THỰC NGHIỆM
VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập 26 mẫu đất và trầm tích từ nhiều địa điểm khác nhau tại rừng ngập mặn xã Phù Long, Hải Phòng, cũng như trong vườn quốc gia Cát Bà.
- Hải Phòng, suối Yến - chùa Hương - Hà Nội và vườn quốc gia Cúc Phương
Ninh Bình là địa điểm khảo sát với tọa độ mẫu được ghi nhận qua máy định vị GPS Ngoài ra, các thông số như nhiệt độ, độ ẩm và độ mặn được đo bằng thiết bị chuyên dụng Các mẫu nước được lưu trữ riêng lẻ trong ống falcon 50 ml đã được khử trùng và được bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Quy trình phân lập mẫu bắt đầu bằng việc để mẫu khô tự nhiên trong 2-3 ngày và sau đó nghiền nhỏ Tiếp theo, lấy 1 gam từ mỗi mẫu và pha loãng tới nồng độ 10^-3 và 10^-4 Cuối cùng, trải hỗn hợp lên đĩa Petri chứa hai môi trường khác nhau, trong đó có môi trường NaST21.
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh, cần sử dụng 750 ml nước biển khử trùng, 1g K2HPO4, và 16g Bactogar cho dung dịch A; dung dịch B bao gồm 250 ml nước biển khử trùng, 1g KNO3, 1g MgSO4, 1g CaCl2.2H2O, 0,2g FeCl3, và 0,1g MgSO4.7H2O Thêm vào đó, hỗn hợp HV cần có 1g acid humic, 0,02g CaCO3, 0,01g FeSO4.7H2O, 1,7g KCl, 0,05g MgSO4.7H2O, 0,5g Na2HPO4, 5ml vitamin nhóm B, 16g Agar, và 1 lít nước cất với pH 7 Cả hai môi trường này được bổ sung nalidixic acid 20mg/l và cycloheximide 50 mg/l Đĩa phân lập cần được ủ ở nhiệt độ 28-30°C trong khoảng 14 đến 21 ngày, sau đó các khuẩn lạc có hình thái khác nhau sẽ được chuyển sang môi trường thích hợp.
YS (Cao nấm men 2g, tinh bột 10g, nước cất 1l) và giữ ở lạnh sâu -80°C
Phân loại vi sinh vật dựa trên hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào từ được thực hiện bằng cách quan sát hình thái và màu sắc khuẩn lạc của các chủng XK sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường YS ở nhiệt độ 28℃ Ngoài ra, hình thái chuỗi bào tử được kiểm tra dưới kính hiển vi trên các lamen được đặt trên đĩa nuôi cấy.
Phân loại dựa vào trình tự 16S rDNA: Đoạn gen 16S rDNA được khuếch đại bằng PCR từ DNA tổng số với cặp mồi 27F (5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3) Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra trên gel 1% agarose được tinh sạch bằng PCR Purification Kit (Bioneer, Hàn
Quốc) và đọc trình tự Trình tự của đoạn 16S rDNA được sử dụng để tìm loài gần gũi nhất bằng công cụ EZ Taxon
Sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như: n-hexane,
Dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol, and water were utilized in thin-layer chromatography (TLC) conducted on silica gel Merk 60 F254 plates Column chromatography was performed using silica gel with a particle size of 40-63 μm and Sephadex LH-20 from Aldrich The TLC results were visualized using vanillin/H2SO4 reagent, heated at 80-100 °C, and Dragendorff reagent.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi lại trên máy Bruker Avance với tần số 400 MHz và 500 MHz, sử dụng TMS làm chất chuẩn nội Đồng thời, phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ Agilent series 1100 với đầu dò DAD.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn Định danh các chủng xạ khuẩn được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và lên men sinh khối chủng xạ khuẩn được thực hiện bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQG Hà Nội
Tiến hành ly tâm dịch sinh khối xạ khuẩn để tách nước và cặn tế bào Phần dịch nước được chiết xuất bằng ethyl acetate, sau đó cô quay để thu cặn chiết EtOAc Phần nước còn lại sau chiết xuất tiếp tục được cô quay để thu cặn chiết nước Cặn tế bào thu được từ quá trình ly tâm được ngâm chiết với MeOH hoặc hỗn hợp MeOH/H2O, và sau khi cất loại dung môi, thu được cặn chiết nội bào.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60 F254 (Merck 1.05715), RP-18 F254S (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu
Hình 2 1: Sơ đồ phân lập các chất từ các dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces alboniger
Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ silicagel pha thường và pha đảo, với kích thước hạt silicagel pha thường từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Pha đảo RP-18 được cung cấp bởi Fuji Silysia Chemical Ltd., trong khi nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 đến từ Mitsubishi Chem Ind Co., Ltd.
Sau khi nhân giống chủng xạ khuẩn VH19-A121 (55 L), dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút tại nhiệt độ phòng Quá trình này giúp tách riêng dịch nước và cặn tế bào, trong đó phần dịch nước (40 L) được chiết xuất bằng EtOAc.
(3 x 4h x 20 L) thu được dịch chiết EtOAC Gộp các dịch chiết EtOAc và cất loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc ký hiệu là 121E (6,2 g)
Phần dịch nước còn lại sau khi chiết với EtOAc được cô quay thu được cặn nước ký hiệu là 121CN (10,2 g)
Phần cặn tế bào được ngâm chiết trong methanol/nước theo tỉ lệ 9:1 (3 x 4h x
Sau khi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút và nhiệt độ phòng, cặn được loại bỏ Dịch chiết thu được sau đó được cất để tách dung môi, tạo ra cặn chiết methanol ký hiệu 121X với trọng lượng 7,0g.
