Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm khảo sát đưa ra các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm

SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3]

Cây thảo sống nhiều năm, cao từ 0,3 đến 0,5 m, có thân rễ mập, phân nhánh nằm ngang và thường nổi trên mặt đất Rễ củ dài, nhiều đốt và mang nhiều vết sẹo do thân tàn lụi để lại, với đầu rễ có hình con quay Thân cây mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa và có vạch dọc, đường kính từ 0,3 đến 0,6 cm Lá cây là lá kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 đến 3 lá, với mỗi lá có 3 đến 7 lá chét, thuôn dài từ 2,5 đến 14 cm, rộng từ 1,5 đến 4 cm, có gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, và mép khía răng có lông.

Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp [15]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 -

Hoa có cuống dài mảnh từ 1 đến 1,5 cm, màu trắng lục với 5 lá nhỏ, 5 cánh hoa và 5 nhị Bầu hoa có 2 - 3 ô và đầu vỏ nhụy chẻ đôi Quả mọng hình cầu hơi dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ và có chấm đen lớn ở đầu Mỗi quả chứa 2 - 3 hạt hình cầu màu xám trắng, vỏ cứng và có rốn hạt.

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

SVD là loài cây ưa ẩm và bóng râm, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín ở độ cao từ 1600 – 2300 m Loài cây này phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm, với chồi thân mọc lên từ mầm thân rễ vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 Chồi này nhanh chóng phát triển, ra lá và đạt chiều cao tối đa trong vòng một tháng Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa, với quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6, và quả chín rụng vào tháng 7 Tuy nhiên, lượng mưa lớn trong tháng 7 – 8 thường cuốn trôi hạt giống, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD Sau khi quả chín, từ tháng 9 đến tháng 10, phần thân trên mặt đất tàn lụi, để lộ vết sẹo trên thân rễ, dấu hiệu xác định tuổi cây, trong khi chồi mới bắt đầu hình thành ở đầu thân rễ, giúp thân rễ phát triển thêm về chiều dài.

SVD, hay sâm vũ diệp, phân bố tự nhiên chủ yếu ở các khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ và Nê Pan, đặc biệt là vùng cận Himalaya Điểm phân bố cuối cùng của loài này về phía nam là tại Sa.

Pa của Việt Nam, phân bố chủ yếu ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn như Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên, đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do nạn phá rừng và khai thác bừa bãi Việc bảo vệ loài cây này hiện đang được ưu tiên hàng đầu tại Việt Nam.

Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang và cho những kết quả khả quan [15,16]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự (2002) chỉ ra rằng trong thân rễ và rễ củ SVD có hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Trong đó, saponin được xác định là thành phần hoạt chất chính, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.

Năm 1989, một nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc đã công bố việc phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này, bao gồm nhiều ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid.

Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2

[1] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm

Từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, đã phát hiện 10 saponin khung oleanan, bao gồm 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết như narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1, và pseudoginsenosid.

RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22]

Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester [16]

Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl

Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp [22]

Bảng 1.1 Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp

Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây SVD

Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]

SVD được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống tại Việt Nam và Trung Quốc, nhưng tài liệu nghiên cứu về tác dụng dược lý của nó vẫn còn hạn chế Một số nghiên cứu trên động vật thí nghiệm đã chỉ ra rằng SVD có khả năng tăng cường chức năng sinh lý, cải thiện hệ thần kinh trung ương, nâng cao sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể Ngoài ra, SVD còn có tác dụng tán huyết, chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễn dịch và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Theo đông y, SVD là vị thuốc quý có nhiều công dụng như hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau và hỗ trợ điều trị các triệu chứng như thũng trướng, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết, chảy máu mũi và xuất huyết dạ dày Ngoài ra, SVD còn có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng và tăng cường trí nhớ, đặc biệt tốt cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi SVD thường được sử dụng để ngâm rượu hoặc nấu cao, pha với nước hoặc rượu để kích thích sinh dục.

TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU

Tiêu chuẩn cơ sở được thiết lập dựa trên nghiên cứu khoa học, công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, cũng như kinh nghiệm và nhu cầu thực tiễn.

Các quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm mô tả, định tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết xuất và định lượng hoạt chất trong dược liệu.

Mô tả dược liệu bao gồm hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, và các đặc điểm bề mặt như vết bẻ hay mặt cắt Những yếu tố này giúp nhận diện và phân loại dược liệu một cách chính xác, đồng thời cung cấp thông tin về đặc điểm thể chất của chúng.

• Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

Nhận biết dược liệu có thể thực hiện qua các phương pháp đơn giản và truyền thống, như quan sát sự chìm hay nổi trong nước, lắng nghe tiếng nổ, và chú ý đến màu sắc của ngọn lửa hoặc khói, cũng như mùi phát ra khi đốt cháy dược liệu.

Định tính dược liệu qua phương pháp vi học là quá trình quan sát các đặc điểm của tế bào và mô trong lát cắt, bột hoặc bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi.

- Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực, v.v… của các dược liệu

Định tính hóa học là phương pháp kiểm tra các thành phần trong dược liệu thông qua các phản ứng hóa học Quy trình thực hiện được mô tả chi tiết trong các chuyên luận về dược liệu cụ thể.

Định tính sắc ký là phương pháp sử dụng các kỹ thuật như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao để phát hiện các thành phần trong dược liệu Phương pháp này cho phép so sánh các thành phần với chất chuẩn hoặc dược liệu chuẩn, từ đó xác định chất lượng và độ tinh khiết của dược liệu.

Định tính huỳnh quang là quá trình quan sát sự phát huỳnh quang từ bề mặt hoặc mặt cắt của dược liệu, cũng như dịch chiết của chúng, trong điều kiện thường hoặc sau khi tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử Theo quy định, mẫu thử cần được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, với khoảng cách từ nguồn sáng khoảng 10 cm.

- Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại

Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằng phiến kính có miếng bông tẩm nước lạnh Đặt tấm kim loại lên lưới amiant với lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm, sau đó đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém Nhấc phiến kính ra và để nguội, sau đó quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất đã thăng hoa trên phiến kính bằng kính hiển vi hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp với chất đã thăng hoa.

Thử tinh khiết là phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, và tùy thuộc vào từng loại dược liệu, quá trình này có thể bao gồm một số hoặc tất cả các chỉ tiêu cần thiết để đảm bảo chất lượng.

- Mất khối lượng do làm khô

- Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric

- Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối

- Tỉ lệ vụn nát của dược liệu

- Hàm lượng kim loại nặng

- Dư lượng các chất bảo vệ thực vật

- Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)

Định lượng là quá trình xác định hàm lượng của một hoặc nhiều chất có trong dược liệu thông qua các phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Quá trình này không chỉ bao gồm việc xác định hàm lượng chất béo và tinh dầu mà còn bao gồm việc đánh giá hoạt lực của dược liệu thông qua các phép thử sinh học.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Sâm vũ diệp, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được trồng tại huyện Sa Pa, Lào Cai và thu hoạch vào ngày 15/07/2016, sau 6 năm chăm sóc Mẫu cây này đã được giám định bởi ThS Nguyễn Quỳnh.

Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (DL -

150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu

Thân rễ sâm vũ diệp có đặc điểm nổi bật với nhiều đốt và vết sẹo, có hình dạng cong ngoằn ngoèo, chiều dài từ 7-12 cm và đường kính từ 1,2-1,8 cm Chất liệu của thân rễ cứng chắc, giòn và dễ bẻ, với bề mặt lởm chởm và màu vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp tỏa ra mùi thơm nhẹ, có vị đắng và hơi ngọt.

Để xử lý mẫu thân rễ SVD, trước tiên cần rửa sạch, để khô và thái lát mỏng Sau đó, sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C cho đến khi hàm ẩm đạt dưới 10% Cuối cùng, bảo quản mẫu trong túi nilon kín và để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu.

Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại

Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

- Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước cất hai lần,… dùng cho phân tích

- Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck)

- Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck)

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ)

- Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Kính hiển vi điện tử

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu SVD theo các tiêu chí quy định trong DĐVN V, phụ lục 12.2, bao gồm các yếu tố như mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, định tính và định lượng.

Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích thước bằng cách đo

Mẫu dược liệu SVD được cắt vi phẫu và tẩy sáng bằng dung dịch Cloramin 5 – 10% Sau đó, mẫu được nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylene Cuối cùng, các đặc điểm vi phẫu của dược liệu được quan sát dưới kính hiển vi.

Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4]

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã cắt nhỏ, sấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó: m: Khối lượng tro (g) M: Khối lượng mẫu thử (g) B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6 Tro không tan trong acid

Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7:

Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong

Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp

Cân phần tạp chất và tính phần trăm:

Trong đó: a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam

Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện:

Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau:

CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III)

Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol

+ Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký

+ Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml methanol : nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử

+ Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml

Để tiến hành sắc ký trên bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở 105°C trong 60 phút, chấm riêng biệt mỗi 5 µl dung dịch thử và các dung dịch đối chiếu Tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4, cho đến khi hệ dung môi triển khai khoảng 8 cm Sau đó, lấy bản mỏng ra để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử và sấy ở 105°C trong 5 phút Cuối cùng, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại UV 365 nm và ánh sáng thường.

Kết quả cho thấy sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đã được chụp ảnh lưu giữ Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 được ghi nhận và phân tích.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của pha động

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, phụ lục 5.3 a) Xây dựng phương pháp

Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

Để chuẩn bị dung dịch thử, cần cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình tam giác 100 ml, sau đó thêm 50 ml hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 70:30 Tiến hành siêu âm trong 30 phút, để nguội và bổ sung dung môi cho đủ thể tích ban đầu, sau đó lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm để thu được dung dịch dùng cho tiêm sắc ký.

Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol với các nồng độ chính xác: 18,75 àg/ml, 37,5 àg/ml, 75 àg/ml, 150 àg/ml, 200 àg/ml, 300 àg/ml và 400 àg/ml.

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:

Dựa trên các tài liệu tham khảo và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD.

Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo

Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau

Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector

Sử dụng UV, FLD và DAD giúp phát hiện chất phân tích hiệu quả, đồng thời thuận tiện cho quá trình phân tích và phù hợp với các điều kiện trong phòng thí nghiệm.

Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU b)Thẩm định và đánh giá phương pháp

Thẩm định điều kiện định lượng saponin chính trong thân rễ SVD được thực hiện với chất đối chiếu đã được nhận dạng cấu trúc Tổng tạp chất được xác định bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích Quy trình này được đánh giá theo hướng dẫn tài liệu [5-7,25], tập trung vào các chỉ tiêu như độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng phân tích rõ ràng chất cần đánh giá trong sự hiện diện của tạp chất hoặc các chất cản trở khác.

Sắc ký đồ cho các mẫu thử cho thấy rằng thời gian lưu của các pic khác nhau không có ý nghĩa thống kê khi so sánh với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ của các mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Độ tương thích hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống phân tích được xác định bởi độ chính xác của thiết bị, thông qua việc đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại thời gian lưu cùng diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được thể hiện qua giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 % Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) Độ tuyến tính được thể hiện qua phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R².

Để xác định nồng độ chất cần phân tích, bạn cần chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu với nồng độ tăng dần Tiếp theo, hãy xác định mối quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất trong mẫu thử thông qua phương trình hồi quy tuyến tính.

Mô tả

Dược liệu là thân rễ SVD, có hình dạng cong ngoằn ngoèo, dài từ 7-12 cm và đường kính từ 0,5-1,5 cm Mặt ngoài của thân rễ có màu nâu, với các vết nhăn dọc và vân ngang nổi rõ, chia thành nhiều đốt, cùng với nhiều sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại Thân rễ có cấu trúc cứng chắc, giòn và dễ bẻ, với mặt bẻ có màu vàng nâu nhạt Dược liệu này tỏa ra mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng và hơi ngọt.

