quan tài liệu
Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa
Cấu trúc rễ lúa bao gồm rễ phôi và nhiều loại rễ hậu phôi, với 5 loại rễ chính: rễ phôi, rễ phụ phôi, rễ phụ hậu phôi, rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ phôi xuất hiện đầu tiên sau 2-3 ngày khi hạt nảy mầm, tiếp theo là 5 rễ phụ phôi từ nốt bao lá mầm trong giai đoạn xuất hiện lá thứ nhất và thứ hai Rễ phụ hậu phôi hình thành từ các nốt thân và được sắp xếp trong một hoặc hai hàng.
Hình 2.1 Cấu trúc và hình thái rễ lúa (ra: rễ phôi, cr: rễ phụ, ecr: rễ phụ phôi, slr: rễ bên nhỏ, llr: rễ bên lớn)
Rễ bên có thể phát triển từ bất kỳ loại rễ sơ cấp nào, bao gồm rễ phụ phôi và rễ phụ Theo hình thái giải phẫu, rễ bên được chia thành hai loại: rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ bên nhỏ có số lượng lớn và đóng vai trò quan trọng hơn trong sự sinh trưởng của cây so với rễ bên lớn Trong khi rễ bên nhỏ phát triển kéo dài về hai bên, rễ bên lớn lại kéo dài theo chiều sâu.
Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân
Bộ rễ lúa có cấu trúc giải phẫu đối xứng, cho thấy khả năng thích nghi tốt với môi trường ngập nước Các loại mô chuyên hóa trong rễ lúa giúp chúng duy trì sinh trưởng bình thường ngay cả trong điều kiện ngập úng.
Rễ cây được cấu tạo từ nhiều lớp, bao gồm biểu bì, ngoại bì, cương mô, gỗ giữa hoặc trung bì, và nội bì, với phần bó mạch nằm ở trung tâm Biểu bì, ngoại bì, cương mô và nội bì đều được tạo thành từ một lớp tế bào đơn và đồng nhất ở tất cả các loại rễ Lớp ngoại bì, nằm ngay bên dưới lớp biểu bì, có chức năng bảo vệ các rễ già khi lớp biểu bì bị mất, đồng thời đảm nhiệm vai trò hấp thụ nước và chất dinh dưỡng.
Lớp cương mô lignin hóa hỗ trợ lớp ngoại bì và hạn chế khuếch tán oxy, giúp cây chống thiếu khí Trung bì gồm 4-5 lớp tế bào đối xứng, phân hóa thành mô khí Mô khí có tế bào tự phân giải hoặc di chuyển, tạo khoảng trống giữa các tế bào, hình thành gian bào Chức năng chính của mô khí là trao đổi khí, cung cấp oxy cho hô hấp của cây từ bộ phận trên Mô khí phát triển phổ biến ở thực vật ngập nước và có mặt ở tất cả rễ lúa trừ rễ bên nhỏ do không có lớp trung bì.
Nội bì là mô cuối cùng của hệ thống mô cơ bản, chứa vành đai casparian được cấu tạo từ suberin bao quanh tế bào Đai casparian phát triển mạnh khi rễ lúa sinh trưởng trong đất, nhưng kém phát triển trong môi trường thủy canh Các tế bào nội bì đóng vai trò quan trọng như rào cản đối với nước và chất dinh dưỡng, cho phép vận chuyển apoplastic qua khoảng gian bào và vận chuyển có chọn lọc qua con đường liên tế bào giữa trung bì và bó mạch trung tâm.
Hình 2.3 Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa
Tổ chức bó mạch trung tâm ở lớp một lá mầm gồm các bó mạch xylem xen kẽ với mạch phloem, trong đó mạch xylem tạo thành vùng có áp suất cao và protoxylem phát triển qua vùng trung trụ Sự phân hóa giữa xylem và phloem diễn ra từ ngoài vào trung tâm Ở rễ phôi, có một hoặc hai mạch xylem trung tâm nằm giữa phần trung trụ, được bao quanh bởi 6-8 mạch xylem nhỏ hơn, trong khi 6-7 ống phloem xen kẽ với các mạch xylem Mạch phloem được cấu thành từ các tế bào tổ chức tương tự nhau từ mỗi ống protophloem, tạo thành cấu trúc đối xứng, và khoảng không gian giữa xylem và phloem được lấp đầy bởi các sợi cương mô (Rebouillat et al., 2008).