Cặn chiết EtOAC 121E (6,2 g) được đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải 100% methanol thu được 5 phân đoạn (121E.1 - 121E.5)
Phân đoạn 121E.2 (30 g) được tiến hành chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 /Axeton (9:1 đến 8:2) thu được chất sạch VTBE.01 (3,7 mg)
Khảo sát cặn nước 121CN và cặn chiết methanol 121X bằng sắc ký bản mỏng cho thấy sự tương đồng giữa hai cặn chiết Gộp hai cặn chiết này, ta thu được 17,2 gam (ký hiệu là 121CN) Cặn chiết 121CN (17,2 g) được xử lý trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol : nước (9:1), tạo ra 8 phân đoạn (121CN1 đến 121CN8) Phân đoạn 121CN5 (521 mg) tiếp tục được chạy sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi methanol/nước (9:1), cho ra 5 phân đoạn (121CN.5.1 đến 121CN.5.5) Cuối cùng, phân đoạn 121CN5.5 (101 mg) được tinh chế thêm bằng sắc ký cột sephadex LH-20 (methanol/nước 9:1), tạo ra 3 phân đoạn (121CN5.4.1-).
121CN5.4.3) Phân đoạn 121CN5.4.2 (32 mg) được tinh chế lần nữa trên cột sephadex LH-20 (100% methanol) thu được chất sạch 121CN.02 (5,6 mg)
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất
Phương pháp xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thường kết hợp các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại.
Phổ khối lượng phun mù điện ESI-MS được đo trên máy Agilent 1260 của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ NMR được thu thập bằng máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY và NOESY
Các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm DMSO-d 6, CD3OD, CDCl3 và pyridine-d 5 Việc lựa chọn dung môi phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của từng mẫu, với nguyên tắc chính là dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu thử.
2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào
2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng vi sinh vật (VSV) được kiểm định thông qua phương pháp pha loãng đa nồng độ, giúp đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu thử Phương pháp này xác định các giá trị hoạt tính như MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và IC50 (nồng độ ức chế 50%), từ đó phân loại khả năng kháng khuẩn mạnh hay yếu của mẫu.
Phương pháp đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu thử bao gồm việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) và nồng độ ức chế 50% (IC50) Các giá trị này được đo bằng cách quan sát độ đục (turbidity) của môi trường nuôi cấy tế bào sinh vật, giúp xác định khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật (VSV) trong các mẫu thử.
Mẫu thụ cú MIC ≤ 200àg/ml; chất sạch cú MIC ≤50 àg/ml được đỏnh giá là có hoạt tính
Các chủng VSV kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn
Pseudomonas aeruginosa là một loại vi khuẩn gram âm, thường được gọi là trực khuẩn mủ xanh, có khả năng gây ra nhiều loại nhiễm trùng nghiêm trọng Vi khuẩn này có thể gây nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng da và niêm mạc, cũng như các bệnh lý như viêm đường tiết niệu, viêm màng não, viêm màng trong tim và viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật
MHB (Mueller-Hinton Broth) and MHA (Mueller-Hinton Agar) are commonly used media for bacterial cultures, while TSB (Tryptic Soy Broth) and TSA (Tryptic Soy Agar) serve similar purposes For yeast cultivation, SDB (Sabouraud-2% Dextrose Broth) and SA (Sabouraud-4% Dextrose Agar) are the preferred options.
Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng để tạo thành 05 nồng độ khác nhau theo yêu cầu thử nghiệm Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 àg/ml, trong khi nồng độ cao nhất đối với chất sạch là 128 àg/ml.
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm
200 l dung dịch VSV kiểm định có nồng độ 5.10 5 CFU/ml, ủ ở 37 o C/24h
- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của VSV
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data
- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch
Xác định hoạt tính kháng Mycobacterium smegmatis được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán KS trên đĩa thạch Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch YS trong 7 ngày ở nhiệt độ 30°C.
KCTC 9108 được nuôi trên môi trường 219 lỏng (g/L: pepton – 10, cao nấm men – 5, cao malt – 5, casamino acid – 5, cao bò – 2, glycerol – 2, tween 80 –
KẾT QUẢ
3.1.1 Phân lập và tạo sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger Để phân lập XK hiệu quả, các mẫu đất, trầm tích được phơi khô 2-3 ngày để giảm thiểu các đối tượng không mong muốn như nấm mốc, vi khuẩn Đồng thời, KS nalidixic acid và cycloheximide cũng được bổ sung thêm để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Từ 26 mẫu đất, trầm tích sử dụng, chúng tôi đã phân lập được 181 chủng khác nhau về đặc tính khuẩn lạc như màu sắc, kích thước khuẩn lạc, cấu trúc hệ sợi, sự phát triển của khuẩn ty, sự tiết sắc tố Kết quả chi tiết được thể hiện trên bảng 3 1 và hình 3 1
Bảng 3 1: Các chủng XK được phân lập tại các địa điểm khác nhau
STT Kí hiệu Địa điểm phân lập
Rừng ngập mặn xã Phù Long, Cát Hải,
Vườn quốc gia Cát Bà, Cát Hải, Hải
Vườn quốc gia Cúc Phương, Nho Quan,
A181 Suối Yên, chùa Hương, Mỹ Đức, Hà Nội
Qua quan sát và đánh giá sơ bộ, có 135 chủng vi khuẩn được phân lập, trong đó 74,6% thuộc nhóm Streptomyces và 25,4% thuộc nhóm XK hiếm Các chủng XK hiếm chủ yếu tập trung ở rừng ngập mặn Phù Long và vườn quốc gia Cát Bà Tổng cộng, 181 chủng vi khuẩn đã được thuần hóa và lưu giữ trong glycerol 20% ở nhiệt độ -80℃ để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng
Hình 3 2: Ảnh minh họa khả năng kháng M smegmatis của các chủng xạ khuẩn
Bảng 3 2: Kết quả hoạt tính kháng M smegmatis của các chủng xạ khuẩn
VTCC Nguồn gốc phân lập Đường kính vòng kháng
1 VH19-A002 Rừng ngập mặn Phù Long 9
2 VH19-A067 Vườn quốc gia Cát Bà 9
3 VH19-A079 Vườn quốc gia Cát Bà 9
4 VH19-A105 Vườn quốc gia Cát Bà 8
5 VH19-A121 Vườn quốc gia Cúc Phương 11
181 chủng XK phân lập được được sàng lọc hoạt tính kháng
Nghiên cứu về Mycobacterium smegmatis được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán KS trên đĩa thạch đã chỉ ra rằng có 14 chủng XK, chiếm 7,7%, có khả năng kháng lại M smegmatis Trong số đó, 5 chủng có hoạt tính kháng mạnh nhất bao gồm VH19-A002 (Streptomyces avidinii) và VH19-A067 (Streptomyces spiroverticillatus).
