Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dược liệu bằng phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM). Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội.

TỔNG QUAN

Tổng quan về aflatoxin

Aflatoxin lần đầu tiên được phát hiện và phân lập vào năm 1960, sau sự kiện Bệnh Gà tây X tại Anh, gây chết hơn 100.000 con gà tây Nguyên nhân dẫn đến tình trạng hoại tử gan ở những con gà tây này là do chúng đã ăn phải lạc mốc chứa aflatoxin.

Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus

Nấm mốc có khả năng phát triển và sinh ra aflatoxin trong suốt quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến nông sản Nhiều loại nông sản như ngũ cốc, lúa gạo, các loại hạt có dầu như đậu, hạt hướng dương, bông, cũng như các gia vị như ớt, hạt tiêu, nghệ, gừng, và các thực phẩm như hạnh nhân, quả óc chó, sữa và sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát) có thể bị nhiễm aflatoxin.

Aflatoxin là một nhóm các chất dẫn xuất của difuranocoumarin, được tổng hợp qua con đường polyketide Hiện nay, đã có khoảng 20 loại aflatoxin được xác định, trong đó 6 loại quan trọng nhất bao gồm B1, B2, M1, M2, G1 và G2.

Aflatoxin B1 là loại aflatoxin độc hại và phổ biến nhất, chiếm từ 60-80% tổng lượng aflatoxin có trong thực phẩm Sự hiện diện của aflatoxin B1 thường đồng nghĩa với việc các loại aflatoxin khác như AFB2, AFG1 và AFG2 cũng sẽ xuất hiện.

Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ nhƣ cloroform, methanol, dimethyl sulfoxid Độ tan của aflatoxin trong nước vào khoảng 10–

20 mg/l Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể đưuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3]

Aflatoxin không thể bị phân hủy ở nhiệt độ nấu ăn thông thường, nhưng chúng sẽ bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng tử ngoại Cấu trúc của aflatoxin có vòng lacton nội phân tử, do đó chúng dễ bị phân hủy bởi các base mạnh Nếu tiếp tục acid hóa nhẹ, aflatoxin ban đầu có thể được tái tạo.

Aflatoxin có khả năng phát huỳnh quang mạnh, cho phép phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp, chỉ từ 0,5 ng hoặc ít hơn trên sắc ký đồ lớp mỏng Tính chất này là cơ sở hóa lý quan trọng cho việc phát hiện và định lượng các hợp chất aflatoxin.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bảng 1 1 Tính chất của một vài aflatoxin

STT Loại aflatoxin CTPT TLPT

(đvC) Tính chất CTCT TLTK

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 223; 265; 362 nm

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 243; 257; 264;

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

- Huỳnh quang màu xanh tím

Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi

Aspergillus is a genus of fungi that includes several species such as A flavus, A arachidicola, A bombycis, A minisclerotigenes, A nomius, A ochraceoroseus, A parasiticus, A pseudotamarii, and A rambellii Among these, A flavus and A parasiticus are the primary strains known for producing aflatoxin B1.

Aspergillus phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35°C và độ ẩm không khí trên 55%, với pH từ 3-10 trên các cơ chất giàu tinh bột Tuy nhiên, sự hiện diện của chủng nấm mốc sản sinh aflatoxin không nhất thiết đồng nghĩa với việc có aflatoxin, vì quá trình tổng hợp aflatoxin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.

 Điều kiện môi trường và cơ chất:

Nấm mốc cần các chất dinh dưỡng thiết yếu như năng lượng (thường từ tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và khoáng chất, trong đó Kẽm (Zn) đóng vai trò quan trọng Do đó, aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm chứa nhiều tinh bột và hạt có dầu như hạt bông và đậu nành với tỷ lệ nhiễm thấp hơn.

Nhiệt độ và độ ẩm đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành aflatoxin Theo nghiên cứu, nhiệt độ tối thiểu và tối đa cần thiết cho sự tổng hợp aflatoxin lần lượt là 12°C và một mức cao hơn.