2.1.2 Chức năng bộ rễ lúa
Bộ rễ lúa có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển nước và muối khoáng hòa tan cung cấp cho cây, đồng thời phát triển sâu vào lòng đất như một mỏ neo vững chắc chống đỡ cho cây Ngoài chức năng chính, hệ thống rễ còn dự trữ và tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng, bao gồm các hormone như auxin, ABA và ethylen, giúp truyền tín hiệu giữa chồi và rễ, từ đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây một cách hợp lý (Wu and Cheng, 2014; Gregory and Kirkegaard, 2017).
Xylem là cơ quan chuyên trách trong việc vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng trong cây, bao gồm bốn loại tế bào chính: tế bào ống, khung xương, sợi và nhu mô Tế bào ống và khung xương đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển, trong khi xylem sợi và mô mềm hỗ trợ cấu trúc Trong đó, xylem ống, xương và sợi là các thành phần không sống, còn xylem mô mềm là thành phần sống Xylem thứ cấp (gỗ) không chỉ đảm nhận chức năng vận chuyển chất mà còn giúp đưa nước và dinh dưỡng tới lá cây (Ulrich et al., 2016).
Nước và các chất dinh dưỡng được vận chuyển vào rễ thông qua hai con đường chính: hệ thống apoplastic và symplastic Trong hệ thống apoplastic, nước và chất dinh dưỡng di chuyển qua các thành vách tế bào nhờ hệ thống mao quản liên thông Tuy nhiên, tại vòng đai Casparin, chúng bị chặn lại và phải xuyên qua tế bào nội bì qua hệ thống chất nguyên sinh ở hai mặt chưa hóa bần, trước khi vào thành vách tế bào của tế bào nhu mô để vào mạch dẫn Động lực vận chuyển trong hệ thống apoplast chủ yếu là lực hút của mao quản và lực trương của keo trong thành tế bào, trong khi hệ thống symplast phụ thuộc vào lực hút trương của keo nguyên sinh chất.
Hình 2.4 Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ
Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học
2.2.1 Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa
Hạn được định nghĩa là sự thiếu hụt nước và khả năng trữ ẩm của đất, xảy ra khi nước trong đất bốc hơi liên tục dưới điều kiện thời tiết khô nóng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng Stress hạn tác động lên cây lúa qua việc đóng khí khổng và hạn chế trao đổi khí, được đánh giá qua sự giảm hàm lượng nước, thế năng nước của lá, áp suất trương, hoạt động của khí khổng, cũng như sự giảm sinh trưởng và mở rộng tế bào Ở mức độ nghiêm trọng, stress hạn có thể ngăn cản quá trình quang hợp, gây rối loạn trao đổi chất và làm giảm khả năng sống sót của cây Stress hạn ảnh hưởng đến sự phát triển của cây thông qua các quá trình sinh lý và sinh hóa như quang hợp, hô hấp, vận chuyển, hấp thu ion, carbonhydrate, đồng hóa dinh dưỡng và các yếu tố thúc đẩy sinh trưởng (Singh et al., 2012).
Hình 2.5 Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn
Theo nghiên cứu của Singh et al (2012), khoảng 380 triệu ha đất trồng, tương đương 1/3 tổng diện tích đất canh tác toàn cầu, bị ảnh hưởng bởi stress mặn Đất mặn thường đi kèm với hiện tượng đất kiềm và ngập nước (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003), với NaCl là muối chủ yếu gây ra tình trạng này Đất mặn được định nghĩa là đất có độ dẫn điện EC > 4.0 dS/m, và lúa là cây trồng rất nhạy cảm với điều kiện này Mức độ mặn cao có thể gây ra những tác động không thể phục hồi đối với cây, như rối loạn quá trình đồng hóa ion, hư hỏng chức năng màng tế bào, và ức chế trao đổi chất, dẫn đến giảm sinh trưởng và năng suất (Ji-Ping et al., 2007) Tác động lớn nhất của mặn là giảm năng suất và sản lượng cây trồng, thông qua hai loại stress: stress áp suất thẩm thấu ở giai đoạn đầu do nồng độ muối cao tại rễ, và stress ion ở giai đoạn sau gây ngộ độc cho cây Nồng độ ion Na+ cao làm giảm quá trình ra hoa, ảnh hưởng đến khả năng hữu dục của hoa, khiến bông lúa phát triển kém và ức chế hoạt động quang hợp.
