Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro.
TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Panax L
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L có vị trí phân loại như sau:
Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax L
1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L
Cây Panax L là loại cây thân thảo, sống lâu năm nhờ vào thân rễ Thân rễ của cây có thể ngắn hoặc thon dài và thường phân nhánh Các loài khác nhau trong chi Panax L thể hiện sự khác biệt về độ bền của rễ, điển hình như rễ của P japonicus C A Mayer và P vietnamensis Ha.
Grushv., và P wangianus S C Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ
Lá kép chân vịt có từ 3 đến 5 lá, với mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy như lông chim Cụm hoa của cây này là hoa tán đơn, hoa lưỡng tính với bầu dưới Hoa có 5 lá đài hàn liền ở phần dưới, tràng hoa có 5 cánh và 5 nhị Bầu có từ 2 đến 3, thậm chí có thể lên đến 5 ô Quả của cây là quả mọng, hình cầu, đôi khi hơi dẹt, với hạt dẹt và có nội nhũ mịn.
Theo trang The Plant List, trên thế giới đã có 261 loài được định danh, trong đó có 13 tên khoa học được công nhận, 235 tên đồng nghĩa và 13 tên loài chưa xác định chính xác Đặc biệt, có 2 loài phân bố ở Đông Bắc Mỹ.
Năm 1987, các loài thuộc chi Panax L được phân bố chủ yếu ở châu Á, đặc biệt là ở Đông Nam Trung Quốc và phía Đông dãy Himalaya, theo các nghiên cứu của Burkill (1902), Hara (1970), và Wen cùng Zimmer (1996).
1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L
Các hợp chất saponin, hay còn gọi là ginsenoside, là thành phần chính tạo ra tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L Bên cạnh đó, nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như acid hữu cơ, ester, polysaccharid, amino acid, sterol, flavonoid và carben cũng đã được phát hiện trong các loài thực vật thuộc chi này.
Saponins, also known as ginsenosides, are oligosaccharides derived from triterpenoid frameworks such as dammarane or oleanane Researchers have isolated and identified the structures of at least 289 different saponins Based on the structure of their sapogenins, known ginsenosides can be classified into six distinct groups: protopanaxadiol-derived saponins, protopanaxatriol-derived saponins, octillol-derived saponins, oleanolic acid-derived saponins, saponins with modified C17 side chains, and other saponins Among these, protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, and oleanolic acid-derived saponins are the most prevalent.
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon
1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L
1.1.5.1 Nhâm sâm (Panax ginseng C.A Mey)
Nhân sâm là một vị thuốc quý, nổi bật với tác dụng điều trị các bệnh tinh thần và giảm mệt mỏi Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhân sâm chứa saponin, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe như chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư Ngoài ra, nhân sâm còn giúp cải thiện chức năng tim mạch, hạ cholesterol và lipid trong máu, cũng như ngăn ngừa kết tập tiểu cầu.
1.1.5.2 Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen) (Sanchi ginseng )
Tam thất mang lại nhiều tác dụng sinh học quan trọng Dịch chiết saponin từ Tam thất có khả năng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim mạch.
Copyright @ Trường Đại học Y Dược, ĐHQG Hà Nội Sản phẩm này có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, giảm viêm và đau, đồng thời có khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, hỗ trợ hạ huyết áp và tăng cường hoạt động của tinh trùng.
Sâm Mỹ được nghiên cứu là có khả năng kích thích hệ miễn dịch thông qua việc tăng cường sản sinh tế bào lympho B, cũng như gia tăng các yếu tố như interleukin IL-2, IL-10, interferon-γ và tế bào diệt tự nhiên (NK) Ngoài ra, Sâm Mỹ còn có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim và apoptosis của tế bào cơ tim Tương tự như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng giúp chống huyết khối và ngăn ngừa kết tập tiểu cầu, đồng thời có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả.
1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là hai loài cây thuộc chi Panax, họ Nhâm sâm (Araliaceae), được tìm thấy tự nhiên ở vùng núi phía bắc Việt Nam Hiện nay, cả hai loài này đang được quan tâm phát triển trồng, tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chúng vẫn còn hạn chế.
Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem
Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)
Về thành phần hóa học:
Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang a Sâm vũ diệp
Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá Sâm vũ diệp, bao gồm các ginsenosid đặc trưng như F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 Đến năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan trong rễ Sâm vũ diệp từ dịch chiết methanol, trong đó có 3 hợp chất mới là bifinoside A—C và 7 hợp chất đã biết như narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl ester.