Các chủng vi khuẩn Streptomyces, bao gồm VH19-A079 (Streptomyces wuyuanensis), VH19-A105 (Streptomyces hawaiiensis) và VH19-A121 (Streptomyces alboniger), thể hiện hoạt tính kháng khác nhau, như được chỉ ra trong bảng 3 Sự khác biệt này có thể xuất phát từ các hợp chất sinh ra từ từng chủng hoặc do sự hiện diện của một hoặc nhiều hợp chất có phổ kháng rộng.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, 7,7% các chủng vi khuẩn phân lập được cho thấy có hoạt tính kháng M smegmatis, tỷ lệ tương tự như nghiên cứu của Hussain và cộng sự (2017) với 9% chủng kháng M tuberculosis và M smegmatis từ 125 mẫu đất ở Ấn Độ Nghiên cứu của Manikkam và cộng sự (2014) ghi nhận tỷ lệ kháng cao hơn, với 39/54 chủng từ Tamil Nadu có khả năng kháng M tuberculosis Đặc biệt, nghiên cứu của Ashok và cộng sự (2020) cho thấy 93% trong số 30 chủng vi khuẩn nội sinh từ 7 loại cây thuốc có hoạt tính kháng M smegmatis Những phát hiện này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc nghiên cứu vi khuẩn ở các vùng sinh thái chưa được khai thác, như biển sâu, sa mạc và rừng rậm, để phát hiện các hoạt chất sinh học mới.
3.1.3 Phân loại 5 chủng xạ khuẩn
Hình 3 3: Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng XK có hoạt tính kháng M smegmatis cao nhất
Bảng 3 3: Bảng phân loại dựa trên hình thái và 16S rADN
Màu sắc khuẩn ty cơ chất
Màu sắc khuẩn ty khí sinh
Tên loài (dựa trên trình tự 16S rADN)
A002 Nâu nhạt Trắng đến nâu - Streptomyces avidinii
A067 Nâu nhạt Xám nâu - Streptomyces spiroverticillatus
A105 Nâu Xám xanh - Streptomyces hawaiiensis
A121 Nâu nhạt Trắng xám - Streptomyces alboniger
Ghi chú: (-) không sinh sắc tố
Năm chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng M smegmatis tốt nhất đã được phân loại dựa trên hình thái và trình tự 16S rADN Các đặc điểm phân loại bao gồm màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, khả năng sinh sắc tố, hình thái chuỗi bào tử và trình tự 16S rADN, tất cả đều thuộc chi Streptomyces.
Kết quả phân loại chi tiết được trình bày trong bảng 3 3
Như vậy, có thể thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger có hoạt tính kháng lao tốt nhất với đường kính kháng khuẩn M.smegmastis lớn nhất d
Chúng tôi đã chọn chủng 11 mm để tiến hành nghiên cứu nhằm tạo ra dịch sinh khối lượng lớn Mục tiêu của nghiên cứu bao gồm chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính của các chất sạch được phân lập.
KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VH19-A121
3.2.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất VTBE.01
Hình 3 4: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1 H- 1 H COSY ( ) của hợp chất VTBE.01
Hợp chất VTBE.01 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng, với cấu trúc khung obscurolide Dữ liệu phổ NMR cho thấy tín hiệu của hệ A2B2 vòng thơm xuất hiện ở δH.
Hình 3 5: Phổ 1 H-NMR của hợp chất VTBE.01
The analysis reveals key spectral signals, including two doublets at 6.67 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-2’, H-6’) and 7.73 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-3’, H-5’), indicating a trans olefin double bond Additional significant signals are observed at δH 5.64 (1H, ddq, J = 15.5, 8.0, 2.0 Hz, H-7) and 5.88 (1H, dd, J = 15.0, 7.0 Hz, H-6) Furthermore, four signals corresponding to the butyrolactone protons appear at δH 2.44 (1H, dd, J = 18.0, 3.5 Hz, Ha-2), 3.18 (1H, dd, J = 18.0, 7.5 Hz, Hb-2), 4.35 (1H, m, H-4), and 4.41 (1H, m, H-3) Additionally, a methyl proton signal is detected at δH 1.74 (3H, d, J = 6.5 Hz).
H-8), 1 tín hiệu của nhóm hydroxyl tại δH 4,60 (brs), và 1 tín hiệu của nhóm aldehyde tại δH 9,77 (1H, s) (Hình 3.5)
Phổ 13 C-NMR cũng cho thấy hợp chất VTBE.01 thuộc khung obscurolide bao gồm tín hiệu của 6 nguyên tử C của vòng benzen, 1 liên kết đôi olefin tại δC 128,2 (C-6) và 131,4 (C-7) , 1 nhóm methylen tại δC 36,3 (C-
2) một nhóm methyl tại δC 17,8, (C-8 , nhóm cacbonyl δC 174,9 (C-1) và δC 190,3, (C-7’) (Hình 3.6)
Hình 3.6: Phổ 13 C-NMR của hợp chất VTBE.01
Cấu trúc hợp chất VTBE01 đã được xác định dựa trên việc kết hợp dữ liệu từ các phổ 2D NMR như COSY, HSQC, HMBC và NOESY Cụ thể, dữ liệu từ phổ COSY cho thấy sự tương tác giữa H-2’ (δH 6,67) và H-3’ (δH 7,73), cùng với H-5’ (δH).