Các stress phi sinh học khác
Ngập úng là một loại stress phi sinh học phổ biến, gây ra sự giảm nhanh chóng tỷ lệ oxy hòa tan trong nước Điều này dẫn đến nồng độ oxy trong tế bào giảm và khủng hoảng năng lượng xảy ra, đặc biệt nghiêm trọng khi quá trình quang hợp bị ức chế hoặc ngừng hoàn toàn.
Mặc dù cây lúa có khả năng chịu ngập úng, chỉ một số giống có thể vươn dài lóng để thích nghi, trong khi hầu hết sẽ chết sau 14 ngày ngập hoàn toàn Các khu vực trồng lúa phụ thuộc vào nước trời thường xuyên bị ngập úng, dẫn đến giảm năng suất đáng kể Ngập úng cản trở quá trình trao đổi chất hiếu khí và quang hợp, làm giảm hàm lượng carbonhydrate, gây chết cây.
Stress lạnh là yếu tố phi sinh học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, năng suất và phân bố địa lý của cây trồng, đặc biệt ở vùng ôn đới và vĩ độ cao, lý do khiến lúa gạo có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nhiệt độ thấp tác động đến sự phát triển của cây lúa ở mọi giai đoạn, từ nảy mầm đến quá trình vào chắc hạt Trong giai đoạn nảy mầm, nhiệt độ thấp ức chế tỷ lệ nảy mầm, dẫn đến giảm năng suất lên tới 25% và tạo điều kiện cho cỏ dại phát triển.
Stress lạnh trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây con, dẫn đến hiện tượng vàng lá, ngừng sinh trưởng và giảm khả năng đẻ nhánh Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, stress lạnh tác động đến chất lượng hạt và quá trình vào chắc của hạt, từ đó làm giảm năng suất cây trồng.
2.2.2 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn
Bộ rễ lúa đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất cây trồng dưới điều kiện hạn hán Cấu trúc và sự phát triển của hệ thống rễ quyết định chức năng của cây trong môi trường khô hạn Trong khi các bộ phận trên mặt đất như lá và thân bị ức chế sinh trưởng, bộ rễ lúa vẫn duy trì sự phát triển nhờ khả năng điều chỉnh dưới điều kiện khô hạn Cụ thể, bộ rễ có thể thiết lập lại thế năng nước thông qua thay đổi áp suất thẩm thấu và nới lỏng thành tế bào, cho phép phục hồi sinh trưởng hiệu quả trong tình trạng khô hạn (Pandey and Shukla, 2015).
Sự phát triển của hệ thống rễ được điều khiển bởi các yếu tố nội tại, xác định cấu trúc tổng thể của bộ rễ Tiềm năng di truyền của các tính trạng bộ rễ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phản ứng với các stress môi trường như khô hạn, ngập úng và thiếu dinh dưỡng, đồng thời tạo ra tính linh hoạt trong sự phát triển của bộ rễ (Courtois et al., 2009).
Các tính trạng rễ quan trọng trong việc duy trì năng suất cây trồng trong điều kiện khô hạn bao gồm đường kính và chiều dài của rễ, mật độ rễ dài sâu trong lòng đất nơi có nước Khả năng sinh trưởng của các rễ ăn sâu và đường kính xylem của chúng ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước Ở cấp độ toàn cơ thể, khả năng chống chịu hạn liên quan đến tổng sinh khối và kích thước bộ rễ so với các bộ phận khác như lá và chồi Ở cấp độ cơ quan, sự chống chịu hạn gắn liền với đường kính rễ nhỏ, chiều dài rễ chính, diện tích bề mặt rễ chính và mật độ mô rễ Ở cấp độ mô và tế bào, các yếu tố như đường kính xylem, hoạt động của aquaporin, sự hình thành mô khí và khôi phục các bóng khí qua áp suất rễ cũng rất quan trọng Tại cấp độ hệ thống cơ quan, việc phân bố sâu vào lòng đất của hệ thống rễ, khả năng phục hồi sinh trưởng của rễ khi đất có nước trở lại và số lượng chóp rễ trên chiều dài hệ rễ đều có ảnh hưởng lớn Tóm lại, các tính trạng và gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn bao gồm chiều dài rễ, sinh khối rễ, số lượng rễ, tốc độ kéo dài rễ, sự phân nhánh rễ, góc rễ, đường kính xylem và hoạt động của kênh aquaporin.
