thúc TAG trên trình tự 3’UTR Biểu hiện của gen actin được sử dụng làm tham chiếu.
Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Gen nghiên cứu Tên mồi Kích thước khuếch đại Nhiệt độ gắn mồi
Gen chọn lọc thực vật HPT
Để thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử, cần chuẩn bị các vật tư và dụng cụ thiết yếu như máy PCR, máy RT-PCR, máy li tâm, máy điện di, máy soi UV, và máy cắt tiêu bản vibratome Bên cạnh đó, các hóa chất quan trọng phục vụ cho quá trình tách chiết DNA, RNA, PCR, cDNA, qPCR và nhuộm GUS cũng cần được sử dụng.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu hoạt động của promoter CR7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa
- Chọn lọc những dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen proCR7::GUS dựa trên mức độ phân ly di truyền
- Chọn lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc promoter CR7
- Đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị GUS
3.2.2 Nghiên cứu vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa
- Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR
- Sàng lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen pUBi::cdsCR7 thông qua sự phân ly di truyền
- Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen pUBi::cdsCR7.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 10 năm 2017 tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế LMI RICE-2, chuyên về nghiên cứu chức năng gen, công nghệ sinh học thực vật và sự tương tác với vi sinh vật Phòng thí nghiệm này thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, tọa lạc tại Bắc Từ Liêm, Hà Nội, và là một trong những đơn vị trọng điểm quốc gia về công nghệ tế bào thực vật.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR 3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu tách chiết RNA
Mẫu lá khoảng 500 mg từ các dòng lúa chuyển gen pUBi::cdsCR7 và đối chứng (không chuyển gen) được thu thập từ cây T0 đã được đánh dấu Sau khi gói vào giấy bạc và ghi nhãn, mẫu lá được nhanh chóng đưa vào nitơ lỏng Mẫu lá này có thể được sử dụng ngay lập tức hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -80 độ C.
3.4.1.2 Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ lá non của cây lúa 2 tuần tuổi bằng phương pháp Trizol LS, sử dụng các hóa chất như Trizol LS Reagent, isopropanol, chloroform, ethanol và nước Mili-Q Quy trình tách chiết RNA được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả và độ tinh khiết của mẫu RNA thu được.
1 Nghiền mịn 500 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối sứ Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml đã được làm lạnh
2 Thêm 1,2 ml Trizol LS cho vào mỗi ống, sau đó vortex mạnh
3 Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút
4 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 10 phút, sau khi ly tâm xong, hút hết dịch nổi sang ống mới
5 Thờm 320 àl chloroform, sau đú lắc mạnh trong vũng 30 giõy
6 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút
7 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 15 phút
8 Nhẹ nhàng hút hết dịch nổi phía trên sang ống 1,5 ml mới Bổ sung 0,75 ml isopropanol lạnh, đảo nhẹ nhàng để dịch được trộn đều
9 Ủ 30 phút ở -20 0 C (hoặc ủ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng) Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0 C, loại bỏ dịch để thu phần kết tủa
10 Bổ sung 1.2 ml ethanol 75%, vortex nhẹ
11 Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút ở 4 0 C Sau đó loại bỏ ethanol để thu phần kết tủa
12 Hũa tan RNA bằng 50 àl nước Mili-Q, li tõm xuống đỏy rồi cho ngay vào đá Giữ RNA ở -20 0 C (nếu dùng luôn) hoặc -80 0 C (nếu muốn bảo quản trong thời gian dài)
RNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% với điện áp 80V trong 30 phút Sau đó, sử dụng máy chụp gel để kiểm tra số lượng và chất lượng của RNA đã được tách chiết Tiếp theo là quá trình tổng hợp cDNA.
RNA sau khi tách chiết được xử lý bằng DNase I ở 37 độ C trong 10 phút nhằm loại bỏ DNA Sau khi xử lý, các mẫu RNA sẽ được tiến hành phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp thành các sợi đôi cDNA Mỗi mẫu sẽ được sử dụng cho quy trình này.