Nhiệt độ tối ưu để hình thành aflatoxin dao động từ 25-35 độ C, trong khi nhiệt độ lý tưởng cho sự tổng hợp aflatoxin B1 là từ 24-28 độ C Độ ẩm cần thiết để nấm mốc sản sinh aflatoxin phải trên 62% Đối với nông sản chứa nhiều tinh bột, hàm ẩm tối đa cho việc tổng hợp aflatoxin là 18%, trong khi đối với quả và hạt có dầu, mức độ ẩm này chỉ khoảng 9-10%.

Khí hậu và điều kiện bảo quản đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm Các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm Việt Nam, thường có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao và lượng mưa nhiều, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của aflatoxin.

Trong năm, các sản phẩm nông nghiệp thường bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn ở các nước đang phát triển như Đông Nam Á và Châu Phi Điều này xảy ra do nền nông nghiệp chưa được hiện đại hóa và các điều kiện trồng trọt, bảo quản chưa đạt tiêu chuẩn, dẫn đến nguy cơ cao về sự xuất hiện aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dược liệu.

1.1.4 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

Trong số các loại aflatoxin thì AFB 1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm

AFB1 được chuyển hóa chủ yếu tại gan thành aflatoxin exo-8,9-epoxide hoặc AFM1 ít độc tính hơn nhờ enzyme cytochrome P450 Quá trình epoxide hóa AFB1 tạo ra nguy cơ đột biến gen và ung thư Aflatoxin exo-8,9-epoxide, với tính chất ái điện tử cao, liên kết mạnh mẽ với guanine trong DNA, tạo thành aflatoxin-N7-guanine Sự methyl hóa của aflatoxin-N7-guanine biến đổi G thành T, dẫn đến đột biến gen và có thể gây ra ung thư.

Aflatoxin exo-8,9-epoxide and its hydrated product, dihydrodiol, covalently bind to DNA and RNA, altering the structure and function of nucleic acids and proteins Additionally, aflatoxin exo-8,9-epoxide inhibits RNA polymerase and ribosomal translocase enzymes, impacting transcription and translation processes.

Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC- MS/MS)

(LC-MS/MS) 1.2.1 Sắc ký ái lực miễn dịch a) Sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng thuốc thử liên kết đặc biệt để phân tích và làm sạch các thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên tương tác thuận nghịch và chọn lọc giữa các cặp phân tử như kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, và hormone – receptor Để thực hiện sắc ký ái lực, một thành phần của cặp (phối tử - ái lực) được cố định trên chất mang rắn làm pha tĩnh trong cột Mẫu phân tích với thành phần thứ hai được đưa vào cột thông qua pha động với pH, lực ion và dung môi phù hợp, gọi là dung dịch đệm rửa giải.

Khi phân tích qua cột, các thành phần khác dễ dàng khuếch tán, chỉ có hai thành phần của cặp tương tác đặc hiệu liên kết với nhau Sử dụng dung dịch đệm rửa giải, liên kết này sẽ bị phá vỡ, cho phép thành phần chọn lọc với phối tử ái lực thoát ra khỏi cột Việc phát hiện và định lượng được thực hiện bằng một detector thích hợp.

Phối tử ái lực là các chất có tính đặc hiệu cao đối với chất phân tích, đóng vai trò quyết định trong thành công của kỹ thuật tách ái lực Chúng có thể được chiết xuất từ nguồn gốc sinh học như kháng thể và protein, hoặc từ nguồn gốc hóa học như boronat và phức càng cua kim loại.

Chất mang là các chất rắn được sử dụng để cố định phối lực ái tử trong cột sắc ký, với những chất phổ biến như agarose, agarose liên kết, cellulose và silica Sắc ký ái lực miễn dịch là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích sinh học, cho phép tách biệt và xác định các thành phần dựa trên sự tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên.

Sắc ký ái lực miễn dịch là một phương pháp sắc ký sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên làm phối tử ái lực Phương pháp này tận dụng tính đặc hiệu cao của tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên, cùng với khả năng tạo kháng thể từ nhiều loại chất khác nhau.