2.2.3 Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn
Khả năng chống chịu mặn của cây không chỉ phụ thuộc vào một tính trạng đơn lẻ, mà cần phải hiểu rõ cơ chế phản ứng của cây dưới điều kiện stress mặn Các nghiên cứu thường đánh giá phản ứng sinh lý của cây khi gặp stress mặn, với tác động ban đầu thể hiện qua áp suất thẩm thấu và sau đó là nồng độ ion cao dẫn đến ngộ độc ion Đặc biệt, lục lạp và ty thể là hai cơ quan nhạy cảm nhất với mặn, do đó, cần nghiên cứu hàm lượng diệp lục, sự thay đổi bước sóng diệp lục và tính thấm của màng để cải thiện hiệu quả quang hợp của cây.
Mặn làm giảm diện tích lá và thay đổi cấu trúc giải phẫu của cây lúa, ảnh hưởng đến cả cây lúa in vitro và cây lúa trồng trong nhà lưới Tác động của mặn có thể gây chết cho mô tế bào thịt lá và làm giãn mô thịt lá, ảnh hưởng đến các bó mạch Tuy nhiên, cây lúa có thể giảm thiểu tác động độc hại do tích lũy ion Na+ thông qua một số cơ chế như đào thải muối, hấp thụ chọn lọc các ion, và điều hòa tỷ lệ K+/Na+ (Mickelbart et al., 2015).
Những nghiên cứu trên cây mô hình đã xác định HKT1 (Kênh vận chuyển
Các yếu tố quan trọng như K + ái lực cao (HIGH-AFFINITY K + TRANSPORTER 1), SOS1 (SALT OVERLY SENSITIVE 1) và NHX (Na + /H + EXCHANGER) đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì sự cân bằng ion Na + Các gen HKT1 và SOS1 điều chỉnh dòng chảy ion qua màng sinh chất, trong khi gen NHX kiểm soát sự di chuyển ion vào trong không bào.
Hình 2.6 Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa
Gần đây, nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen HKT1 và các alen của nó đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống chịu mặn của cây ngũ cốc Cụ thể, HKT1;5 là kênh vận chuyển Na+ trên màng sinh chất, giúp phân phối Na+ từ mạch xylem rễ đến các tế bào nhu mô, có thể tới trung bì Việc giảm nồng độ Na+ trong mạch xylem hạn chế dòng vận chuyển đến chồi Đặc biệt, sự khác biệt trong khả năng chống chịu mặn ở cây lúa non liên quan đến biến thể alen OsHKT1;5.
4 amino acid ở vùng loop của OsHKT1;5 tạo ra giống kháng mặn tích lũy ít ion
Na + hơn giống mẫn cảm Koshihikari (Hình 2.6) (Zhong-Hai et al., 2005)
Một số alen OsHKT1;5 giúp duy trì cân bằng K+/Na+ thông qua các biến đổi amino acid, tăng cường vận chuyển K+ vào xylem rễ hơn Na+ Gen HKT1;5 nằm trong QTL Saltol từ giống lúa Pokkali, là công cụ quan trọng trong việc xác định khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây con trên đồng ruộng và được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống Đánh giá các alen của gen OsHKT1;5 và nồng độ Na+, K+ trong mô cho thấy gen này vẫn chưa được xác định chức năng di truyền trong việc giảm thiểu tác hại của ion Na+ ở cây con của Oryza sativa và Oryza glaberrima (Mickelbart et al., 2015).
Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa
Auxin nội sinh đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển bộ rễ lúa và cây trồng Việc xử lý auxin ngoại sinh có thể kích thích sự hình thành rễ phụ và rễ bên Nhiều gen liên quan đến đường truyền tín hiệu auxin ảnh hưởng đến quá trình phát triển bộ rễ Protein thuộc họ PIN, đặc biệt là PIN1, chịu trách nhiệm cho sự tích lũy và vận chuyển auxin trong cây, với gen CRL4 (OsGNOM1) kích hoạt hoạt động của nó CRL4 giúp duy trì gradient auxin cần thiết ở phần gốc thân cây, hỗ trợ hình thành rễ phụ Gen OsGNOM1 tương đồng với GNOM1 ở Arabidopsis, điều chỉnh protein PIN1 để vận chuyển auxin phân cực, từ đó thúc đẩy sự phân chia tế bào nhu mô và phát triển mô phân sinh rễ phụ.
Hình 2.7 Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa
In rice plants, the signaling activity of auxin to auxin-responsive genes is regulated by the interaction between two protein families: AUX/IAA (Auxin/Indole-3-acetic Acid) and ARF (Auxin Response Factor).