Để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA, cần sử dụng 4 àg RNA tổng số cho một phản ứng có thể tích 20 àl Các thành phần phản ứng bao gồm: 4 àl 5X Reaction buffer, 2 àl enzym Maxima và nước H2O Quy trình nhiệt cho phản ứng được thực hiện như sau: ủ ở 25°C trong 10 phút, sao chép ngược ở 50°C trong 54 phút, và kết thúc phản ứng ở 85°C trong 10 phút Cuối cùng, hỗn hợp được pha loãng xuống nồng độ 0,05 àg/àl.
Sau khi thực hiện phiên mã ngược, RNA được chuyển đổi thành cDNA Sản phẩm này được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen actin, sử dụng làm đối chứng dương để xác định sự hiện diện của cDNA Gen actin, mã hóa cho protein actin, là một thành phần quan trọng của bộ khung tế bào và có mức độ biểu hiện cao Cặp mồi được thiết kế để chứa một đoạn intron, giúp nhận diện cDNA của gen actin với kích thước 212 bp, đồng thời kiểm tra sự lẫn tạp của genomic DNA với band khuếch đại có kích thước 369 bp.
Thành phần phản ứng qPCR 10 µl/phản ứng bao gồm: 5 µl GoTaq Green Master Mix, 0,4 µl Primers mix (2 µmol/µl), 0,6 µl H2O và 4 µl cDNA, với nồng độ RNA là 0,02 µg/µl Phản ứng qPCR được thực hiện theo chu kỳ nhiệt phù hợp.
95 0 C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 95 0 C - 2 phút, 55 0 C - 1 phút, 72 0 C - 1 phút;
72 0 C trong 5 phút, hóa chất phát huỳnh quang là SYBR Kết quả phân tích được đọc trên máy vi tính và xử lý bằng phần mềm Excel 2013.
3.4.2 Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ T1, T2 3.4.2.1 Chọn lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen biến nạp
Để lựa chọn các dòng lúa mang gen biến nạp, các dòng lúa chuyển gen ở thế hệ T1 đã được phân tích Mỗi cấu trúc chuyển gen được chọn 3-5 dòng T0 để kiểm tra sự phân ly di truyền bằng phương pháp PCR Mỗi dòng chuyển gen được gieo 15-20 hạt in vitro trong môi trường 1/2MS, sau một tuần, mẫu lá được cắt để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phân tích PCR Kết quả PCR cho phép đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền của gen biến nạp thông qua phương pháp phân phối Khi bình phương (χ²) Các cây dương tính T1 với tỷ lệ phân ly 3:1 được trồng riêng trong từng chậu trong nhà lưới để thu hạt cho các nghiên cứu tiếp theo Hạt từ cây T1 nảy mầm trong ống nghiệm sẽ tạo ra các cây T2, tiếp tục được đánh giá trong các nghiên cứu sau.
Hạt được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS với thành phần như trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ
Vitamin MS (100X) 100X 5 ml Đường sucrose - 30 g
- Hạt thóc được bóc vỏ, sau đó khử trùng:
+ Lắc trong dung dịch ethanol 70% trong 1 phút
+ Ngâm 20 phút trong dung dịch nước Javen (NaClO) 3,8%
+ Rửa thật kỹ 6 lần bằng nước cất khử trùng
Sau khi khử trùng hạt, cấy hạt vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng và đặt trong phòng nuôi cây Thời gian chiếu sáng là 12 giờ sáng và 12 giờ tối, với nhiệt độ phòng duy trì ở 28°C trong khoảng 7-10 ngày.