Vi phẫu

Lớp bần gồm 5-6 hàng tế bào hình chữ nhật, có thành hơi cong và màu lục, lớp ngoài thường bị bong rách Mô mềm vỏ cây bao gồm những tế bào hình nhiều cạnh dày lên ở góc, chứa nhiều ống tiết và tinh thể canxi oxalat hình cầu gai.

Các bó libe-gỗ được sắp xếp thành từng bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm và được phân cách bởi các tia ruột rộng Gỗ gồm những tế bào thành dày, nằm trong mô mềm gỗ ít hóa gỗ.

Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, bao gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật với màng mỏng, được sắp xếp thành dãy đều đặn.

Tia ruột rộng gồ m nhiều tế bào xếp theo hướng xuyên tâm

Ruột cấu tạo bởi các tế bào tạo ra những khoảng gian bào, ống tiết ở vị trí ứng với các bó libe-gỗ ở cả phía trong lẫn phía ngoài.

Soi bột

Màu vàng nâu, soi kính hiển vi thấy những hạt tinh bột hình bầu dục với kích thước không đều, trong đó hạt là một vạch Mảnh bần chứa các tế bào hình nhiều cạnh, thành dày màu vàng nâu Mảnh mô mềm bao gồm các tế bào màng mỏng, màu trắng Mảnh mạch vạch, mạch mạng, và rải rác có chất tiết màu nâu đen Tinh thể calcium oxalat hình cầu gai.

Bần Mô mềm Mô mềm chứa tinh bột

Mảnh mạch Đám tinh bột Chất tiết Tinh thể calci oxalate

Độ ẩm

Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dược liệu SVD theo phương

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm ẩm (% )

Độ ẩm trung bình của các mẫu dược liệu SVD là khoảng 8,17%, đảm bảo nằm trong ngưỡng an toàn theo quy định của DĐVN Để ngăn ngừa tình trạng dược liệu bị mốc do độ ẩm cao, quy định yêu cầu hàm ẩm của dược liệu SVD không vượt quá 10%.

Tro toàn phần

Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu kết quả được trình bày tại bảng 3:

Bảng 3.2 Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro toàn phần (% )

Từ bảng phân tích, tỷ lệ tro toàn phần trung bình của dược liệu SVD là 7,53%, với mẫu cao nhất đạt trên 7,8% Do đó, quy định về tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu không được vượt quá 8%.

Tro không tan trong acid

Sau khi thực hiện theo hướng dẫn ở mục 2.2.6, kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu dược liệu SVD được trình bày trong bảng 4 như sau:

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro không tan trong acid (%)

Kết quả phân tích cho thấy độ tro không tan trong acid trung bình của ba mẫu dược liệu SVD là 1,57% Theo dự kiến, quy định về độ tro không tan trong acid của dược liệu SVD không được vượt quá 2,0%.

Định tính

Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.8

Kết quả quan sát dưới ánh sáng thường cho thấy sắc ký đồ bản mỏng của dung dịch thử (I) cần có các vết màu sắc và giá trị Rf tương đồng với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (II) Ngoài ra, cần có một vết ở khoảng Rf 0,3 đến 0,5 có màu sắc và giá trị Rf giống với sắc ký đồ của dung dịch chất chuẩn stipuleanosid R2 (III) như thể hiện trong Hình 6.

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp (Ký hiệu:

Định lượng

Chương trình được thực hiện theo phương pháp do nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy xây dựng, bao gồm việc khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp.

Chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector UV: bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết

- Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B)

Pha động được rửa giải theo chương trình như sau:

Bảng 3.4 Chương trình dung môi Thời gian

25-30 20 80 Đẳng dòng b) Thẩm định phương pháp phân tích

Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH

Pha dung dịch mẫu thử bằng cách cân chính xác khoảng 0,1 g cao ethanol từ thân rễ sâm vũ diệp (độ ẩm 4,7%) vào bình định mức 10 ml Tiếp theo, thêm 7 ml methanol và lắc siêu âm trong 10 phút để hòa tan Sau đó, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch định mức, lắc đều, ly tâm để thu dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Để pha dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2, cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 và hòa tan trong methanol để tạo dung dịch gốc với nồng độ 1000 μg/mL Sau đó, siêu âm trong 10 phút, ly tâm để lấy dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiếp theo, pha loãng dung dịch chuẩn gốc với methanol để tạo ra các dung dịch có nồng độ phù hợp cho việc xây dựng dãy dung dịch chuẩn.

Tính thích hợp hệ thống

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích một dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 6 lần Qua quá trình sắc ký, chúng tôi đã ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, cùng hệ số đối xứng Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21%, tất cả đều thấp hơn 3%, chứng tỏ các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa.

The School of Medicine and Pharmacy at VNU has established a stable and suitable HPLC chromatography system for the analysis of stipuleanosid R2 in the medicinal herb, Gynostemma pentaphyllum.

Bảng 3.5 Tính thích hợp của hệ thống

STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích đã đề ra Ghi lại sắc ký đồ và xác định thời gian lưu cùng phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được được trình bày trong các hình 7 sau.

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả phân tích cho thấy sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện đỉnh ở thời gian lưu tương ứng với stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn Tuy nhiên, sắc ký đồ của dung dịch thử lại cho thấy một đỉnh có thời gian lưu trùng khớp với stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn, cho thấy độ tuyến tính của phương pháp phân tích.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc với các hệ số khác nhau Thực hiện sắc ký cho từng dung dịch chuẩn (tiêm 3 lần mỗi dung dịch) và ghi lại sắc ký đồ để xác định đáp ứng của pic Từ đó, xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được.

Theo nghiên cứu tại Trường Đại học Y Dược, VNU, có mối quan hệ tuyến tính rõ rệt giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2, được mô tả bởi phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R² = 0,9988 Trong khoảng nồng độ từ 15,625 đến 400 µg/ml, sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2 thể hiện rất chặt chẽ với hệ số tương quan cao.

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2

(àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 Độ đúng

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp cho thấy độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD, chứng tỏ phương pháp có độ thu hồi tốt và phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp Kết quả được trình bày ở bảng 8 với phương trình y = 2.6081x + 49.1185 và R² = 0.9988.

Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2

Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi

STT Lượng có sẵn (àg)

Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và thực hiện phân tích HPLC cho đến khi tín hiệu chất phân tích trên sắc ký đồ đạt tỷ lệ S/N (tín hiệu/nhiễu) khoảng 2-3 Trong đó, S là chiều cao pic của chất phân tích và N là chiều cao tín hiệu nhiễu lớn nhất Nồng độ xác định được chính là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp đối với chất phân tích.

Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD

= 1,953 àg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 àg/ml

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp được xây dựng có khả năng phát hiện và định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp một cách tương đối chính xác.

Ta có sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 và của dược liệu SVD (Hình 9)

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu

Kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu SVD được trình bày tại bảng 9:

Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332 % đến 0,338 %, với giá trị trung bình là 0,335 % ± 0,003 Theo tiêu chuẩn quy định, hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD không được thấp hơn 0,3 %.

Bàn luận

Nghiên cứu này được thực hiện trên mẫu dược liệu đã được xác định tên khoa học, thu hái tại Sa Pa – Lào Cai vào năm 2016 Để đạt được kết quả tốt hơn, cần thực hiện quan sát trên nhiều mẫu thu hái từ các vùng khác nhau.

3.9.2 Về khảo sát các chỉ tiêu theo quy định trong Dược điển Việt Nam

Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu, các chỉ tiêu như độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần và tỷ lệ tro không tan trong acid là những yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng của dược liệu SVD trước khi sử dụng Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và kinh phí, một số chỉ tiêu như tạp chất, tỷ lệ vụn nát, hàm lượng kim loại nặng và hàm lượng các chất có thể chiết xuất bằng dung môi chưa được thực hiện.