Khi nồng độ auxin nội sinh thấp, protein AUX/IAA liên kết với các gen ARF, ức chế sự biểu hiện của chúng Ngược lại, khi nồng độ auxin tăng cao, tín hiệu auxin kích thích sự phân hủy protein AUX/IAA, từ đó kích hoạt gen sinh tổng hợp protein ARF.
Các protein ARF đóng vai trò là yếu tố kích hoạt quá trình phiên mã trong đường truyền tín hiệu auxin bằng cách gắn vào vùng cảm ứng auxin trên promoter của các gen liên quan, từ đó thúc đẩy biểu hiện của những gen này trong mạng lưới điều hòa sự hình thành rễ phụ và rễ bên ở cây lúa Ngoài ra, đã phát hiện 31 gen tương đồng mã hóa họ protein AUX/IAA trên cây lúa.
Nghiên cứu chỉ ra rằng ARF1 gắn vào vùng cảm ứng auxin AuxRE2 trên trình tự promoter của gen crl1 (Crown rootless 1), từ đó điều hòa biểu hiện của gen này (Inukai et al., 2005) Gen crl1 mã hóa yếu tố phiên mã LBD/LOB, và việc đột biến điểm trên gen crl1 ở giống lúa Taichung65 đã được thực hiện bởi Inukai.
Y et al (2005) đã tạo được thể đột biến crl1 không có sự hình thành rễ phụ Kết quả đánh giá chỉ cho thấy gene crl1 đáp ứng rất sớm với auxin và tại vị trí gốc thân cây lúa crl1 cũng biểu hiện ở vùng trả lời tín hiệu của auxin (Inukai et al., 2005)
Nhóm nghiên cứu của Liu H et al (2005) đã phát triển một thể đột biến soma arl1 với đoạn gen ARL1 bị mất 20 bp, dẫn đến việc hoàn toàn không có sự phát sinh rễ phụ Gen ARL1, mã hóa cho một protein thuộc họ LOB, được biểu hiện trong các mô phân sinh rễ phụ, rễ bên, mô phân sinh chồi và mô mạch dẫn ARL1 phản ứng với auxin, với cơ chế biểu hiện tương đồng với sự phân bố của auxin trong rễ Mặc dù hai gen crl1 và ARL1 được công bố tại hai thời điểm khác nhau, nhưng chúng thực chất là cùng một gene.
Nghiên cứu của Coudert J et al (2011) chỉ ra rằng gen crl1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa mạng lưới gen liên quan đến sự hình thành rễ phụ Qua phân tích biểu hiện gen ở cây lúa đột biến crl1 và cây wildtype Taichung65 bằng phương pháp Affymetrix microarray, nhóm nghiên cứu đã phát hiện 250 gen, trong đó 236 gen được điều hòa xuôi và ngược ở cây crl1 đột biến Để xác định các gen cảm ứng sớm với auxin, mức độ biểu hiện của một bộ gen đã được đánh giá tại các thời điểm khác nhau sau khi xử lý với auxin ngoại sinh Kết quả cho thấy phần lớn các gen liên quan đến hormone, nước và dinh dưỡng không bị điều hòa trực tiếp bởi gen crl1 khi không có sự hình thành rễ phụ Đặc biệt, ba gen phản ứng với auxin phụ thuộc vào crl1 gồm FSM/FAS1, GTE4 và MAP protein liên kết với vi ống, trong đó FSM/FAS1 và GTE4 đã được xác định có liên quan đến sự duy trì mô phân sinh rễ ở lúa và Arabidopsis thông qua quá trình tái sắp xếp chất nhiễm sắc và điều hòa chu kỳ tế bào.
Hình 2.8 Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1
Coudert J et al (2015) đã nghiên cứu việc khôi phục biểu hiện gen crl1 trong thể đột biến bằng cách chuyển gen crl1 dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng với DEX vào cây crl1 Họ đã tách chiết mRNA trước khi xử lý, 4h và 8h sau khi xử lý với DEX để phân tích transcriptome Kết quả cho thấy crl1 điều hòa tăng cường biểu hiện của 277 gen, bao gồm những gen quan trọng liên quan đến sự phân chia mô phân sinh, phản phân hóa tế bào và cân bằng hormone Nhóm nghiên cứu đã chọn 13 gen có mức độ biểu hiện mạnh để nghiên cứu chức năng liên quan đến sự hình thành rễ phụ, ký hiệu từ CR1 đến CR13, trong đó gen CR7 mã hóa cho yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là các dòng lúa chuyển gen được cung cấp bởi phòng thí nghiệm liên kết Việt-Pháp (LMI RICE-2), Viện Di truyền Nông nghiệp, gồm:
Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào giống Taichung65 (TC65) và thể đột biến (crl1) ở các thế hệ T0, T1, T2 có cấu trúc gen chuyển bao gồm phần cds (coding sequence) của gen CR7, được điều khiển bởi promoter Ubiquitin, ký hiệu là pUBi::cdsCR7.
- Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65.
Dạng đột biến crl1, được phát triển từ giống lúa TC65, có hình thái thân lá bình thường nhưng giảm tính hướng trọng lực Bộ rễ của dạng đột biến này chỉ bao gồm một rễ chính từ phôi hạt, và từ tuần thứ 3 trở đi, có thể hình thành thêm một vài rễ phụ.
Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng
A Cây lúa Taichung65 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm có nhiều rễ phụ ở bộ rễ
B Cây lúa crl1 giai đoạn 1 tuần tuổi với đặc điểm chỉ có 1 rễ chính
3.1.2 Mồi và các vật tư khác Để PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen chuyển trong các dòng lúa
Để đánh giá sự biểu hiện của gen CR7 trong các dòng chuyển gen, phương pháp qPCR được áp dụng với cặp mồi thiết kế sao cho mồi xuôi bắc qua intron và nằm trên vùng ORF của gen CR7, trong khi mồi còn lại nằm sau mã kết thúc TAG trên trình tự 3’UTR Biểu hiện của gen actin được sử dụng làm tham chiếu.
Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Gen nghiên cứu Tên mồi Kích thước khuếch đại Nhiệt độ gắn mồi
Gen chọn lọc thực vật HPT
Để thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử, cần chuẩn bị các vật tư và dụng cụ thiết yếu như máy PCR, máy RT-PCR, máy li tâm, máy điện di, máy soi UV, và máy cắt tiêu bản vibratome Bên cạnh đó, các hóa chất cần thiết cho quá trình tách chiết DNA, RNA, PCR, cDNA, qPCR và nhuộm GUS cũng không thể thiếu.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu hoạt động của promoter CR7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa
- Chọn lọc những dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen proCR7::GUS dựa trên mức độ phân ly di truyền
- Chọn lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc promoter CR7
- Đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị GUS
3.2.2 Nghiên cứu vai trò của gen CR7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa
- Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR
- Sàng lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen pUBi::cdsCR7 thông qua sự phân ly di truyền
- Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen pUBi::cdsCR7.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 10 năm 2017 tại Phòng thí nghiệm liên kết quốc tế “Nghiên cứu chức năng gen, công nghệ sinh học thực vật và sự tương tác với vi sinh vật” (LMI RICE-2), thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Bắc Từ Liêm, Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chọn lọc dòng lúa T0 siêu biểu hiện gen CR7 bằng kỹ thuật qPCR 3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu tách chiết RNA
Mẫu lá khoảng 500 mg từ các dòng lúa chuyển gen pUBi::cdsCR7 và đối chứng (không chuyển gen) được thu thập từ cây T0 đã được đánh dấu Các mẫu này được gói trong giấy bạc, ghi nhãn và nhanh chóng bảo quản trong nitơ lỏng Mẫu lá có thể được sử dụng ngay lập tức hoặc được lưu trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -80°C.
3.4.1.2 Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ lá non của cây lúa 2 tuần tuổi bằng phương pháp Trizol LS, sử dụng các hóa chất như Trizol LS Reagent, isopropanol, chloroform, ethanol và nước Mili-Q Quy trình tách chiết được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả.
1 Nghiền mịn 500 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối sứ Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml đã được làm lạnh
2 Thêm 1,2 ml Trizol LS cho vào mỗi ống, sau đó vortex mạnh
3 Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút
4 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 10 phút, sau khi ly tâm xong, hút hết dịch nổi sang ống mới
5 Thờm 320 àl chloroform, sau đú lắc mạnh trong vũng 30 giõy
6 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút
7 Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 4 0 C trong 15 phút
8 Nhẹ nhàng hút hết dịch nổi phía trên sang ống 1,5 ml mới Bổ sung 0,75 ml isopropanol lạnh, đảo nhẹ nhàng để dịch được trộn đều
9 Ủ 30 phút ở -20 0 C (hoặc ủ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng) Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0 C, loại bỏ dịch để thu phần kết tủa
10 Bổ sung 1.2 ml ethanol 75%, vortex nhẹ
11 Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút ở 4 0 C Sau đó loại bỏ ethanol để thu phần kết tủa
12 Hũa tan RNA bằng 50 àl nước Mili-Q, li tõm xuống đỏy rồi cho ngay vào đá Giữ RNA ở -20 0 C (nếu dùng luôn) hoặc -80 0 C (nếu muốn bảo quản trong thời gian dài)
RNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% với dòng điện 80V trong 30 phút Sau đó, sử dụng máy chụp gel để kiểm tra số lượng và chất lượng của RNA đã tách chiết Tiếp theo là quá trình tổng hợp cDNA.