Hình 3 7: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01
Hình 3 8: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01
Phổ HMBC chỉ ra tương tác H-2 (δH 2,44, 3,18), H-3 (δH 4,41), H-4 (δH
4 (δC 87,4) cho thấy liên kết trong vòng butyrolactone (Hình 3.8)
Các tín hiệu C-6 (δC 131,4) và C-7 (δC 128,2) cho thấy sự hiện diện của liên kết trong nhóm allylic alcohol Tương tác giữa H-5 (δH 4,32) và C-3 (δC 51,1) xác nhận rằng vòng butyrolactone được kết nối với nhóm allylic alcohol tại vị trí C-4 Hơn nữa, phổ HMBC chỉ ra các tương tác H-3’ (δH 7,73), H-5’ (δH 7,73) với C-1’ (δC 150,9) và C-7’ (δC 190,3), cùng với H-2’ (δH 6,70) và H-6’ (δH 6,70) với C-4’ (δC 128,2), cho thấy vị trí thế para của nhóm aldehyde trên vòng benzen.
Ngoài ra, phổ NOESY cũng cho tương tác giữa H-4 (δH 4,35)/H-5 (δH
4,32), H-5 (δH 4,32)/H-7 (δH 5,64), chứng tỏ proton của carbon C-4, C-5 và C-
7 nằm cùng phía với nhau và định hướng α so với mặt phẳng phân tử Do đó nhóm -OH ở vị trí (Hình 3.9)
Hình 3 9: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01
Combining spectral data and comparing it with reference materials (Michael Ritzau et al., 1993) leads to the conclusion that the compound VTBE01 is identified as 4-(((2S,3S)-2-((S,E)-1-hydroxybut-2-en-1-yl)-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)amino)benzaldehyde.
Obscurolide B2β có công thức phân tử C15H17NO4, là một hợp chất thuộc khung ɤ-butytolactone Hợp chất này được coi là hormone điều chỉnh quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger, đồng thời tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn.
Streptomyces Hợp chất obscurolide B2β được phân lập lần đầu tiên từ chủng xạ khuẩn Streptomyces vitidocbtomogenes vào năm 1993
Bảng 3 4: Số liệu phổ NMR của hợp chất VTBE.01, obscurolide B2 [48]
3.2.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 121CN.02
Hình 3 10: Cấu trúc và tương tác HMBC () và 1 H- 1 H COSY ( ) của hợp chất 121CN.02
Hình 3.11: Phổ (-)-ESI-MS của hợp chất 121CN.02
Hợp chất 121CN.02 được phân lập dưới dạng chất rắn, màu vàng Phổ khối ESI-MS của hợp chất này cho pic ion phân tử tại m/z 639,1 [M-H] -
Hình 3 12: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 121CN.02
The NMR spectral data of the compound 121.CN.02 indicates that its structure comprises a pentacyclic aromatic bilactone and a disaccharide The 1H-NMR spectrum reveals four doublet signals for the aromatic protons at δH 7.41 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-).
The analysis reveals several distinct proton signals: at δH 7.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-17), δH 7.51 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-16), and δH 8.19 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8), along with a triplet signal for aromatic protons at δH 7.61 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-9) Additionally, a singlet signal for a methyl group is observed at δH 2.81 (3H, s, H-19), as well as a singlet for a hydroxyl group at δH 11.63 (Figure 3.12).
Trong vùng đường, xuất hiện tín hiệu của 2 monosaccharide bao gồm 10 tín hiệu của proton oxymethine tại δH 3,30 (1H, dd, J = 10,0, 3,0 Hz,
H-9’), 3,78 (1H, m, H-4’), 3,84 (1H, m, H-8’), 3,87 (1H, m, H-10’), 3,88 (1H, m, H-3’), 4,27 (1H, m, H-2’), 5,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1’, H-anomer), 5,70 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7’, H-anomer), δH 3,92 (1H, m, H-5’), 4,22 (1H, q, J 6,0 Hz, H-11’), hai tín hiệu của proton methyl tại δH 1,38 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6’), 1,44 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-12’) và một tín hiệu của proton methoxy tại δH 3,36 (3H, s, H-13’) (Hình 3.12)
Hình 3 13: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 121CN.02
Phổ 13 C-NMR cũng cho thấy hợp chất 121CN.02 gồm 2 thành phần chính là aglycone thơm và 1 disaccharide bao gồm 32 tín hiệu carbon Trong đó, có 3 tín hiệu của nhóm methyl δC 16,4 (C-12’), 16,5 (C-6’), 22,2 (C-19), 1 nhóm methoxy tại δC 57,0 (C-13’), 15 cacbon methine trong đó có 10 cacbon hydroxyl methine thuộc vùng đường tại δC 67,1 (C-11’), 67,6 (C-8’), 68,1 (C- 10’), 70.9 (C-5’), 71,0 (C-3’), 73,1 (C-4’), 80,1 (C-9’), 82,3 (C-2’), 98,9 (C- 1’, C-anomer), 101,4 (C-7’, C-anomer) và năm cacbon methine thuộc vùng vòng thơm tại 115,2 (C-10), 118,4 (C-8), 120,9 (C-16), 127,8 (C-9), 133,0 (C-
17) cùng với 11 cabon bậc bốn thuộc vòng thơm tại δC 96.6 (C-5), 109,0 (C-
159,2 (C-1), 164,7 (C-14) Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C đã gợi ý hai đơn vị đường trong hợp chất 121 CN.02 bao gồm đường D-fucose và D-digitalose
Hình 3 14: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02
Cấu trúc hợp chất được xác định dựa trên dữ liệu từ các phổ COSY, HSQC, HMBC và NOESY Dữ liệu COSY cho thấy sự tương tác giữa các proton trong vòng thơm, cụ thể là H-8 (δH 8,19) với H-9 (δH 7,61) và H-9 (δH 7,61) với H-10 (δH 7,41) Ngoài ra, các tương tác giữa các proton trong vòng đường cũng được khẳng định qua các mối liên kết như H-4’ (δH 3,78) với H-3’ (δH 3,88), H-3’ (δH 3,88) với H-2’ (δH 4,27), H-2’ (δH 4,27) với H-1’ (δH 5,33), và H-7’ (δH 5,70) với H-8’ (δH 3,84).