Sắc ký ái lực miễn dịch đã trở thành một công cụ quan trọng và phổ biến trong việc phân tích các chất có nguồn gốc sinh học tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch được ứng dụng hiệu quả trong việc tinh chế và làm giàu chất phân tích thông qua cột chiết pha rắn (SPE), mang lại nhiều ưu điểm nổi bật.

- Sử dụng ít dung môi

- Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích

- Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn

Nhƣợc điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng đƣợc một lần (kháng thể bị biến tính) [25]

1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật tách chất phân tích thông qua cột chứa hạt pha tĩnh, với tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha Sự ái lực của các chất với pha tĩnh và pha động quyết định thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột Thời gian lưu, được ghi lại bởi detector, phản ánh thời gian mà chất phân tích được rửa giải và phụ thuộc vào bản chất của chất cũng như thành phần của pha động và pha tĩnh.

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất gắn lên chất mang, thường là hạt hình cầu có đường kính từ 1,5–10 ϻm, giúp tách hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dẫn đến việc phân chia thành hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 )

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8 )

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi ít phân cực như hexan và iso propyl ether, trong khi đó, trong sắc ký pha đảo, pha động lại là các dung môi phân cực như nước, methanol và acetonitril.

Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]:

- Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký

Gradient là sự thay đổi tỷ lệ các thành phần dung môi pha động trong quá trình chạy sắc ký, giúp tối ưu hóa phân tích các mẫu đa thành phần với mức độ phân cực khác nhau Chế độ này không chỉ tăng cường khả năng rửa giải mà còn rút ngắn thời gian phân tích hiệu quả.

Khối phổ là một kỹ thuật phân tích cho phép đo tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu trong pha khí Các ion được tạo ra trong buồng ion hóa, sau đó được gia tốc và tách biệt bởi bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phát hiện Toàn bộ quá trình này diễn ra trong một hệ thống chân không với áp suất dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa.

Tín hiệu từ các ion được biểu thị qua các vạch (pic) với cường độ khác nhau, tạo thành một phổ khối Phổ khối này cung cấp thông tin định tính giúp xác định cấu trúc và định lượng các chất.

Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu:

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ

Bộ nạp mẫu là thiết bị quan trọng trong việc đưa mẫu vào máy phân tích, cần chuyển đổi mẫu từ dạng lỏng hoặc rắn sang dạng hơi Bộ nạp mẫu được chia thành hai nhóm chính: nạp mẫu trực tiếp và nạp mẫu gián tiếp Trong trường hợp nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu hoạt động như đầu ra của một thiết bị phân tích khác, thường được kết nối với các hệ thống như sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS) hoặc điện di mao quản (CE/MS).

Bộ nguồn ion trong máy khối phổ có nhiều phương pháp ion hóa phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Các kỹ thuật phổ biến bao gồm ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện và ion hóa bằng giải hấp Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật ion hóa bằng tia điện (ESI).

Đối tƣợng nghiên cứu

Nền mẫu giàu tinh bột như Cát căn, Trạch tả, và Hoài sơn có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao, vì vậy chúng tôi đã lựa chọn những dược liệu này để xây dựng quy trình định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) Các mẫu dược liệu được thu mua từ thị trường Hà Nội.

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu thu mua

STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu

Phố Lãn Ông 11 Trạch tả 3 Chợ Ninh

Phố Lãn Ông 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh

Phố Lãn Ông 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh

Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

Chuẩn Aflatoxin (Supelco, USA): AFB1 (Lot: LB04859); AFB2 (Lot:

LB04871); AFG1 ( Lot: LB02201); AFG2 (Lot: LB04861) dạng lỏng có nồng độ 1 ppm

- Các dung môi dùng cho LCMS: methanol, acetonitril của hãng Merck

- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích P.A

- Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorid (Merck, Đức)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hóa

- Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS 8045 của Shimadzu

- Cột sắc ký Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) của Shimadzu

- Máy lắc ngang HS 260 (IKA, Đức)

- Cột chiết pha rắn Aflatest chứa kháng thể đơn dòng (VICAM, Mỹ)

- Bộ dụng cụ chiết pha rắn Visiprep TM 24 (Supelco, Mỹ)

- Cân phân tích Mettle Toledo có độ chính xác 0,1mg (Mettle Toledo, Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g (Precisa Gravimetry, Thụy Sĩ)

- Pipet chính xác có thể điều chỉnh thể tích 10-100ϻL và 100-1000ϻL

- Ống ly tâm nhựa 50 mL

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu Cát căn, Trạch tả, hạt Sen để tiến hành nghiên cứu

- Thái mẫu, sấy mẫu dƣợc liệu ở nhiệt độ 50 o C đến khi độ ẩm đạt khoảng 5%

- Bảo quản trong túi kín cho tới khi đƣa vào nghiên cứu chiết xuất

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu

Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích:

- Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS)

- Tối ƣu hóa điều kiện sắc ký lỏng

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu đƣợc hàm lƣợng aflatoxin là lớn nhất

- Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC

2.3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu

- Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2018 – 20/04/2019

- Địa điểm lấy mẫu: chợ Ninh Hiệp, phố Lãn Ông

- Khối lƣợng mẫu: 0,5 kg/mẫu

- Dƣợc liệu đƣợc xay nhỏ, đựng trong túi nilon

- Bảo quản ở nơi thoáng mát

2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí

- Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS): Lựa chọn ion mẹ, ion con, các thế Q1, Q2, Q3 thích hợp để thu đƣợc tín hiệu phân tích cao nhất

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Thành phần pha động, chương trình gradient

Nghiên cứu tập trung vào phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu nhằm tối ưu hóa hàm lượng aflatoxin Quá trình này bao gồm việc khảo sát các thành phần dung môi chiết và dung môi loại tạp để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc thu hồi aflatoxin.

2.4.3 Quy trình thẩm định phương pháp 2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc

Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ: các tiền chất, các chất chuyển hóa, tạp chất

Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình

- Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ

Phương pháp xác nhận (confirmation method) là một công cụ hiệu quả để đảm bảo tính đặc hiệu trong các phương pháp phân tích Hội đồng châu Âu đã quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) cho các phương pháp khác nhau nhằm khẳng định chắc chắn sự hiện diện của một chất.

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lƣợng nhỏ nhất có thể đƣợc phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất trong mẫu thử mà có thể xác định được qua phương pháp khảo sát, đảm bảo kết quả đạt độ chính xác mong muốn.

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính này, minh họa sự phụ thuộc giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích.

Để xác định mối quan hệ giữa tín hiệu và nồng độ, cần đo các dung dịch chuẩn với nồng độ thay đổi Sau đó, vẽ đường cong thể hiện sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, và tiếp tục quan sát cho đến khi mối quan hệ không còn tuyến tính.

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và đƣợc biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

- xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i

- ̅ : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm

Số lần thử nghiệm (N) và độ chính xác của phương pháp là hai yếu tố quan trọng trong nghiên cứu Độ chính xác thể hiện mức độ gần gũi giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

The recovery rate, also known as accuracy assessment, is defined as the percentage ratio of the obtained value compared to the theoretical value.

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm LCSolution) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát điều kiện khối phổ

Kỹ thuật FIA (Flow injection analysis) là một phương pháp phân tích trong HPLC không cần cột sắc ký Kỹ thuật này được áp dụng để khảo sát phổ khối, trong đó dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 với nồng độ mỗi chất là 100 ppb được tiêm vào hệ thống khối phổ theo các điều kiện cụ thể.

+ Pha tĩnh: không lắp cột

+ Pha động: ACN: amoni acetat 10 mM (50:50, v/v) + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Điện áp giao diện -5kV được sử dụng trong chế độ ESI-positive cho thấy sự hiện diện của các ion mẹ [M+H]+ của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 với giá trị m/z lần lượt là 313,20; 315,20; 329,15 và 331,15 Những kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trước đó.