Năm 2015, nhóm tác giả từ Viện Dược liệu, gồm Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà và Nguyễn Minh Khởi, đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp Trong quá trình nghiên cứu, họ đã phân lập thành công một hỗn hợp saponin, bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid, cùng với glycosphingolipid.
1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ
Copyright @ Trường Đại học Y Dược, ĐHQG Các hợp chất như triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và các nguyên tố vi lượng đã được nghiên cứu Polyacetylen lần đầu tiên được phát hiện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.
Nghiên cứu chỉ ra rằng phần thân rễ của Tam thất hoang chứa một lượng lớn saponin khung oleanan, chủ yếu là saponin dẫn chất acid oleanolic, cùng với một số saponin khung dammaran nhưng với hàm lượng thấp.
Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48]
Tổng quan về gốc tự do
Gốc tự do là phân tử có một điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng, làm cho chúng trở nên kém ổn định Trong khi đó, các phân tử trong hệ sinh học thường có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng Do tính chất này, gốc tự do dễ dàng phản ứng với các phân tử hoặc nguyên tử xung quanh, có khả năng cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn thiện quỹ đạo điện tử của mình.
Các gốc tự do, bao gồm các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS), là những dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử.
Các chất oxy hóa được phân chia thành hai nhóm chính: gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do, là tiền thân của các gốc tự do.
Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18]
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ROS được xem là nguyên nhân chính gây tổn thương mô, nhưng sự cân bằng giữa sản xuất ROS và hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể giúp kiểm soát quá trình oxy hóa Khi mất cân bằng nghiêm trọng, sự gia tăng ROS dẫn đến stress oxy hóa, gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh.
RNS, giống như ROS, có vai trò kép trong cơ thể, vừa mang lại lợi ích vừa có thể gây hại Nitric oxide là phân tử đầu tiên được xác định có khả năng giãn nở mạch máu và điều chỉnh lưu lượng máu đến các bộ phận khác nhau Tuy nhiên, nó cũng có thể gây độc tế bào bằng cách phá hủy các enzym chuyển hóa thông qua phản ứng với superoxid và peroxynitrit.
Các ROS và RNS được hình thành tự nhiên trong quá trình trao đổi chất và có tác động tích cực hoặc tiêu cực đến cơ thể tùy thuộc vào nồng độ của chúng Ở mức nồng độ thấp, các ROS và RNS đóng vai trò như những tín hiệu quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý.
• Điều hòa phân ly tế bào
• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm
Điều hòa các gen mã hóa enzym chống oxy hóa là rất quan trọng, vì ở nồng độ cao, các loài phản ứng oxy hóa (ROS) và nitơ (RNS) có thể gây tổn hại cho các đại phân tử sinh học.
1.2.3 Stress oxy hóa 1.2.3.1 Khái niệm
Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng giữa sản xuất gốc tự do và khả năng khử các chất trung gian hoạt tính cao của cơ thể Sự rối loạn trạng thái oxy hóa khử trong mô có thể dẫn đến những tác động độc hại, bao gồm việc sản sinh peroxid và gốc tự do, gây tổn hại cho các thành phần tế bào như protein, lipid và DNA.
1.2.3.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa
Stress oxy hóa đóng vai trò then chốt trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa thần kinh, như bệnh xơ cứng teo cơ một bên (ALS), bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer.
Sự sản xuất ROS và RNS đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các bệnh lý thần kinh như Alzheimer và Parkinson Tích tụ stress oxy hóa cùng với rối loạn hô hấp của ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của các bệnh này.
Stress oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh tim mạch, do oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) gây ra sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, đây là giai đoạn đầu của bệnh huyết áp cao và các bệnh tim mạch khác Ngoài ra, stress oxy hóa cũng góp phần gây ra đột quỵ, nhồi máu cơ tim và bệnh tiểu đường.
Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh ung thư liên quan đến tuổi tác Các chất hoạt động như ROS và RNS có khả năng gây tổn thương trực tiếp đến DNA, dẫn đến đột biến và cản trở quá trình phân ly tế bào, từ đó thúc đẩy sự phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào khối u Đặc biệt, nhiễm Helicobacter pylori làm gia tăng sản xuất ROS và RNS trong dạ dày, góp phần vào sự hình thành ung thư dạ dày.