Phổ HMBC chỉ ra tương tác H-19 (δH 2,81)/C-2 (δC 117,7), C-18 (δC
Các dữ liệu từ H- và C-nhóm cho thấy có sự liên kết trong vòng thơm, với các giá trị δC và δH cụ thể như C-17 (δC 140,2), H-17 (δH 7,44), C-15 (δC 146,5), H-16 (δH 7,51), C-3 (δC 119,8), H-8 (δH 8,19), C-6 (δC 157,3), C-10 (δC 115,2), H-9 (δH 7,61), C-7 (δC 126,9), H-10 (δH 7,41), và C-12 (δC 119,0) Tương tác H-1’ (δH 5,33)/C-11 (δC 153,1) cho thấy đường D-fucose được kết nối với aglycone thơm tại vị trí C-1’ Ngoài ra, tương tác H-2’ (δH 4,27)/C-7’ (δC 101,4) chỉ ra rằng digitalose được nối với đường fucose tại vị trí C-2’.
Hình 3 15: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02
Combining spectral data and comparing it with reference materials allows us to conclude that the compound 121CN.02 is identified as 10-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihydroxy-4-methoxy-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-4,5-dihydroxy-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-6-hydroxy-1-methylbenzo[h]chromeno[5,4,3-cde]chromene-5,12-dione, commonly known as chartreusin.
Chartreusin, có công thức phân tử C32H32O14, là một glycoside benzoquinone lần đầu tiên được chiết xuất từ loài Streptomyces chartreusis trong quá trình tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn chống lại Mycobacterium tuberculosis Chất này được biết đến với khả năng chống khối u mạnh mẽ thông qua cơ chế liên kết với DNA và làm phá vỡ sợi đơn DNA.
Bảng 3 5: Số liệu phổ NMR của hợp chất 121CN.02 và Chartreusin [49]
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC
TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC
3.3.1 Hoạt tính kháng lao và kháng vi sinh vật kiểm định
Hai chất sạch VTBE.01 và 121CN.02 phân lập từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces alboniger được kiểm tra hoạt tính kháng chủng tương đồng với chủng lao M smegmatis Kết quả cho thấy chất 121CN.02 có hoạt tính kháng
M smegmatis mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn 15 mm Chất,
Nghiên cứu cho thấy VTBE.01 không có hoạt tính kháng chủng M smegmatis, đồng thời xác nhận sự tương đồng với các kết quả trước đó Hợp chất chartreusin đã được chứng minh có khả năng kháng lao đối với dòng vi khuẩn M tuberculosis từ chủng Streptomyces chartreusis Đặc biệt, đây là lần đầu tiên phát hiện hoạt tính kháng lao của Streptomyces alboniger, với hợp chất 121CN.02 đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính này.
Mycobacterium smegmatis là vi khuẩn sống hoại sinh, phát triển nhanh trong điều kiện thiếu oxy, và có nhiều đặc điểm tương tự với mầm bệnh M tuberculosis Vi khuẩn này chết nhanh chóng khi chuyển từ điều kiện hiếu khí sang kỵ khí, cho thấy sự nhạy cảm của nó với môi trường Những phát hiện này cho thấy M smegmatis có thể được coi là một mô hình hữu ích để sàng lọc hoạt tính kháng lao mà không làm lây lan mầm bệnh.
Bảng 3.6: Hoạt tính kháng lao của 2 hợp chất VTBE.01 và 121CN.02
HỢP CHẤT Đường kính kháng M smegmatis (mm)
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy ba chủng gram dương bao gồm Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, và Lactobacillus fermentum, cùng với ba chủng gram âm là Salmonella enterica và Escherichia coli, đã được kiểm định kỹ lưỡng.
Hợp chất 121CN.02 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn gram dương tiềm năng đối với các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Lactobacillus fermentum, với các giá trị IC50 lần lượt là 4,54±0,25, 1,08±0,07 và 7,49 àg/ml Tuy nhiên, hợp chất này không có khả năng ức chế các chủng gram âm và nấm Candida albican.
Bảng 3 7: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của hợp chất
Cand ida albic an ng Cefota xim
3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào
Bảng 3 8: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 121CN.02
Hợp chất 121CN.02 đã được thử nghiệm khả năng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư như ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HEP-G2), ung thư phổi (LU-1) và ung thư vú (MCF-7) Kết quả cho thấy hợp chất này có hoạt tính tiềm năng nhất trên dòng tế bào ung thư gan với giá trị IC50 là 0.5 ± 0.08 àg/ml Ngoài ra, hợp chất cũng thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào KB và HEP-G2 với giá trị IC50 lần lượt là 5.27 ± 0.25 àg/ml và 5.30 ± 0.31 àg/ml Đối với ung thư vú, hoạt tính của hợp chất này ở mức độ trung bình với giá trị IC50 là 28.8 ± 0.63 àg/ml So với đối chứng Ellipticine, các giá trị lần lượt là 0.30 ± 0.05 àg/ml, 0.35 ± 0.05 àg/ml và 0.43 ± 0.05 àg/ml Như vậy, hợp chất 121CN.02 cho thấy tiềm năng kháng ung thư đáng chú ý bên cạnh khả năng kháng lao và kháng vi sinh vật.