Hình 3.1 Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ

ESI-positive Sau đó tiếp tục áp dụng kỹ thuật FIA để tiến hành tối ƣu hóa điều kiện

Tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 với nồng độ 100 ppb cho mỗi chất trong quy trình MS/MS tự động Cài đặt thông số máy nhằm tối ưu hóa điều kiện phân mảnh cho hai ion con của từng chất.

Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số MS tối ƣu

TT Độc tố Ion mẹ

Hình 3.2 Phổ khối của ion con các aflatoxin

Trong phương pháp định lượng MRM, ion con có tín hiệu cao được sử dụng để xác định hàm lượng chất phân tích, trong khi ion con có tín hiệu thấp giúp xác nhận sự hiện diện của chất đó Kết quả tối ưu hóa cho thấy các ion con 241,05; 286,95; 243,10 và 313,00 được chọn để định lượng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2, trong khi các ion con 284,95; 259,20; 311,05 và 245,00 được sử dụng để định tính các độc tố tương ứng.

Khảo sát điều kiện sắc ký

Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng cột C18 là lựa chọn phổ biến để phân tích độc tố aflatoxin trong các phòng thí nghiệm Loại cột này sử dụng pha tĩnh với các hạt kích thước nhỏ (1,7 µm, 1,9 µm, ) và chiều dài cột ngắn, giúp nâng cao hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chỳng tụi lựa chọn cột Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) của Shimadzu để tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác

Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng đến quá trình tách các chất mà còn tác động đến ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Kỹ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương cho thấy quá trình ion hóa tăng cường khi có sự hiện diện của các chất như acid acetic, acid formic và amoni acetat Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng amoni acetat thường được lựa chọn để phân tích các aflatoxin.

- Các điều kiện sắc ký đƣợc giữ cố định nhƣ sau:

+ Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Điều kiện khối phổ được thiết lập theo chế độ quan sát MRM, sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 với nồng độ mỗi chất là 10 ppb Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động bằng hai chương trình gradient khác nhau.

Bảng 3.2 Một số chương trình gradient khảo sát

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3 3 Sắc ký đồ chương trình gradient 1

Hình 3 4 Sắc ký đồ chương trình gradient 2

Nhận xét : Với chương trình gradient 1, píc bị chẻ píc và kéo đuối Với chương trình gradient 2, píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 tương đối

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU emphasizes the importance of a balanced and streamlined approach to minimize pixelation issues Consequently, we have opted for the gradient 2 program to conduct further investigations.

Bảng 3 3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2

Thông số AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

Hệ số đối xứng (A s) 1,077 1,121 1,082 1,203 t R (phút) 3,130 3,038 3,040 2,940

Nhƣ vậy, chúng tôi đã khảo sát đƣợc điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ nhƣ sau: Điều kiện khối phổ:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Trong các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ hỗn hợp methanol : nước thường được sử dụng là 80 : 20 hoặc 75 : 25 để phân tích aflatoxin Nghiên cứu này nhằm khảo sát các dung môi chiết mẫu khác nhau để xác định điều kiện phù hợp cho phòng thí nghiệm.

Quy trình xử lý mẫu bao gồm các bước sau: Cân chính xác 25 g dược liệu vào bình nón 250 ml, sau đó thêm 5 g NaCl Tiếp theo, thêm 100 ml dung môi chiết methanol và nước với hai tỷ lệ khảo sát là 80:20 và 60:40.

Lắc ngang mẫu trong 30 phút để thu dịch lọc Sau đó, lấy 10 ml dịch lọc và pha loãng với 40 ml nước, tiếp theo ly tâm để thu dịch lọc Tiếp tục lấy 10 ml dịch lọc mẫu và cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS, sau đó rửa giải bằng 1 ml methanol Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,22 để thu được dung dịch sắc ký.

