Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Bệnh IB ở gà đẻ nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội có những đặc điểm dịch tễ học nổi bật, bao gồm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết khác nhau theo lứa tuổi, quy mô chăn nuôi và mùa vụ Triệu chứng của bệnh thường xuất hiện rõ rệt, kèm theo những bệnh tích đặc trưng, giúp nhận diện và chẩn đoán bệnh hiệu quả hơn.
- Đặc điểm bệnh lý học gà mắc bệnh IB
- Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để chẩn đoán bệnh do IBV ở gà đẻ nuôi ở vùng phụ cận Hà Nội.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu này được tiến hành tại các trang trại chăn nuôi gà đẻ trứng của công ty DABACO tại Bắc Ninh và gà thả đồi nuôi lấy trứng ở huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang.
Mẫu được phân tích tại Trung tâm chẩn đoán thú y DABACO, thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và Bộ môn Bệnh lý thú y của Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: Từ tháng 10/2015 đến tháng 9/2016
Nguyên liệu
Gà đẻ trứng giống ISA Brown ở mọi lứa tuổi có dấu hiệu nghi mắc bệnh IB Các mẫu bệnh phẩm như phổi, khí quản và thận từ những con gà nghi mắc bệnh đã được thu thập từ một số trang trại của công ty DABACO Bắc Ninh và các xã thuộc huyện Yên Thế, Bắc Giang.
Cặp mồi cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, với đoạn gen được nhân lên có kích thước khoảng 403 bps (Feng et al., 2012) (bảng 3.1) Các hóa chất và dụng cụ cần thiết cho phản ứng RT-PCR cùng với việc xác định các đặc điểm bệnh lý của gà mắc bệnh được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Trong nghiên cứu, các dụng cụ và hóa chất cần thiết bao gồm hóa chất cho phản ứng RT-PCR như kít chiết tách ARN, nước không chứa nuclease, dNTP, enzyme, primers, TBE và agarose Các thiết bị như máy li tâm lạnh, máy vortex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm 37 độ C, tủ lạnh, hệ thống máy rửa và máy ủ cũng rất quan trọng Ngoài ra, các trang thiết bị phòng thí nghiệm như ống Eppendorf, pipet, găng tay, đầu type, giấy thấm nước, ống đong và thiết bị làm tiêu bản vi thể được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và Bộ môn Bệnh lý thú y.
Bảng 3.1 Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR
Kích cỡ sản phẩm RT- PCR
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp lấy mẫu Đối tượng lấy mẫu là gà ISA Brown nuôi hướng trứng nghi mắc IB ở mọi lứa tuổi chăn nuôi theo hướng tập trung trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh của công ty DABACO và nuôi thả đồi ở Yên Thế, Bắc Giang
Mẫu bệnh phẩm gà nghi mắc IB được lấy theo TCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT, bao gồm gà mái đẻ từ 18 - 75 tuần tuổi có triệu chứng hô hấp như khó thở, há miệng, âm thanh rale khí quản, chảy nước mũi, hoặc có tiêu chảy phân trắng trong 7 ngày đầu khi bắt đầu bệnh Cần lấy mẫu từ những con gà có báng nước ở bụng, gà đẻ giả, hoặc đàn gà giảm đẻ, trứng trắng, kỳ hình cao, và chỉ lấy mẫu từ những gà không tiêm vắc xin IB hoặc đã tiêm trước đó 21 ngày Mẫu bệnh phẩm bao gồm đoạn khí quản dài 5 – 7 cm có dịch nhầy hoặc tổn thương sung huyết, phổi, buồng trứng, thận, được cho vào túi plastic vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6 o C với formol 10%, nhanh chóng chuyển đến phòng thí nghiệm trong ngày để thực hiện phản ứng RT-PCR.
3.4.2 Phương pháp mổ khám gà (theo 10 TCN 723-2006)
* Kiểm tra bên ngoài: Thể trạng, da, lông, vết thương, lỗ tự nhiên, khớp…
Mổ khám bên trong gà bắt đầu bằng việc nhúng ướt lông gà trong dung dịch sát trùng Sau đó, gà được đặt nằm ngửa trên bàn mổ, và tiến hành cắt da ở vùng bụng và bẹn để lật chân sang hai bên, bộc lộ cơ đùi Tiếp theo, cắt da giữa lỗ huyệt và xương hái, một tay giữ hai chân, tay kia kéo phần da trên xương hái để lộ cơ ngực.
Kiểm tra tình trạng cơ ngực, cơ đùi và xương lưỡi hái để phát hiện dấu hiệu khô cơ, xuất huyết, và biến dạng Sử dụng kéo để rạch da từ phần diều đến dưới mỏ nhằm bộc lộ diều, thực quản và khí quản Tiến hành cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xương hái, tiếp tục cắt hai bên sụn sườn qua xương đòn và xương quạ để lấy xương lưỡi hái ra, mở bộc lộ xoang ngực và xoang bụng Quan sát túi khí và các cơ quan nội tạng, sau đó lấy gan, mật, lá lách và tuyến tụy ra để kiểm tra màu sắc và kích thước.