Tờn mẫu IC50 (àg/ml)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập được hai hợp chất từ dịch sinh khối chủng xạ khuẩn
Streptomyces alboniger Cấu trúc của các hợp chất này được xác định là
VTBE.01:4-(((2S,3S)-2-((S,E)-1-hydroxybut-2-en-1-yl)-5- oxotetrahydrofuran-3-yl)amino)benzaldehyde (obscurolideB2)và 121CN.02:
Hai hợp chất mới, 10-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,5-dihydroxy-4-methoxy-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-4,5-dihydroxy-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)-6-hydroxy-1-methylbenzo[h]chromeno[5,4,3-cde]chromene-5,12-dione (chartreusin) đã được phân lập lần đầu từ chủng xạ khuẩn S alboniger Nghiên cứu cho thấy sinh khối của chủng S alboniger có hoạt tính kháng lao tiềm năng, với đường kính kháng khuẩn đạt 11 mm khi thử nghiệm trên chủng vi khuẩn M smegmatis Đây là lần đầu tiên hoạt tính kháng lao của chủng xạ khuẩn S alboniger được xác định.
VTBE.01 và 121CN.02 Kết quả cho thấy hợp chất 121CN.02 thể hiện hoạt tính kháng M smegmatis tiềm năng với đường kính kháng khuẩn 15 mm, chất
Hợp chất 121CN.02 đã được đánh giá về hoạt tính kháng vi sinh vật trên ba chủng gram dương và ba chủng gram âm, bao gồm Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, cùng với một chủng nấm Candida albican Kết quả cho thấy 121CN.02 có khả năng kháng cả ba chủng gram dương Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, và Lactobacillus fermentum với giá trị IC50 lần lượt là 4,54±0,25, 1,08±0,07 và 7,49 µg/ml Đặc biệt, hợp chất này có giá trị MIC = 8 trên Bacillus subtilis, cao hơn so với MIC của kháng sinh Ampicillin, cho thấy tiềm năng lớn trong nghiên cứu sản xuất kháng sinh Tuy nhiên, 121CN.02 không có hoạt tính ức chế đối với các chủng gram âm và nấm Candida albican Đối với hoạt tính gây độc tế bào, hợp chất này cho thấy hiệu quả kháng ung thư đầy triển vọng trên bốn dòng tế bào ung thư, đặc biệt là trên dòng tế bào ung thư gan với giá trị IC50 là 0,5±0,08 µg/ml.
Nghiên cứu tiếp tục tập trung vào việc phân lập và chiết tách các hợp chất từ dịch sinh khối của chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger Mục tiêu là đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, đặc biệt là khả năng kháng lao và kháng ung thư của các chất sạch được phân lập.
[1] M V Arasu, V Duraipandiyan, P Agastian, and S Ignacimuthu,
“Antimicrobial activity of Streptomyces spp ERI-26 recovered from Western Ghats of Tamil Nadu,” Journal de Mycologie Médicale, vol
[2] Y Z Frohwein, Z Dafni, M Friedman, R I J A Mateles, and B
Chemistry, “New metabolites of Streptomyces alboniger,” vol 37, no
[3] N L Dũng, Vi sinh vật học (Phần 1), Hà Nội: Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2012
[4] B T Hà, “Nghiên cứu xã khuẩn thuộc chủng STREPTOMYCES sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên,” Trường Đại học Sư phạm, 2008
[5] S Dharmaraj, and Biotechnology, “Marine Streptomyces as a novel source of bioactive substances,” World Journal of Microbiology, vol
[6] J Berdy, “Bioactive microbial metabolites,” The Journal of antibiotics, vol 58, no 1, pp 1-26, 2005
[7] M G Watve, R Tickoo, M M Jog, and B D J A o m Bhole, “How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?,” Archives of microbiology, vol 176, no 5, pp 386-390, 2001
[8] E J Ashforth, C Fu, X Liu, H Dai, F Song, H Guo, and L Zhang,
“Bioprospecting for antituberculosis leads from microbial metabolites,”
Natural product reports, vol 27, no 11, pp 1709-1719, 2010
[9] A Tupin, M Gualtieri, F Roquet-Banères, Z Morichaud, K Brodolin, and J.-P Leonetti, “Resistance to rifampicin: at the crossroads between ecological, genomic and medical concerns,” International journal of antimicrobial agents, vol 35, no 6, pp 519-523, 2010
[10] C Chen, F Song, Q Wang, W M Abdel-Mageed, H Guo, C Fu, W
Hou, H Dai, X Liu, N Yang, and biotechnology, “A marine-derived Streptomyces sp MS449 produces high yield of actinomycin X 2 and actinomycin D with potent anti-tuberculosis activity,” Applied microbiology, vol 95, no 4, pp 919-927, 2012
Tanouye, B Wan, S Carlson, N J Barranis, E n Ó hAinmhire, and W.-L Chen, “Diaza-anthracene antibiotics from a freshwater-derived actinomycete with selective antibacterial activity toward Mycobacterium tuberculosis,” ACS infectious diseases, vol 1, no 4, pp 168-174, 2015
[12] T Lindel, P R Jensen, and W Fenical, “Lagunapyrones AC:
Cytotoxic acetogenins of a new skeletal class from a marine sediment bacterium,” Tetrahedron letters, vol 37, no 9, pp 1327-1330, 1996
[13] H Shigemori, M A Bae, K Yazawa, T Sasaki, and J Kobayashi,
“Alteramide A, a new tetracyclic alkaloid from a bacterium
Alteromonas sp associated with the marine sponge Halichondria okadai,” The Journal of Organic Chemistry, vol 57, no 15, pp 4317-
[14] S Carlson, U Tanouye, S Omarsdottir, and B T Murphy, “Phylum- specific regulation of resistomycin production in a Streptomyces sp via microbial coculture,” Journal of natural products, vol 78, no 3, pp