Cả 2 khảo sát đều đƣợc tiến hành thêm chuẩn hỗn hợp AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb Kết quả được đánh giá trên hiệu suất thu hổi so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau

TT Độc tố Dung môi chiết

Nhận xét: Khi tiến hành thay đổi dung môi chiết, hiệu suất thu hồi của

AFB1 có sự thay đổi không đáng kể, trong khi AFB2, AFG1 và AFG2 cho hiệu suất thu hồi cao hơn khi sử dụng dung môi chiết MeOH : nước (80 : 20) Do đó, để đạt được hiệu suất thu hồi tối ưu, chúng tôi đã chọn dung môi MeOH : nước.

(80 : 20) để tiến hành các khảo sát tiếp theo

3.3.2 Khảo sát dung môi làm sạch

Trong quá trình làm sạch dịch chiết bằng cột ái lực miễn dịch SPE-IM, dung môi làm sạch đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất thu hồi các chất phân tích Chúng tôi đã khảo sát các dung môi như dung dịch đệm PBS, MeOH : H2O (5 : 95) và MeOH (10 : 95) Mẫu được xử lý theo mục 3.3.1, trong đó dịch lọc trước khi làm sạch bằng cột SPE-IM được bổ sung chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 với nồng độ khoảng 5 ppb Kết quả thu được được đánh giá dựa trên hiệu suất thu hồi của chất phân tích so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng, và được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch

TT Độc tố Dung môi làm sạch

Kết quả cho thấy, khi sử dụng dung môi làm sạch MeOH : H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần, hiệu suất thu hồi giảm Do đó, chúng tôi quyết định chọn dung dịch PBS làm dung môi làm sạch.

Thẩm định phương pháp

Để xác định tính chọn lọc của sắc ký khối phổ, chúng tôi áp dụng phương pháp xác nhận Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng) cho sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS).

MS/MS) là 4 Tức là cần có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con

Bảng 3.6 Ion mẹ và ion con của aflatoxin

[M+H] + Ion con Vai trò Số điểm IP

Phương pháp được xác định có tính đặc hiệu cao thông qua việc phân tích mẫu trắng, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn Kết quả cho thấy mẫu trắng không chứa các mảnh m/z của chất phân tích Trên sắc đồ mẫu thử, các píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 xuất hiện với thời gian lưu trùng khớp với mẫu chuẩn, khẳng định tính đặc hiệu của phương pháp.

A Mẫu thử thêm chuẩn B Mẫu chuẩn

Để đánh giá tính phù hợp hệ thống của phương pháp, chúng tôi đã thực hiện sắc ký 6 lần với dung dịch hỗn hợp chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ 5 ppb Các điều kiện đã được khảo sát kỹ lưỡng Thời gian lưu và diện tích píc tương ứng được ghi lại và kết quả được trình bày trong Bảng 3.7.

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 t R (phút)

Kết quả phân tích cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu của các aflatoxin nhỏ hơn 5,0%, chứng tỏ rằng các điều kiện sắc ký và hệ thống LC-MS/MS được sử dụng là phù hợp, đảm bảo độ ổn định trong việc phân tích định lượng aflatoxin.

3.4.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đường chuẩn Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn aflatoxin với khoảng nồng độ từ 0,1 – 10 ppb

Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã khảo sát, ghi nhận tín hiệu píc và xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ aflatoxin được trình bày trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất

Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin được đánh giá thông qua hệ số tương quan R² Kết quả trong Bảng 3 cho thấy R² lớn hơn 0,99, cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao, đảm bảo cho việc phân tích định lượng các aflatoxin.

3.4.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Để đánh giá LOD và LOQ của phương pháp, chúng tôi thêm chuẩn vào mẫu thử không chứa chất phân tích sao cho mức nồng độ cuối cùng ở mức 5 ppb Sau đó tiến hành pha loãng trên nền mẫu thực không chứa chất phân tích và phân tích đến khi thu đƣợc chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền Từ đó xác định LOD và LOQ Kết quả thu được như Bảng 3.9 y = 18795x + 1434.6 R² = 0.9949

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFB1 y = 8891.2x + 4015.3 R² = 0.9967

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn AFB2 y = 18475x + 63.89 R² = 0.9989

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG1 y = 11779x - 3717.8 R² = 0.9956

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG2

Bảng 3.9 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp

3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hôi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 50, 100,

Nồng độ 150 ng/mL (tương ứng với 500, 1000, 1500 àg/kg trên mẫu) đã được phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ Kết quả tính độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi được trình bày chi tiết trong bảng 3.12.