Cắt đứt phần trên dạ dày tuyến và loại bỏ màng treo ruột giúp lật toàn bộ cơ quan tiêu hóa ra phía sau, nhằm kiểm tra cuối cùng để tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.
Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng đối với con cái, dịch hoàn ống dẫn tinh đối với con đực)
Kiểm tra thận, ống dẫn niệu, túi Fabricius về hình dạng kích thước, màu sắc, dịch cả bên ngoài và bên trong
Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang
Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa trong và mùi
Dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong
Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ,các xoang và van…
Tách phổi ra khỏi các xương sườn kiểm tra màu sắc, đọ xốp
Bộc lộ dây thần kinh cánh ở trước xương sườn thứ nhất và dây thần kinh hông trong cơ đùi hoặc xoang chậu dưới thận giúp kiểm tra viêm sưng Đồng thời, rạch khớp gối để kiểm tra dịch, bẻ xương đùi nhằm xác định độ cứng mềm, và chẻ xương đùi để kiểm tra tủy.
Để cắt đầu gia cầm, đầu tiên cần thực hiện cắt ở đốt Atlas và lột da Sử dụng kéo cắt xương, cắt hai bên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, sau đó lật hộp sọ để lộ não Cuối cùng, dùng kéo cong vô trùng để cắt lấy não.
Dùng kéo rạch ruột rạch từ dạ dày tuyến xuống tận hậu môn, kiểm tra các tổn thương, hoại tử, xuất huyết, ký sinh trùng
3.4.3 Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
Trizol (Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Đức) được sử dụng để tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm theo quy trình của nhà sản xuất Quy trình bắt đầu bằng việc bổ sung 1 ml Trizol vào 200 µl huyễn dịch chứa mẫu và dung dịch EMDM, sau đó trộn đều trong ống eppendorf 1,5 ml và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để đảm bảo phân tách nucleoprotein Tiếp theo, 0,2 ml Chloroform được thêm vào ống eppendorf, đậy nắp và lắc mạnh trong 15 giây Sau khi để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, huyễn dịch sẽ được ly tâm.
Dịch nổi được thu lại sau khi ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C và chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới Isopropanol được bổ sung với lượng tương đương, sau đó ống được đậy nắp, lộn ngược vài lần và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Dịch nổi được loại bỏ sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C ARN được rửa với 1 ml ethanol qua việc vortex và ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C Sau khi loại bỏ dịch lỏng, ARN được hong khô tự nhiên trong 10 phút để loại bỏ ethanol và sau đó hòa tan trong nước cất hai lần ARN có thể được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20 o C.
3.4.3.2 Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA cDNA được phiên mã ngược sử dụng bộ Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất Hỗn hợp 20àl gồm 6àl RNA, 4àl nước đó loại RNase, 2 àl dNTPs (10mM mỗi loại), 1àl mồi xuụi, 1àl mồi ngược (200 pM/àl), 1àl RevertAid Reverse Transcriptase (200U/àl), 1àl RiboLock RNase inhibitor (20 U/àl) và 4àl 5x first strand buffer Hỗn hợp được trộn đều và để trong máy PCR với chu trình nhiệt 25°C trong 10 phút, 42°C trong 60 phút và sau đó 70°C trong vòng 5 phút Sản phẩm cDNA sau đó được trực tiếp sử dụng hoặc bảo quản ở -20°C
3.4.3.3 Phản ứng PCR cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng kit GoTaq ® Green Master Mix (Promega, Mỹ) Kit này chứa DNA Taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA Mồi
Trong nghiên cứu này, các cặp mồi được sử dụng là những cặp đã được công bố trước đây (Feng et al., 2012) (bảng 2.2) Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình với các bước: 94°C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với 94°C trong 30 giây, 54°C trong 30 giây và 72°C trong 45 giây; cuối cùng là 72°C trong 10 phút (bảng 3.3).
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Bảng 3.3 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt trong phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 45 giây
3.4.3.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100 o C trong vòng 5 phút, làm nguội đến khoảng
Ở nhiệt độ 60 độ C, ba ống thuốc nhuộm Ethidium bromide được thêm vào khuôn cắt lược đã được chuẩn bị sẵn để tạo thành bản gel với các giếng để nạp mẫu cho quá trình điện di Sau khi bản gel đông cứng, nó được đặt vào thiết bị điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE với độ sâu khoảng 3 - 5mm.
2µl thuốc nhuộm được trộn với 8µl sản phẩm RT-PCR và chuyển vào các giếng trong bản thạch 5µl DNA Marker được điện di đồng thời như một thang chuẩn DNA Sản phẩm RT-PCR được điện di với nguồn điện 100V và cường độ 100mA trong 30 phút Sau khi điện di, kết quả được đọc trên máy phát tia UV, với vị trí các đoạn DNA được phát hiện qua các vệt sáng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu lại kết quả.
3.4.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Các khí quan có biểu hiện bệnh tích đặc trưng được chọn để xác định biến đổi bệnh lý vi thể Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm các bước chuẩn bị, cố định bệnh phẩm, vùi, đúc, cắt dán mảnh và nhuộm bằng Haematoxylin – Eosin (HE).
