(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger

THỰC NGHIỆM

VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập 26 mẫu đất và trầm tích từ nhiều địa điểm khác nhau tại rừng ngập mặn xã Phù Long, Hải Phòng, cũng như trong vườn quốc gia Cát Bà.

- Hải Phòng, suối Yến - chùa Hương - Hà Nội và vườn quốc gia Cúc Phương

Ninh Bình là địa điểm lấy mẫu với tọa độ được ghi nhận qua máy định vị GPS Các thông số như nhiệt độ, độ ẩm và độ mặn được đo bằng thiết bị chuyên dụng Mẫu vật được bảo quản riêng lẻ trong ống falcon 50 ml đã được khử trùng và được giữ lạnh trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Quy trình phân lập mẫu bắt đầu bằng việc để khô tự nhiên trong 2-3 ngày và nghiền nhỏ Sau đó, lấy 1 gam của mỗi mẫu và pha loãng đến nồng độ 10^-3 và 10^-4 Cuối cùng, trải hỗn hợp lên đĩa Petri với hai môi trường khác nhau là NaST21 (dung dịch A).

Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật, cần sử dụng 750 ml nước biển khử trùng, 1g K2HPO4 và 16g Bactogar cho dung dịch A; dung dịch B bao gồm 250 ml nước biển khử trùng, 1g KNO3, 1g MgSO4, 1g CaCl2.2H2O, 0,2g FeCl3 và 0,1g MgSO4.7H2O Đồng thời, bổ sung các thành phần HV như 1g acid humic, 0,02g CaCO3, 0,01g FeSO4.7H2O, 1,7g KCl, 0,05g MgSO4.7H2O, 0,5g Na2HPO4, 5ml vitamin nhóm B, 16g Agar và 1l nước cất, điều chỉnh pH về 7 Cả hai môi trường này đều được thêm 20mg/l nalidixic acid và 50mg/l cycloheximide Đĩa phân lập được ủ trong điều kiện 28-30°C trong khoảng thời gian từ 14 đến 21 ngày, sau đó các khuẩn lạc có hình thái khác nhau sẽ được chuyển sang môi trường mới.

YS (Cao nấm men 2g, tinh bột 10g, nước cất 1l) và giữ ở lạnh sâu -80°C

Phân loại các chủng XK dựa trên hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào từ được thực hiện bằng cách quan sát hình thái và màu sắc khuẩn lạc sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường YS ở 28℃ Đồng thời, hình thái chuỗi bào tử được kiểm tra dưới kính hiển vi trên các lamen cắm trên đĩa nuôi cấy.

Phân loại dựa vào trình tự 16S rDNA: Đoạn gen 16S rDNA được khuếch đại bằng PCR từ DNA tổng số với cặp mồi 27F (5'-

GGTTACCTTGTTACGACTT-3) Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra trên gel 1% agarose được tinh sạch bằng PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn

Quốc) và đọc trình tự Trình tự của đoạn 16S rDNA được sử dụng để tìm loài gần gũi nhất bằng công cụ EZ Taxon

Sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như: n-hexane,

Dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol, and water were utilized in thin-layer chromatography (TLC) conducted on silica gel plates (Merk 60 F254) Column chromatography was performed using silica gel with a particle size of 40-63 μm and Sephadex LH-20 (Aldrich) The TLC was visualized using vanillin/H2SO4 reagent, heated at 80-100 °C, and Dragendorff reagent.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi nhận trên máy Bruker Avance với tần số 400 MHz và 500 MHz, sử dụng TMS làm chất chuẩn nội Đồng thời, phổ khối lượng (ESI-MS) được đo bằng máy sắc ký lỏng ghép khối phổ Agilent series 1100 với đầu dò MSD và đầu dò DAD.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn Định danh các chủng xạ khuẩn được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và lên men sinh khối chủng xạ khuẩn được thực hiện bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQG Hà Nội

Tiến hành ly tâm dịch sinh khối xạ khuẩn để tách phần nước và cặn tế bào Phần dịch nước được chiết xuất bằng ethyl acetate, sau đó cô quay dung môi để thu được cặn chiết EtOAc Phần nước còn lại sau khi chiết với ethyl acetate cũng được cô quay để thu cặn chiết nước Cặn tế bào sau ly tâm được ngâm chiết với MeOH hoặc hỗn hợp MeOH/H2O, sau đó cất loại dung môi để thu được cặn chiết nội bào.

- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1.05715), RP-18 F254S (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

27 H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Hình 2 1: Sơ đồ phân lập các chất từ các dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces alboniger

Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là Silicagel với hai loại pha: pha thường và pha đảo Silicagel pha thường có kích thước hạt từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Trong khi đó, pha đảo RP-18 (30-50 àm) được cung cấp bởi Fuji Silysia Chemical Ltd Bên cạnh đó, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 từ Mitsubishi Chem Ind Co., Ltd cũng được sử dụng trong quá trình này.