Bảng 3.10 Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dƣợc liệu

Mẫu Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

2,5 àg/kg tương ứng 1,25 ppb

TT-1 1,21 1,12 1,33 1,26 96,8 89,6 106,4 100,8 TT-2 1,20 1,41 1,35 1,35 96,0 112,8 108,0 108,0 TT-3 1,19 1,02 1,05 1,37 95,2 81,6 84,0 109,6 TT-4 1,35 1,11 1,43 1,09 108,0 88,8 114,4 87,2 TT-5 1,09 1,09 1,11 1,13 87,2 87,2 88,8 90,4 TT-6 1,42 1,31 1,34 1,39 113,6 104,8 107,2 111,2

5 àg/kg tương ứng 2,5 ppb

TT-1 2,32 2,43 2,47 2,33 92,8 97,2 98,8 93,2 TT-2 2,46 2,16 2,59 2,34 98,4 86,4 103,6 93,6 TT-3 2,39 2,33 2,23 2,17 95,6 93,2 89,2 86,8 TT-4 2,22 2,37 2,34 2,29 88,8 94,8 93,6 91,6 TT-5 2,09 2,19 2,21 2,47 83,6 87,6 88,4 98,8 TT-6 2,04 2,12 2,25 2,52 81,6 84,8 90,0 100,8

7,5 àg/kg tương ứng 3,75 ppb

TT-1 3,71 3,65 3,47 3,44 98,9 97,3 92,5 91,7 TT-2 3,55 3,45 3,79 3,67 94,7 92,0 101,1 97,9 TT-3 3,35 3,49 3,55 3,73 89,3 93,1 94,7 99,5 TT-4 3,79 3,67 3,89 3,53 101,1 97,9 103,7 94,1 TT-5 3,42 3,51 3,65 3,69 91,2 93,6 97,3 98,4 TT-6 3,84 3,93 3,74 3,45 102,4 104,8 99,7 92,0

Theo quy định của AOAC, phần trăm tìm lại ở nồng độ 1 – 5 àg/Kg đạt từ 40 – 120%, với RSD(%) ≤ 30 Kết quả thu được cho thấy độ chính xác từ 81,6% đến 113,6% và RSD(%) dao động từ 3,56% đến 11,61%.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt khi phân tích các aflatoxin trong dƣợc liệu

3.5 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong dược liệu Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột thu mua trên thị trường Hà Nội Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần độc lập Kết quả nhƣ Bảng 3.11

Bảng 3.11 Kết quả hàm lƣợng aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột

STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu

17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-)

*Ghi chú: (-) : Không phát hiện chất phân tích

Kết quả khảo sát cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu thu mua tại Hà Nội không phát hiện aflatoxin Tuy nhiên, mẫu YD4 từ chợ Ninh Hiệp có chứa AFB1 và AFG1 với hàm lượng lần lượt là 0,37 và 0,60 àg/kg.

Nhóm nghiên cứu đã phát triển và kiểm định phương pháp định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) trong dược liệu thông qua quy trình phân tích cụ thể.

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 25 g dược liệu vào bình nón 250 ml, sau đó thêm khoảng 5 g NaCl và 100 ml dung môi chiết methanol: nước với tỷ lệ 80:20 Tiến hành lắc ngang trên máy lắc ngang trong 30 phút để đảm bảo hòa tan đều.

Tiêu đề	Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Aflatoxin Trong Dược Liệu Bằng LC-MS/MS
Tác giả	Hà Anh Tuấn
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Phương, TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	1,98 MB