RNA sau khi tách chiết được xử lý bằng DNase I ở 37°C trong 10 phút để loại bỏ DNA Sau khi xử lý, các mẫu RNA sẽ trải qua phản ứng phiên mã ngược nhằm tổng hợp các sợi đôi cDNA Mỗi mẫu sẽ được sử dụng cho quy trình này.
Để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA, cần sử dụng 4 àg RNA tổng số cho một phản ứng có thể tích 20 àl Thành phần phản ứng bao gồm 4 àl 5X Reaction buffer, 2 àl Maxima enzym và H2O Quy trình nhiệt cho phản ứng được thực hiện như sau: ủ ở 25°C trong 10 phút, sau đó sao chép ngược ở 50°C trong 54 phút và cuối cùng kết thúc phản ứng ở 85°C trong 10 phút Sau khi hoàn thành, hỗn hợp được pha loãng xuống nồng độ 0,05 àg/àl.
Sau khi thực hiện phiên mã ngược, RNA được chuyển đổi thành cDNA và sản phẩm này được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen actin, nhằm xác định sự hiện diện của cDNA Gen actin, mã hóa cho protein actin, là một thành phần quan trọng của bộ khung xương tế bào và có mức độ biểu hiện cao Cặp mồi được thiết kế để nhận diện cDNA của gen actin với kích thước 212 bp, đồng thời giúp phát hiện sự hiện diện của genomic DNA thông qua sản phẩm khuếch đại có kích thước 369 bp.
Để thực hiện phản ứng qPCR với nồng độ 0,02 àg RNA/àl, cần chuẩn bị các thành phần sau: 5 àl GoTaq đ Green Master Mix, 0,4 àl Primers mix (2 àmol/àl), 0,6 àl H2O và 4 àl cDNA Phản ứng qPCR sẽ được thực hiện theo chu kỳ nhiệt đã định.
95 0 C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 95 0 C - 2 phút, 55 0 C - 1 phút, 72 0 C - 1 phút;
72 0 C trong 5 phút, hóa chất phát huỳnh quang là SYBR Kết quả phân tích được đọc trên máy vi tính và xử lý bằng phần mềm Excel 2013.
3.4.2 Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ T1, T2 3.4.2.1 Chọn lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen biến nạp
Để chọn các dòng lúa mang gen biến nạp, các dòng lúa chuyển gen ở thế hệ T1 được phân tích Mỗi cấu trúc gen được chọn từ 3-5 dòng chuyển gen T0 để thực hiện phân tích sự phân ly di truyền bằng phương pháp PCR Mỗi dòng chuyển gen được gieo từ 15-20 hạt in vitro trong môi trường 1/2MS Sau một tuần, mẫu lá được cắt để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phân tích PCR Kết quả PCR được sử dụng để đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền của gen biến nạp theo phương pháp phân phối Khi bình phương (χ²) Các cây dương tính T1 với tỷ lệ phân ly 3:1 được trồng riêng trong từng chậu trong nhà lưới để thu hạt cho các nghiên cứu tiếp theo Hạt từ cây T1 nảy mầm trong ống nghiệm sẽ phát triển thành cây T2, và các cây T2 này sẽ tiếp tục được đánh giá.
Hạt được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS với thành phần như trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ
Vitamin MS (100X) 100X 5 ml Đường sucrose - 30 g
- Hạt thóc được bóc vỏ, sau đó khử trùng:
+ Lắc trong dung dịch ethanol 70% trong 1 phút
+ Ngâm 20 phút trong dung dịch nước Javen (NaClO) 3,8%
+ Rửa thật kỹ 6 lần bằng nước cất khử trùng
Sau khi khử trùng hạt, cấy hạt vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng và đặt trong phòng nuôi cây với chế độ ánh sáng 12 giờ sáng và 12 giờ tối Nhiệt độ phòng duy trì ở 28 độ C trong khoảng thời gian từ 7 đến 10 ngày.