[15] H.-J Shin, H.-S Jeong, H.-S Lee, S.-K Park, H.-M Kim, H.-J Kwon, and biotechnology, “Isolation and structure determination of streptochlorin, an antiproliferative agent from a marine-derived Streptomyces sp 04DH110,” Journal of microbiology, vol 17, no 8, pp 1403-1406, 2007
[16] S Zhang, Q Yang, L Guo, Y Zhang, L Feng, L Zhou, S Yang, Q
Yao, G Pescitelli, and Z Xie, “Isolation, structure elucidation and racemization of (+)-and (−)-pratensilins A–C: unprecedented spiro indolinone-naphthofuran alkaloids from a marine Streptomyces sp,”
Chemical Communications, vol 53, no 72, pp 10066-10069, 2017
[17] K Hong, A.-H Gao, Q.-Y Xie, H G Gao, L Zhuang, H.-P Lin, H.-P
Yu, J Li, X.-S Yao, and M Goodfellow, “Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soils and plants in China,”
Marine drugs, vol 7, no 1, pp 24-44, 2009
[18] J He, D Zhang, Y Xu, X Zhang, S Tang, L Xu, and W Li,
“Diversity and bioactivities of culturable marine actinobacteria isolated from mangrove sediment in Indian Ocean,” Acta microbiologica Sinica, vol 52, no 10, pp 1195-1202, 2012
[19] R Usha, K K Mala, C K Venil, and M Palaniswamy, “Screening of actinomycetes from mangrove ecosystem for L-asparaginase activity and optimization by response surface methodology,” Polish journal of microbiology, vol 60, no 3, pp 213-221, 2011
Jensen, and W Fenical, “Salinosporamide A: a highly cytotoxic proteasome inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Salinospora,” Angewandte Chemie International Edition, vol 42, no 3, pp 355-357, 2003
[21] L Ding, J Münch, H Goerls, A Maier, H.-H Fiebig, W.-H Lin, C
Hertweck, and m c letters, “Xiamycin, a pentacyclic indolosesquiterpene with selective anti-HIV activity from a bacterial mangrove endophyte,” Bioorganic, vol 20, no 22, pp 6685-6687,
[22] P Fu, C Yang, Y Wang, P Liu, Y Ma, L Xu, M Su, K Hong, and
W Zhu, “Streptocarbazoles A and B, two novel indolocarbazoles from the marine-derived actinomycete strain Streptomyces sp FMA,”
Organic letters, vol 14, no 9, pp 2422-2425, 2012
Nghiên cứu của P V Cường và cộng sự về các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật vùng biển Đông Bắc Việt Nam đã được trình bày tại Hội thảo Đề án Biển diễn ra tại Hà Nội vào tháng 9 năm 2015.
[24] N X Cường, N X Nhiệm, N V Thanh, B H Tài, Đ T M Hương,
P V Cường, N H Nam, P Q Long, P V Kiệm, and C V Minh,
Bài viết "Điểm lại các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2013‐2017" đăng trên Tạp chí Hóa học Việt Nam, tập 56, số 1, trang 1-19, năm 2018, tổng hợp các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển tại Việt Nam Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn tổng quát về sự đa dạng hóa học và tiềm năng ứng dụng của sinh vật biển trong lĩnh vực y học và công nghiệp Các kết quả nghiên cứu từ giai đoạn 2013-2017 đã chỉ ra những giá trị kinh tế và sinh học quan trọng của các loài sinh vật biển, đồng thời mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo.
[25] S Nishanth Kumar, C Mohandas, J Siji, K Rajasekharan, and B
Nambisan, “Identification of antimicrobial compound, diketopiperazines, from a B acillus sp N strain associated with a rhabditid entomopathogenic nematode against major plant pathogenic fungi,” Journal of applied microbiology, vol 113, no 4, pp 914-924,
[26] Q V Thi, V H Tran, H D T Mai, C V Le, M L T Hong, B T
Murphy, V M Chau, and V C Pham, “Antimicrobial metabolites from a marine-derived actinomycete in Vietnam's East Sea,” Natural product communications, vol 11, no 1, pp 1934578X1601100116,
Pham, and B T Murphy, “A pimarane diterpene and cytotoxic angucyclines from a marine-derived Micromonospora sp in Vietnam’s east sea,” Marine drugs, vol 13, no 9, pp 5815-5827, 2015
[28] V T Quyen, V Van Nam, T Van Hieu, D T M Huong, B Murphy,
C Van Minh, and P Van Cuong, “Secondary metabolites from marine bacterium Streptomyces sp G039,” Vietnam Journal of Chemistry, vol
[29] V T Quyen, T Van Hieu, D T M Huong, B Murphy, C Van Minh, and P Van Cuong, “Secondary metabolites produced by marine bacterirum micromonospora sp G019,” Vietnam Journal of Chemistry, vol 53, no 2e, 2015
[30] C D Tuan, D T M Huong, T B Ngan, V T Quyen, M Brian, C
Van Minh, and P Van Cuong, “Secondary metabolites from Micromonospora sp.(G044),” Vietnam Journal of Science Technology, vol 55, no 3, pp 251-251, 2017
[31] N X Cường, N X Nhiệm, N V Thanh, B H Tài, Đ T M Hương,
P V Cường, N H Nam, P Q Long, P V Kiệm, and C V Minh,
Bài viết "Điểm lại các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2013‐2017" được đăng trên Tạp chí Hóa học Việt Nam, tập 56, số 1, trang 1-19, năm 2018, tổng hợp và phân tích những nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển tại Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2013 đến 2017 Nội dung bài viết cung cấp cái nhìn tổng quan về sự đa dạng và tiềm năng ứng dụng của các loài sinh vật biển trong nghiên cứu khoa học và công nghiệp, nhấn mạnh vai trò quan trọng của chúng trong việc phát triển bền vững và bảo tồn tài nguyên biển.
