Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Đối tượng - vật liệu nghiên cứu
Cây lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)
Protocorm, chồi của cây Hoàng thảo Kim Điệp
Các mồi sử dụng trong chỉ thị phân tử RAPD
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide sau các lần cấy chuyển Ở đề tài trước đã tiến hành nghiên cứu tạo đột biến Hoàng thảo Kim Điệp bằng protocorm và đã theo dõi sinh trưởng và tỷ lệ tạo biến dị ở lần cấy chuyển thứ 1, 2 Do vậy, ở đề tài này chúng tôi tiếp tục theo dõi và đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide ở các lần cấy chuyển 3, 4, 5, 6
3.4.1.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide với các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6
Môi trường MS + 30 g/l sacarose + 8 g/l agar pH: 5,8
Thời gian xử lý đột biến: 30 phút
Sau khi xử lý đột biến, mẫu cấy sẽ được chuyển tiếp liên tục, với tần suất 4 tuần một lần trong tổng số 6 lần cấy chuyển, trên môi trường MS cơ bản để quan sát và lựa chọn các cá thể biến dị.
3.4.1.2 Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide tại các thời gian khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6
Môi trường MS + 30 g/l sacarose + 8 g/l agar pH: 5,8
Nồng độ sodium azide xử lý đột biến: 0,5 mM
Sau khi xử lý đột biến, mẫu cấy được chuyển tiếp 6 lần, với tần suất 4 tuần một lần, trên môi trường MS cơ bản để quan sát và lựa chọn các cá thể biến dị.
3.4.2 Nhân dòng cho các cá thể đột biến sau chọn lọc
3.4.2.1 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
3.4.2.2 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
3.4.2.3 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l
BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
3.4.2.4 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS +
3 mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
3.4.3 Đánh giá sự sai khác di truyền của dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến
Các dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến giả định sẽ được đánh giá sự sai khác di truyền bằng kỹ thuật phân tử RAPD
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản
MS (Murshige & Skoog, 1962) với 8 g/l agar, 30 g/l saccarose
Các thí nghiệm được nuôi cấy trong bình trụ Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh độ pH bằng 5,75 - 5,80 trước khi được khử trùng ở
121 0 C, 1 atm trong 20 phút Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày 3.5.2 Phương pháp xử lý đột biến
Hạt lan Hoàng thảo Kim Điệp sau 8 tuần nuôi cấy in vitro sẽ phát triển thành protocorm Các protocorm này sau đó sẽ được ngâm trong dung dịch sodium azide với các công thức khác nhau để nghiên cứu và phát triển.
Sodium azide được pha theo các công thức thí nghiệm trong box cấy
Sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản
3.5.3 Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết theo kit DNeasy plant mini kit
3.5.4 Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD
Phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên được tiến hành với tổng thể tớch là 10 àl/1 mẫu gồm những thành phần trong bảng
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần
H 2 O 2x PCR Master mix Primer 10pM DNA
Chu trình phản ứng PCR gồm 95 0 C trong 3 phút, sau đó là 35 chu trình gồm 95 0 C trong 45 giây, 34 0 C trong 45 giây, 72 0 C trong 2 phút, 72 0 C trong 7 phút và duy trì ở 4 0 C
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium Bromide sau đó quan sát dưới tia UV
+ Tỷ lệ tạo chồi (%) = Σ số chồi tạo thành sau cấy + Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ số chồi đưa vào trong 1 lần + Tỷ lệ hình thành rễ (%) =
+ Số rễ (rễ/mẫu) = Σ độ dài rễ + Chiều dài rễ (cm) = Σ số cây theo dõi Σ tổng số chồi dị dạng x 100 + Tỷ lệ chồi dị dạng (%) = Σsốchồitheodõi
Dữ liệu về các chỉ tiêu theo dõi đã được xử lý bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL và SAS 9.1 Tất cả các kết quả tính toán trong bài viết đều được làm tròn đến 2 chữ số thập phân.
Các số liệu phân tích sự khác biệt di truyền được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.2 (Rohlf, 2008) Phương pháp UPGMA được sử dụng để tính toán ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu dựa trên mức độ di truyền Kết quả được trình bày dưới dạng sơ đồ cây trong TREE DISPLAY.