Tách chiết DNA từ lá lúa
DNA tổng số từ lá cây lúa chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Xin Xu et al (2005) có cải tiến
- 100 ml Dung dịch I gồm: 10g sodium lauryl sarcosine và 100 ml SDS 10%
- 100 ml Dung dịch II gồm: 2 g CTAB, 10 ml 1M Tris-HCl pH 8,0, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 và 28 ml 5M NaCl
- Dung dịch đệm tách chiết được pha trước khi tiến hành tách chiết theo tỷ lệ 13 Dung dịch I : 7 Dung dịch II
- Cắt 1 đoạn lá khoảng 5 cm cây lúa 7-10 ngày tuổi được nảy mầm trong ống nghiệm
Cắt nhỏ đoạn lá lúa và cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm một bi nghiền vào mỗi ống Ngâm ống trong nitơ lỏng khoảng 5 phút trước khi nghiền mẫu bằng máy lắc.
- Bổ sung 150 àl dung dịch đệm tỏch chiết, đảo đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 65 0 C trong 30 phút
- Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1.660 g (~ 4.200 rpm) trong 10 phút
- Bổ sung 20 àl chloroform và lắc nhẹ trong 10 giõy, sau đú bổ sung 20 àl 5M kali axetat và lắc nhẹ trong 10 giây
- Ly tâm 1.660 g ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
- Cẩn thận hỳt 100 àl lớp dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới
- Bổ sung 100 àl isopropanol lạnh, đảo đầu ống vài lần Làm lạnh 30 phỳt ở -20 0 C
- Ly tâm 3.000 g (~ 5.700 rpm) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dịch lỏng, rửa tủa DNA bằng 200 ml ethanol 70% 2 lần Mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 3.000g trong 5 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
- Làm khụ tủa DNA và hũa tan bằng 50 àl nước Milli-Q hoặc TE cú bổ sung 20 àg/ml RNAase Ủ 30 phỳt ở nhiệt độ 37 0 C
- Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 30 phút Phương pháp PCR kiểm tra dòng chuyển gen
Phương pháp PCR được áp dụng để xác định sự hiện diện của cấu trúc gen chuyển mục tiêu pUbi::cdsCR7 hoặc proCR7::GUS trong các dòng lúa chuyển gen, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu CR7-R/FBUBI, R7-P-F/pcGUS-R và hpt-pc-F/hpt-pc-R.
Thành phần và chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR 20 àl thể hiện lần lượt ở bảng 3.3 và 3.4
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch 1 phản ứng (àl)
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
3.4.2.2 Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen biến nạp
Sau khi chọn lọc các dòng chuyển gen T1 với một bản sao cấu trúc gen biến nạp, chúng tôi tiếp tục sàng lọc ở thế hệ T2 để xác định ít nhất 2 dòng đồng hợp tử độc lập dựa trên mức độ phân ly di truyền Các dòng chuyển gen T2 đồng hợp tử đạt yêu cầu khi 100% số cây kiểm tra mang cấu trúc gen biến nạp Để đơn giản hóa quy trình, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn lọc cây mang gen bằng kháng sinh chọn lọc thực vật hoặc phương pháp nhuộm X-gluc đối với promoter CR7.
- Với mỗi dòng kiểm tra đem gieo 20-30 hạt trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS
- Sau 3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung 50 mg/l hygromycin
- Sau 10 ngày tiến hành đếm số cây kháng (cây sống) và không kháng kháng sinh (cây chết) Tính tỷ lệ cây kháng kháng sinh
3.4.2.3 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 35 phút
Hóa chất sử dụng: agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0.5X; ethidium bromide nồng độ 0,5 àg/ml (EtBr)
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 1 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-
Ở nhiệt độ 60 độ C, cho dung dịch vào khay điện di đã lắp răng lược, đảm bảo ngập khoảng 2/3 chiều dài răng lược Sau đó, để gel đông cứng, rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, tiếp theo đổ dung dịch TAE ngập bản gel.
- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với ladder 1 kb để kiểm tra kích thước
Nhuộm bản gel là quy trình ngâm bản gel trong dung dịch nước có chứa EtBr khoảng 20-30 phút Sau đó, bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, và hình ảnh được chụp bằng máy soi gel.
3.4.3 Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen CR7