1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 1.2.4.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl;
DPPH là một chất có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi các chất thử nghiệm được thêm vào dung dịch này, những chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của DPPH.
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là một trong những phương pháp phổ biến nhất hiện nay So với các phương pháp khác, DPPH nổi bật với tính nhanh chóng, đơn giản và chi phí thấp, làm cho nó trở thành lựa chọn ưu việt trong nghiên cứu.
1.2.4.2 Phương pháp đánh giá sự khử màu của 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)
Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu
Phương pháp quang phổ diod-array được sử dụng để đo sự mất màu khi thêm chất chống oxy hóa gốc cú màu xanh lam ABTSã + (2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) ABTSã + là một gốc tự do ổn định không có trong cơ thể người, và khi chất chống oxy hóa tác động, nó sẽ chuyển đổi ABTSã + thành ABTS, dẫn đến hiện tượng mất màu.
1.2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl
Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan
Acetylcholin (ACh) là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, hiện diện trong tất cả các hạch thần kinh tự chủ và các cơ quan nội tạng được hệ thần kinh tự chủ kiểm soát Nó cũng có mặt ở các khớp nối thần kinh cơ và nhiều synap trong hệ thần kinh trung ương ACh hoạt động như một chất dẫn truyền thần kinh ở sợi tiền hạch của tế bào thần kinh giao cảm và phó giao cảm, cũng như tại tuyến thượng thận và các cơ quan khác dưới sự điều khiển của hệ thần kinh tự chủ Trong hệ thần kinh trung ương, ACh chủ yếu tập trung ở các tế bào thần kinh liên lạc.
ACh được tổng hợp từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym Cholin acetyltransferase và sau đó được đóng gói vào các túi màng Khi có tín hiệu thần kinh tại đầu tận cùng của sợi trục, các túi màng sẽ hợp nhất với màng tế bào và giải phóng ACh vào khe synap Để tín hiệu thần kinh được truyền đi liên tục, ACh cần khuếch tán sang tế bào thần kinh hoặc tế bào cơ bắp gần đó, nơi nó sẽ gắn kết và kích hoạt một protein thụ thể Sau khi được giải phóng, ACh sẽ gắn vào các thụ thể của nó, bao gồm thụ thể Nicotinic và Muscarinic.
Trong hệ thống thần kinh trung ương, acetylcholine (ACh) đóng vai trò quan trọng trong việc truyền dẫn các xung động thần kinh Chất này đảm bảo cho các hoạt động cao cấp của vỏ não, bao gồm các quá trình nhận thức, trí nhớ và chú ý.
Khi nồng độ acetylcholine (ACh) giảm xuống mức thấp, không đủ để kích thích khử cực, tín hiệu thần kinh sẽ không được truyền đạt Do đó, ACh có mối liên hệ chặt chẽ với bệnh Alzheimer.
Enzym Acetylcholinesterase (AChE), còn gọi là acetylhydrolase, là cholinesterase chính trong cơ thể, đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy acetylcholin và một số ester cholin khác, là các chất dẫn truyền thần kinh AChE chủ yếu được tìm thấy tại các khớp nối thần kinh cơ và hệ cholinergic.
Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, trong khi sự kết hợp ban đầu của enzym AChE xảy ra ở rìa ngoài, vùng ngoại biên Tại vị trí trên cùng của hẻm, có bốn vị trí hoạt động chính của enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl, được minh họa trong hình 1.3.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE [24]
1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến, đặc trưng bởi sự mất mát các tế bào thần kinh cholinergic trong não và giảm nồng độ acetylcholine (ACh) Bệnh thường xảy ra ở người trên 65 tuổi, nhưng cũng có trường hợp Alzheimer sớm, mặc dù hiếm gặp Theo thống kê năm 2006, trên toàn thế giới có khoảng 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer, và dự đoán đến năm 2050, tỷ lệ mắc bệnh này sẽ tăng lên 1 trên 85 người.
Các nhà khoa học đã xác định nhiều nguyên nhân liên quan đến cơ chế bệnh Alzheimer, trong đó giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh cholinergic Theo giả thuyết này, bệnh Alzheimer xảy ra do sự giảm tổng hợp acetylcholine (ACh) Các chất ức chế Cholinesterase có tác dụng làm tăng chức năng của hệ cholinergic bằng cách ức chế enzym phân hủy ACh, từ đó nâng cao nồng độ ACh và kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não.