Sau khi nhân giống chủng xạ khuẩn VH19-A121 (55 L), dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút và nhiệt độ phòng Quá trình này tách riêng dịch nước và cặn tế bào, trong đó phần dịch nước (40 L) được chiết xuất bằng EtOAc.

(3 x 4h x 20 L) thu được dịch chiết EtOAC Gộp các dịch chiết EtOAc và cất loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc ký hiệu là 121E (6,2 g)

Phần dịch nước còn lại sau khi chiết với EtOAc được cô quay thu được cặn nước ký hiệu là 121CN (10,2 g)

Phần cặn tế bào được ngâm chiết trong methanol/nước theo tỉ lệ 9:1 (3 x 4h x

Sau khi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút và nhiệt độ phòng để loại bỏ cặn, dịch chiết thu được sẽ được cất để loại bỏ dung môi Kết quả thu được là cặn chiết methanol có ký hiệu 121X với khối lượng 7,0g.

Cặn chiết EtOAC 121E (6,2 g) được đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải 100% methanol thu được 5 phân đoạn (121E.1 - 121E.5)

Phân đoạn 121E.2 (30 g) được tiến hành chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 /Axeton (9:1 đến 8:2) thu được chất sạch VTBE.01 (3,7 mg)

Khảo sát cặn nước 121CN và cặn chiết methanol 121X bằng sắc ký bản mỏng cho thấy sự tương đồng giữa hai cặn chiết này Sau khi gộp, thu được 17,2 gam cặn chiết ký hiệu 121CN Cặn chiết 121CN (17,2 g) được xử lý bằng cột sephadex LH-20 với dung môi methanol và nước (tỉ lệ 9:1), tạo ra 8 phân đoạn từ 121CN1 đến 121CN8 Phân đoạn 121CN5 (521 mg) tiếp tục được chạy sắc ký cột sephadex LH-20 với cùng dung môi, dẫn đến 5 phân đoạn mới (121CN.5.1 đến 121CN.5.5) Cuối cùng, phân đoạn 121CN5.5 (101 mg) được tinh chế thêm bằng sắc ký cột sephadex LH-20, thu được 3 phân đoạn mới.

29 121CN5.4.3) Phân đoạn 121CN5.4.2 (32 mg) được tinh chế lần nữa trên cột sephadex LH-20 (100% methanol) thu được chất sạch 121CN.02 (5,6 mg)

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thường bao gồm việc kết hợp các thông số vật lý với các kỹ thuật phổ hiện đại.

Phổ khối lượng phun mù điện ESI-MS được đo trên máy Agilent 1260 của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ NMR được thực hiện trên máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY và NOESY

Các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm DMSO-d 6, CD3OD, CDCl3 và pyridine-d 5 Việc chọn lựa dung môi phù hợp phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, với nguyên tắc là dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi sinh vật (VSV) được kiểm định thông qua phương pháp pha loãng đa nồng độ Phương pháp này giúp đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu đối với vi sinh vật và nấm, từ đó xác định tính kháng khuẩn mạnh hay yếu.

30 thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minium inhibitor concentration – nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration

Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử dựa trên các chỉ số như MIC (nồng độ nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) và IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật) Quá trình này được thực hiện bằng cách đo độ đục (turbidity) của môi trường nuôi cấy tế bào, từ đó xác định mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu.

Mẫu thụ cú MIC ≤ 200àg/ml; chất sạch cú MIC ≤50 àg/ml được đỏnh giá là có hoạt tính

 Các chủng VSV kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:

- Bacillus subtilis: trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn

Pseudomonas aeruginosa là một loại vi khuẩn gram âm, thường được gọi là trực khuẩn mủ xanh Loại vi khuẩn này có khả năng gây ra nhiều loại nhiễm trùng nghiêm trọng, bao gồm nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng da và niêm mạc, viêm đường tiết niệu, viêm màng não, viêm màng trong tim, và viêm ruột.

- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật

MHB (Mueller-Hinton Broth) and MHA (Mueller-Hinton Agar) are commonly used media for bacterial cultures, while TSB (Tryptic Soy Broth) and TSA (Tryptic Soy Agar) serve similar purposes For yeast cultivation, SDB (Sabouraud-2% Dextrose Broth) and SA (Sabouraud-4% Dextrose Agar) are the preferred options.

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng để tạo thành năm nồng độ khác nhau, phục vụ cho mục đích thử nghiệm Nồng độ cao nhất của dịch chiết đạt 256 µg/ml, trong khi nồng độ cao nhất của chất tinh khiết là 128 µg/ml.

Lấy 10  l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm

200  l dung dịch VSV kiểm định có nồng độ 5.10 5 CFU/ml, ủ ở 37 o C/24h

- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của VSV

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data

- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của Mycobacterium smegmatis được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán KS trên đĩa thạch Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch YS trong 7 ngày ở nhiệt độ 30°C.

KCTC 9108 được nuôi trên môi trường 219 lỏng (g/L: pepton – 10, cao nấm men – 5, cao malt – 5, casamino acid – 5, cao bò – 2, glycerol – 2, tween 80 –