Tách chiết DNA từ lá lúa
DNA tổng số từ lá cây lúa chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Xin Xu et al (2005) có cải tiến
- 100 ml Dung dịch I gồm: 10g sodium lauryl sarcosine và 100 ml SDS 10%
- 100 ml Dung dịch II gồm: 2 g CTAB, 10 ml 1M Tris-HCl pH 8,0, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 và 28 ml 5M NaCl
- Dung dịch đệm tách chiết được pha trước khi tiến hành tách chiết theo tỷ lệ 13 Dung dịch I : 7 Dung dịch II
- Cắt 1 đoạn lá khoảng 5 cm cây lúa 7-10 ngày tuổi được nảy mầm trong ống nghiệm
Cắt nhỏ đoạn lá lúa và cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm một bi nghiền vào mỗi ống Ngâm ống trong nitơ lỏng khoảng 5 phút trước khi nghiền mẫu bằng máy lắc.
- Bổ sung 150 àl dung dịch đệm tỏch chiết, đảo đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 65 0 C trong 30 phút
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1.660 g (~ 4.200 rpm) trong 10 phút
- Bổ sung 20 àl chloroform và lắc nhẹ trong 10 giõy, sau đú bổ sung 20 àl 5M kali axetat và lắc nhẹ trong 10 giây
- Ly tâm 1.660 g ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
- Cẩn thận hỳt 100 àl lớp dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới
- Bổ sung 100 àl isopropanol lạnh, đảo đầu ống vài lần Làm lạnh 30 phỳt ở -20 0 C
- Ly tâm 3.000 g (~ 5.700 rpm) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dịch lỏng, rửa tủa DNA bằng 200 ml ethanol 70% 2 lần Mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 3.000g trong 5 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
- Làm khụ tủa DNA và hũa tan bằng 50 àl nước Milli-Q hoặc TE cú bổ sung 20 àg/ml RNAase Ủ 30 phỳt ở nhiệt độ 37 0 C
- Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 30 phút Phương pháp PCR kiểm tra dòng chuyển gen
Phương pháp PCR được áp dụng để xác định sự hiện diện của cấu trúc gen chuyển mục tiêu pUbi::cdsCR7 hoặc proCR7::GUS trong các dòng lúa chuyển gen Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng bao gồm CR7-R/FBUBI, R7-P-F/pcGUS-R và hpt-pc-F/hpt-pc-R.
Thành phần và chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR 20 àl thể hiện lần lượt ở bảng 3.3 và 3.4
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch 1 phản ứng (àl)
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
3.4.2.2 Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen biến nạp
Từ kết quả chọn lọc những dòng chuyển gen T1 với cấu trúc gen biến nạp, ở thế hệ T2, chúng tôi tiếp tục sàng lọc để tìm ra ít nhất 2 dòng đồng hợp tử độc lập dựa trên mức độ phân ly di truyền Những dòng chuyển gen T2 đồng hợp tử có 100% cây kiểm tra mang cấu trúc gen biến nạp Để đơn giản hóa quá trình, chúng tôi áp dụng phương pháp chọn lọc cây mang gen bằng kháng sinh chọn lọc thực vật hoặc phương pháp nhuộm X-gluc đối với promoter CR7.
- Với mỗi dòng kiểm tra đem gieo 20-30 hạt trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS
- Sau 3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung 50 mg/l hygromycin
- Sau 10 ngày tiến hành đếm số cây kháng (cây sống) và không kháng kháng sinh (cây chết) Tính tỷ lệ cây kháng kháng sinh
3.4.2.3 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 35 phút
Hóa chất sử dụng: agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0.5X; ethidium bromide nồng độ 0,5 àg/ml (EtBr)
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 1 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-
Để thực hiện quy trình điện di, trước tiên, bạn cần làm nóng dung dịch đến 60 độ C và đổ vào khay điện di đã cài sẵn răng lược, sao cho dung dịch ngập khoảng 2/3 chiều dài răng lược Sau khi để gel đông cứng, hãy rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, tiếp theo là đổ dung dịch TAE cho ngập bản gel.
- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với ladder 1 kb để kiểm tra kích thước
Nhuộm bản gel là quá trình mà bản gel được lấy ra từ khuôn và ngâm trong dung dịch nước có chứa EtBr trong khoảng 20-30 phút Sau đó, bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, và hình ảnh được chụp bằng máy soi gel.
3.4.3 Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen CR7