Trong điều trị bệnh Alzheimer, các chất ức chế cholinesterase (ChE) vẫn là lựa chọn chính để giảm triệu chứng Những thuốc này ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE), giúp duy trì nồng độ acetylcholine (ACh) bằng cách làm chậm quá trình phân hủy ACh.
Các loại thuốc được FDA và EMA chấp thuận để điều trị các triệu chứng nhận thức của bệnh Alzheimer và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân bao gồm: donepezil, rivastigmine, và galantamine, là những thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là chất đối kháng thụ thể NMDA Tacrine, chất ức chế AChE đầu tiên được phê duyệt vào năm 1993, đã bị ngừng sử dụng do nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, bao gồm độc tính gan.
1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
1.3.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman là một trong những phương pháp đầu tiên và vẫn được áp dụng rộng rãi Phương pháp này chủ yếu sử dụng đo quang, vượt trội hơn so với sắc ký lớp mỏng Cơ chất được sử dụng trong phương pháp này là acetylthiocholin iodid (ATCI) kết hợp với thuốc thử 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic acid (DTNB).
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DTNB giải phóng hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng, được xác định qua độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm Nhiều nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro đã được thực hiện, tuy nhiên, các phương pháp sau này có sự thay đổi so với phương pháp gốc của Ellman, bao gồm nguồn gốc và hoạt độ enzym, loại đệm, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử, cũng như tỷ lệ phối hợp trong hỗn hợp phản ứng.
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển dựa trên phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman Trong quy trình này, sau khi triển khai bản mỏng, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bề mặt bản mỏng, tiếp theo là việc phun dung dịch enzym.
Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]
Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là hiện tượng dương tính giả, khi vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục vấn đề này, cần thực hiện thí nghiệm với một bản mỏng đối chiếu Cách tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như bản thử, nhưng khác ở giai đoạn phun thuốc thử Cụ thể, trên bản thử, dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE Trong khi đó, trên bản đối chiếu, dung dịch DTNB được phun trước, sau đó mới phun hỗn hợp cơ chất ATCI và dung dịch AChE Việc bố trí thí nghiệm như vậy giúp đảm bảo rằng những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản đều là dấu hiệu của phản ứng dương tính giả.
1.3.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Sâm vũ diệp cao giàu saponin Mẫu nghiên cứu thân rễ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3 -
2016 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu
Cao chiết Sâm vũ diệp giàu saponin được tiến hành tại khoa Y – Dược, ĐHQGHN, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là một loại cây giàu saponin, được nghiên cứu từ mẫu toàn cây tươi thu hái tại Sa Pa, Lào Cai Mẫu cây này đã được xác định tên khoa học bởi các chuyên gia thực vật học tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.
Cao chiết Tam thất hoang phân đoạn giàu saponin được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang
Bột thô tam thất hoang
Cô dưới áp suất giảm
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
- Sấy chân không tại 55-60 o C, 24 h Kiểm tra TLC Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở
Dung môi, hóa chất
• 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck), L-acid ascorbic (Merck)
• Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore); 5,5’-dithiobis- (2- nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ)
- Dung môi: MeOH (Merck), DMSO 100% (Merk), nước cất.
Máy móc, dụng cụ
- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal
- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg
- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ)
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin
❖ Nguyên tắc của phương pháp
DPPH là một chất có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch methanol bão hòa Khi các chất thử nghiệm được thêm vào dung dịch này, nếu chúng có khả năng quét các gốc tự do, sẽ dẫn đến việc giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm (hình 2.3) [42]
Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH
❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro
Tiến hành pha dung dịch DPPH, dung dịch mẫu thử, mẫu mẫu chứng ở nồng độ thí nghiệm
- Pha dung dịch DPPH: cân chính xác 24 mg DPPH, pha trong 100 ml methanol, thu được dung dịch có nồng độ 0,6 mM
Để chuẩn bị dung dịch mẫu chứng, cân chính xác 9,3 mg vitamin C và hòa tan trong 1 ml dung dịch DMSO 0,1% Từ dung dịch vitamin C với nồng độ 9,3 mg/ml, tiến hành pha loãng trong dung dịch methanol để tạo ra các nồng độ 1,86 mg/ml, 0,93 mg/ml, 0,46 mg/ml, 0,2325 mg/ml, 0,11625 mg/ml, 0,058125 mg/ml và 0,0290625 mg/ml.