3.9.3 Về định tính Định tính chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong ethanol khi hơ nóng bản mỏng đã cho thấy sự xuất hiện của các vết chất có cùng khoảng Rf và màu sắc giống nhau, điều này chứng tỏ sự hiện diện của stipuleanosid R2 Nghiên cứu đã đề xuất hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD bằng phương pháp SKLM.

Chúng tôi đã xác định được hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu SVD thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp HPLC

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332% đến 0,338%, cho thấy rằng giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD theo tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3%.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:

Đã tiến hành khảo sát các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ trong DĐVN V, bao gồm các yếu tố như mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, cùng với các phương pháp định tính và định lượng.

- Khảo sát, xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2

Nghiên cứu này là bước đầu quan trọng trong việc hoàn thiện tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD của DĐVN trong tương lai Dựa trên kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đã đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD, bao gồm các yêu cầu như độ ẩm không quá 10,0%, tro toàn phần không quá 8,0%, tro không tan trong acid không quá 2,0%, và hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3%.

1 Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD

2 Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu SVD trong Dược điển Việt Nam

3 Đề xuất thầm định tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.

Trong cuốn sách "Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam" do Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và Nguyễn Thượng Đông cùng cộng sự biên soạn (2003), thông tin về các loại cây thuốc và động vật có tác dụng dược liệu được trình bày chi tiết trong tập 2, trang 711 đến 714.

[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285-

[3] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản

Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87

[4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

[5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc

[6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113,

[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương

(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338

[8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58

[9] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 464 - 466

[10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh

(2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200

[11] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis

Ha et Grushv Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27

Trần Công Luận (2002) đã thực hiện phân tích thành phần hóa học và nghiên cứu các tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) trong đề tài cấp Bộ.

Nghiên cứu của Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (2009) trong bài viết “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)” được công bố trên Tạp chí dược liệu, đã chỉ ra các thành phần hóa học quan trọng và những tác dụng dược lý tiềm năng của hai loại sâm này Bài viết cung cấp thông tin chi tiết về đặc điểm sinh học và ứng dụng của chúng trong y học, góp phần nâng cao hiểu biết về giá trị dược liệu của sâm vũ diệp và tam thất hoang.

Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013) đã trình bày trong hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5 rằng họ nhân sâm (Araliaceae Juss.) là nguồn tài nguyên phong phú với nhiều hoạt chất sinh học đa dạng và tiềm năng phát triển tại Việt Nam.

[15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006) đã chỉ ra kết quả về phân bố và sinh thái của sâm vũ diệp cùng với tam thất hoang tại Việt Nam, được công bố trong Tạp chí dược liệu, tập 11, số 5, trang 177-180.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy và các cộng sự (2018) đã phân tích thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai, được công bố trong Tạp chí Dược liệu, tập 2, số 23, trang 82-88 Nghiên cứu này góp phần làm rõ giá trị dược liệu của sâm vũ diệp và mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng trong y học.

Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006) đã thực hiện nghiên cứu về tác dụng của sâm Việt Nam đối với trí nhớ bằng cách xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Dược liệu, tập 11, số 5, trang 202-206.

Nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005) đã chỉ ra một số tác dụng dược lý quan trọng của lá sâm Việt Nam, đặc biệt là khả năng chống stress và tác dụng chống oxy hóa Bài viết được đăng trên Tạp chí Dược liệu, số 10(1), trang 27-32, cung cấp những thông tin giá trị về lợi ích sức khỏe từ loại thảo dược này.

[20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp

[21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238

[22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L

Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420

[23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al

(1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599

[24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636

[25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva

[26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus

Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87

PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA

PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP

Sâm vũ diệp (thân rễ)

Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất

Thân rễ đã phơi và sấy khô của cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), họ Nhân sâm (Araliaceae)

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,37 MB