[32] V Van Nam, D T M Huong, C Van Minh, and P Van Cuong,
“Compounds from culture broth of marine bacterium Micromonospora sp.(G047),” Vietnam Journal of Chemistry, vol 55, no 2, pp 207,
I Antokhina, and C V Minh, “Anthenosides L–U, steroidal glycosides with unusual structural features from the starfish Anthenea aspera,”
Journal of natural products, vol 79, no 12, pp 3047-3056, 2016
[34] A M Oskay, T ĩsame, and A Cem, “Antibacterial activity of some actinomycetes isolated from farming soils of Turkey,” African journal of Biotechnology, vol 3, no 9, pp 441-446, 2004
[35] S Kovácsová, S Javoreková, J Medo, I Charousová, J Elbl, L J J o
M Plošek, Biotechnology, and F Sciences, “Characteristic of Streptomyces species with antimicrobial activity against selected phytopathogenic bacteria and fungi,” vol 9, no 6, pp 55-59, 2020
[36] C Hesseltine, J Porter, N Deduck, M Hauck, N Bohonos, and J
Williams, “A new species of streptomyces,” Mycologia, vol 46, no 1, pp 16-23, 1954
[37] J Porter, R Hewitt, C Hesseltine, G Krupka, J Lowery, W Wallace,
N Bohonos, J J A Williams, and chemotherapy, “Achromycin: a new antibiotic having trypanocidal properties,” vol 2, no 8, pp 409-410,
[38] X Yan, B Zhang, W Tian, Q Dai, X Zheng, K Hu, X Liu, Z Deng, and X J S Qu, “Puromycin A, B and C, cryptic nucleosides identified from Streptomyces alboniger NRRL B-1832 by PPtase-based activation,” Synthetic systems biotechnology, vol 3, no 1, pp 76-80,
[39] M Natsume, K Yasui, S Kondo, and S J T l Marumo, “The structures of four new pamamycin homologues isolated from Streptomyces alboniger,” vol 32, no 26, pp 3087-3090, 1991
[40] P A McCann, and B M Pogell, “Pamamycin: a new antibiotic and stimulator of aerial mycelia formation,” The Journal of antibiotics, vol
[41] N Luo, Y.-B Yang, X.-Q Yang, C.-P Miao, Y.-Q Li, L.-H Xu, Z.-T
In their 2018 study published in RSC Advances, Ding and L.-X Zhao explore the streptazolin and obscurolide metabolites produced by the soil-derived bacterium Streptomyces alboniger YIM20533 The research highlights the non-enzymatic biosynthesis mechanisms influenced by γ-butyrolactone, shedding light on its effects on the growth of Streptomyces This investigation contributes valuable insights into the biochemical interactions within microbial communities and their potential applications in biotechnology.
[42] T Mosmann, “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays,” Journal of immunological methods, vol 65, no 1-2, pp 55-63, 1983
Germani, S T Van Der Sand, and Biotechnology, “Preliminary characterization of some Streptomyces species isolated from a composting process and their antimicrobial potential,” World Journal of Microbiology, vol 26, no 10, pp 1847-1856, 2010
[44] M Y El-Naggar, S A El-Assar, and S M Abdul-Gawad,
“Meroparamycin production by newly isolated Streptomyces sp strain MAR01: taxonomy, fermentation, purification and structural elucidation,” Journal of microbiology, vol 44, no 4, pp 432-438,
[45] A Hussain, M Rather, A Shah, Z Bhat, A Shah, Z Ahmad, and Q
Parvaiz Hassan, “Antituberculotic activity of actinobacteria isolated from the rare habitats,” Letters in applied microbiology, vol 65, no 3, pp 256-264, 2017
[46] R Manikkam, G Venugopal, B Subramaniam, B Ramasamy, and V
Kumar, “Bioactive potential of actinomycetes from less explored ecosystems against Mycobacterium tuberculosis and other nonmycobacterial pathogens,” International scholarly research notices, vol 2014, 2014
“AntiMycobacterial activity of endophytic actinobacteria from selected medicinal plants,” Biomedical, vol 4, no 3, pp 193, 2020
[48] M RITZAU, S Philipps, A Zeeck, H Hoff, and H ZÄHNER,
“Metabolic products of microorganisms 268 obscurolides, a novel class of phosphodiesterase inhibitors from streptomyces II Minor components belonging to the obscurolide B to D series,” The Journal of antibiotics, vol 46, no 10, pp 1625-1628, 1993
[49] Y S Wang, B Zhang, J Zhu, C L Yang, Y Guo, C L Liu, F Liu,
H Huang, S Zhao, and Y Liang, “Molecular basis for the final oxidative rearrangement steps in chartreusin biosynthesis,” Journal of the American Chemical Society, vol 140, no 34, pp 10909-10914,
[50] T Dick, B H Lee, and B J F m l Murugasu-Oei, “Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium smegmatis,” vol 163, no 2, pp 159-164, 1998
Phụ lục 1: Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger
Bảng 1.1: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của hợp chất
Bảng 1.2: Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 121CN.02
Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất VTBE.01
Hình 2.1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất VTBE.01
Hình 2.1a: Phổ 1 H-NMR của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.1b: Phổ 1 H-NMR của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.1c: Phổ 1 H-NMR của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.2 Phổ 13 C-NMR của hợp chất VTBE.01
Hình 2.2a Phổ 13 C-NMR của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.3: Phổ HSQC của hợp chất VTBE.01
Hình 2.3a: Phổ HSQC của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.3b: Phổ HSQC của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.4: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01
Hình 2.4a: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.4b: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.4c: Phổ HMBC của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.5: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01
Hình 2.5a: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.5b: Phổ COSY của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.6: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01
Hình 2.6a: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Hình 2.6b: Phổ NOESY của hợp chất VTBE.01 (giãn rộng)
Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất 121CN.02
Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 121CN.02
Hình 3.1a: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.1b: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 121CN.02
Hình 3.2a: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.2b: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.3: Phổ DEPT của hợp chất 121CN.02
Hình 3.3a: Phổ DEPT của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.4: Phổ HSQC của hợp chất 121CN.02
Hình 3.4a: Phổ HSQC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.4b: Phổ HSQC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.5: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02
Hình 3.5a: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.5b: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.5c: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.5d: Phổ HMBC của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
3.6: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02
3.6a: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
3.6b: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
3.6c: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
3.6d: Phổ COSY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.7: Phổ NOESY của hợp chất 121CN.02
Hình 3.7a: Phổ NOESY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.7b: Phổ NOESY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
Hình 3.7c: Phổ NOESY của hợp chất 121CN.02 (giãn rộng)