Pha dung dịch mẫu thử bằng cách cân chính xác 124 mg Sâm vũ diệp cao giàu saponin trong 1 ml DMSO 0,1% Sau đó, từ dung dịch Tam thất hoang có nồng độ 124 mg/ml, tiến hành pha loãng trong dung dịch methanol để tạo ra các nồng độ: 49,6 mg/ml, 24,8 mg/ml, 12,4 mg/ml và 6,2 mg/ml.
Dung dịch thử của Tam thất hoang tiến hành tương tự như trên
Để xác định dung dịch làm việc (mẫu chuẩn), hòa tan dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH nhằm thu được dung dịch có độ hấp thụ quang trong khoảng 0,98 ± 0,02 tại bước sóng 517 nm.
Thêm 100 µl dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng với các nồng độ khác nhau vào 3 ml dung dịch làm việc đã xác định trước Sau đó, ủ hỗn hợp này trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo độ hấp thụ quang dung dịch tại bước sóng 517 nm
- Sử dụng MeOH là mẫu trắng
Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần
Phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
𝐴 𝑐 là độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn
𝐴 𝑠 là độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử/ chứng
2.4.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Phương pháp đo quang in vitro hiện đang được sử dụng rộng rãi để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE trong nghiên cứu.
❖ Nguyên tắc của phương pháp:
Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi enzym AChE, tạo ra thiocholin Thiocholin sau đó phản ứng với thuốc thử DTNB, dẫn đến sự hình thành hợp chất acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng Màu sắc của hợp chất này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE, cho phép đánh giá hoạt tính của enzym thông qua việc xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở bước sóng 412 nm.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro
Tiến hành pha đệm Natri phosphat pH 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử và mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm
➢ Pha dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: hòa tan 31,2g Na𝐻 2 P𝑂 4 2𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch a)
➢ Pha dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: hòa tan 71,6 g
𝑁𝑎 2 HP𝑂 4 12𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch b)
➢ Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất, định mức trong bình định mức 1000ml
➢ Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M
Pha enzym AChE yêu cầu cân chính xác 1mg bột AChE (EC 3.1.1.7), tương ứng với 265 đơn vị (265 IU), trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl để tạo thành dung dịch có nồng độ 5 IU/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng 10 lần để thu được dung dịch enzym với nồng độ 0,5 IU/ml, sử dụng cho phương pháp đo quang.
Để chuẩn bị dung dịch cơ chất, cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ATCI) và hòa tan trong 25ml nước cất, thu được dung dịch có nồng độ 20 mM Sau đó, pha loãng dung dịch này 8 lần để có dung dịch cơ chất với nồng độ 2,5 mM.
Để pha thuốc thử DTNB, cân 0,1982g thuốc thử vào 25ml dung dịch đệm phosphat, tạo ra dung dịch có nồng độ 20 mM Sau đó, pha loãng dung dịch này 8 lần để thu được dung dịch thuốc thử có nồng độ 2,5 mM.
Để chuẩn bị dung dịch mẫu chứng, cân chính xác 10 mg berberin clorid và hòa tan trong 10 ml dung dịch MeOH, thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng để đạt nồng độ 100 µg/ml, sau đó tiếp tục pha loãng thành các nồng độ 20 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 2 µg/ml; 0,1 µg/ml và 0,05 µg/ml để tiến hành thử nghiệm.
➢ Pha dung dịch mẫu thử:
Cân 100 mg Sâm vũ diệp giàu saponin, pha với 10 ml dung dịch DMSO 0,1% để tạo dung dịch có nồng độ 10 mg/ml Từ dung dịch này, pha loãng để thu được các nồng độ 4000 àg/ml, 2000 àg/ml, 1000 àg/ml, 500 àg/ml và 250 àg/ml phục vụ cho các thử nghiệm.
Dung dịch thử Tam thất hoang cao giàu saponin được tiến hành tương tự như trên
Thêm lần lượt 700 µl dung dịch đệm phosphat 0,1 M, 100 µl dung dịch thử hoặc chuẩn, và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml Sau đó, trộn đều và ủ hỗn hợp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thờm lần lượt 50 àl dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 àl dung dịch ACTI 2,5 mM vào hỗn hợp trên Sau đó, trộn đều và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 412 nm
- Mẫu chuẩn: được tiến hành như trên nhưng không cho dung dịch thử hoặc chứng
- Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat
Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần
Phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế (% I) được tính theo công thức:
%I: phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế
𝐴 𝑐 : độ hấp thu quang của mẫu chuẩn
𝐴 𝑠 : độ hấp thu quang của mẫu thử/ mẫu chứng
2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Sai số giữa các lần đo của cùng một mẫu thử được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn (SD)
Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức:
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
𝑥 𝑖 là giá trị đo được lần thứ i 𝑥̅ là giá trị trung bình các lần đo n là số lần đo
Dữ liệu thực nghiệm đã được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp thống kê phổ biến trong sinh học, sử dụng phần mềm SigmaPlot 10.0 của Systat Software Inc, Mỹ.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả thực nghiệm
Phương pháp quét gốc tự do DPPH là một kỹ thuật phổ biến để đánh giá khả năng chống oxy hóa, nổi bật với tính đơn giản và tiết kiệm.
Kết quả về khả năng chống oxy hóa in vitro của vitamin C, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 và hình 3.1, 3.2
Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số
Bảng 3.2 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa Sai số
Sâm vũ diệp cao giàu saponin Tam thất hoang cao giàu saponin
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của vitamin C
Bảng 3.4 Giá trị IC 50 chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong phương pháp DPPH
Sâm vũ diệp cao giàu saponin 18,000 Tam thất hoang cao giàu saponin 31,620
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy cao saponin từ Sâm vũ diệp có tác dụng chống oxy hóa vượt trội hơn so với Tam thất hoang trong phương pháp DPPH, với giá trị IC 50 lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml Tuy nhiên, cả hai giá trị IC 50 này vẫn cao hơn nhiều so với giá trị IC 50 của vitamin C, chỉ là 0,126 mg/ml.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.5, 3.6, 3.7 và hình 3.3
Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Giỏ trị IC 50 = 1,454 àg/ml
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin
Bảng 3.6 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Bảng 3.7 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Giá trị IC 50 của berberin được xác định là 1,454 µg/ml Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi chưa thể tính toán được giá trị IC 50 cho mẫu thử Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.
Hoạt tính enzym AChE bị ức chế của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang không có sự khác biệt đáng kể giữa các nồng độ thử nghiệm Sự gia tăng nồng độ thử không làm tăng % hoạt tính enzym AChE bị ức chế của mẫu thử.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bước đầu thí nghiệm cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE.
Bàn luận
Sâm vũ diệp và Tam thất hoang đều thuộc chi Panax L và nghiên cứu cho thấy chúng chứa hàm lượng cao saponin, là thành phần hóa học chính của hai loài này.
Nhiều loài cây thuốc thuộc chi Panax L., như Panax ginseng, Panax quinquefolius, Panax notoginseng, Panax japonicus và Panax vietnamensis, đã được công nhận giá trị sử dụng Nghiên cứu cho thấy các saponin là thành phần hóa học chính trong những loài cây này, đóng vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ Panax ginseng C.A Meyer (Nhân sâm châu Á) và Panax quinquefolius L (Nhân sâm Bắc Mỹ) có khả năng chống oxy hóa hiệu quả Cả hai loại nhân sâm này đều có thể ngăn chặn phản ứng mạnh của gốc tự do hydroxyl trong môi trường in vitro và cản trở quá trình lấy oxy trong quá trình oxy hóa nhũ tương acid linoleic được xúc tác bởi sắt.
Các ginsenosid Rb1 và Rg1 có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan và não chuột Đồng thời, các ginsenosid Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Re, Rg1, Rg2 và Rh1 giúp giảm mức độ superoxid trong hệ thống enzym xanthin oxidase Gần đây, hỗn hợp saponin từ lá và thân loài sâm Mỹ (Panax quinquefolius L.) trồng tại Trung Quốc đã được báo cáo có tác dụng ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) trong sự hiện diện của ion đồng Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các loài thuộc họ Nhâm sâm và một số loài thực vật khác liên quan đến khả năng quét các gốc tự do, có thể gắn liền với thành phần ginsenoside Rb1/Rb2 trong chúng.
Năm 2001, Hu, C và Kitts, D D đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các loài trong chi Panax, với thành phần ginsenosid chiếm tỷ lệ cao, bằng cách sử dụng phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyd.
Kết quả cho thấy ở mức liều 5 mg/ml, % chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ của P ginseng C.A Meyer và P quinquefolium L lần lượt là 64,7% ± 2,1 và 52,1% ± 1,5 [26]
Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, với thành phần tương tự các loài khác trong chi Panax L., có khả năng chống oxy hóa Nghiên cứu đã tiến hành đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của hai loài này bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH, một phương pháp nhanh chóng, phổ biến và tiết kiệm hơn so với các phương pháp khác.
Nghiên cứu ban đầu cho thấy Sâm vũ diệp cao và Tam thất hoang cao, cả hai đều giàu saponin, có tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp quét gốc tự do DPPH Tuy nhiên, khả năng chống oxy hóa của chúng thấp hơn nhiều so với vitamin C.
Giá trị IC 50 chống oxy hóa của vitamin C được xác định là 0,126 mg/ml, gần tương đương với giá trị IC 50 trong các nghiên cứu khác sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH Cụ thể, trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al (2014) về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết saponin từ Radix Trichosanthis, giá trị IC 50 của vitamin C được ghi nhận là 0,9908 ± 0,08 mg/ml.
Sự khác biệt nhỏ về giá trị IC 50 của vitamin C trong nghiên cứu được công bố có thể do sự khác nhau về nguyên liệu vitamin C sử dụng làm mẫu chứng và điều kiện thí nghiệm Trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al (2014), 1 ml mẫu thử được thêm vào 2 ml dung dịch DPPH, được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10 mg DPPH trong 1 ml MeOH, và hỗn hợp này được ủ trong 30 phút.
Nghiên cứu cho thấy giá trị IC 50 chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml, cho thấy tác dụng chống oxy hóa của hai loài này không cao So với các nghiên cứu trước đó, kết quả này chỉ ra rằng hiệu quả chống oxy hóa của cao saponin từ hai loại thực vật này cần được xem xét thêm.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế sự hình thành malonyl diandehyd ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml, cho thấy cao saponin toàn phần của nó có hiệu quả cao trong nghiên cứu in vivo Sự khác biệt kết quả giữa nghiên cứu này và nghiên cứu của Trần Công Luận có thể do đối tượng và phương pháp nghiên cứu khác nhau Nghiên cứu của Trần Công Luận cũng tập trung vào cao saponin toàn phần, nhưng thành phần hợp chất trong hai loài có thể khác nhau, ảnh hưởng đến kết quả Các thành phần phenolic và flavonoid, có trong các loài thuộc chi Panax L., cũng góp phần vào tác dụng chống oxy hóa Hơn nữa, các nghiên cứu trên các loài không thuộc chi Panax L cho thấy rằng thành phần saponin trong dịch chiết từ các loài thực vật khác cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh.
Nghiên cứu năm 2014 cho thấy dịch chiết saponin từ các phân đoạn của Radix Trichosanthis có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả qua phương pháp DPPH Tổng hàm lượng saponin trong dịch chiết các phân đoạn n-butanol, EtOAc, và hỗn hợp hai phân đoạn n-butanol và EtOAc lần lượt đạt 1,824, 1,678 và 2,3998 mg.
Giá trị IC 50 chống oxy hóa trong phương pháp DPPH của các phân đoạn Radix Trichosanthis lần lượt là 2,9246 ± 0,15, 2,8428 ± 0,11 và 4,3972 ± 0,23 mg/ml, cho thấy dịch chiết saponin từ các phân đoạn này có tác dụng chống oxy hóa mạnh Mặc dù Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng chứa hàm lượng saponin cao, nhưng chúng không thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh trong phương pháp DPPH.
Sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu so với các nghiên cứu trước có thể xuất phát từ điều kiện thí nghiệm và đối tượng nghiên cứu khác nhau Hàm lượng saponin trong các phân đoạn chiết khác nhau có thể thay đổi, và các saponin có cấu trúc khác nhau cũng mang lại tác dụng chống oxy hóa khác nhau Ngoài ra, các thành phần không phải saponin cũng có thể đóng góp vào hiệu quả chống oxy hóa.
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ các loài thuộc chi Panax L có tác dụng chống oxy hóa nhờ vào cả hợp chất phân cực và không phân cực Tuy nhiên, phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng cách quét gốc tự do DPPH có một số hạn chế Thay vào đó, phương pháp đánh giá qua sự khử màu ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) có thể áp dụng cho cả chất chống oxy hóa thân nước và thân dầu, được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác.
26] Khi đó, kết quả về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết thực vật có thể sẽ cao hơn khi sử dụng phương pháp này
3.2.2 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang