Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 – acetat trong dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu Trạch tả. Mời các bạn cùng tham khảo!
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.)
Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ
Alismataceae, chi Alisma, có tên khoa học đồng nghĩa khác là Alisma plantago – aquatica Ở Việt Nam, Trạch tả còn được gọi là thủy đề, mã đề nước [4]
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo có chiều cao từ 40-50 cm, với thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, màu trắng và nạc Lá cây có cuống dài, bẹ to xếp chồng lên nhau, tạo thành hình hoa thị Phiến lá có dạng hình trái xoan hoặc hình trứng, với mép nguyên lượn sóng và gân lá 5-7 hình cung.
Cụm hoa hình chùy mọc trên một cán thẳng dài có thể lên đến 1m, với nhiều vòng hoa xếp tầng nhỏ dần về phía ngọn Mỗi tầng hoa phân nhánh thành các chùy nhỏ, hoa lưỡng tính có màu trắng hoặc hồng, với đài hoa có 3 răng màu lục tồn tại cho đến khi quả hình thành Tràng hoa gồm 3 cánh, có một cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm Số lượng nhị từ 6 đến 9, có hình dẹt, bầu hoa nhiều ô xếp thành vòng, mỗi ô chứa một noãn, trong khi vòi nhụy mảnh và dễ rụng.
Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại
Chi Alisma L gồm khoảng 10 loài, phân bố từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới và ôn đới ẩm, với Trạch tả phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam Hai loài được sử dụng làm thuốc là Trạch tả (A plantago-aquatica L.) và A canaliculatum Tại Việt Nam, Trạch tả chủ yếu được trồng ở các tỉnh Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương và Hưng Yên.
Dược liệu Trạch tả được lấy từ thân rễ của cây Trạch tả, thường được thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng Sau khi thu hoạch, cần loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài, rửa sạch và sau đó phơi hoặc sấy khô để bảo quản.
Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]
Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56]
1.1.4 Thành phần hóa học Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ
Theo các nghiên cứu trước đây, terpenoid là thành phần chính trong Trạch tả, với triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat) là các hợp chất đặc trưng Ngoài ra, Trạch tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của thân rễ Trạch tả còn hạn chế Trong nghiên cứu của Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, nhóm tác giả đã phân lập được bảy chất, bao gồm alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca-9,12-dienoic acid và octadeca-9,12-dienoic acid methyl ester.
Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong rễ Trạch tả Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc
Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol
A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả
[30] Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31] Alisol O (7) và alisol P
(8) được phân lập năm 2008 [53] Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]
(1) AA OH OH OH OH H O
(2) alisol A 24 – acetat OH OH OH OH O O
(5) alisol E OH OH OH OH H O
Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định Năm
1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi
Nakajima và cộng sự [32] Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ
(12) oriediterpenoside Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.3 Các sequiterpenoid
Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm: guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane
Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]
Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D (16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B
(18), C, D) [45] [46] Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol
(20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32] Năm 2001, orientalol E (21) thuộc nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]
(14) Alismoxide CH3 OH OH CH3
(17) Orientalol A OH OH OH CH3
(18) Sulfoorientalol B HSO3 OH OH CH3
(19) 10-O-methyl-alismoxit OCH3 OH OH OCH3
(20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol (21) orientalol E Hình 1 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả
Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein, calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24]
Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39] Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]
Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như:
1.1.5 Một số tác dụng dƣợc lý
Trạch tả, một vị thuốc cổ truyền Trung Hoa, đã được sử dụng để điều trị thiểu niệu từ lâu Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg có khả năng làm tăng lượng nước tiểu, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn so với hydrochlorothiazide Đặc biệt, một nghiên cứu trên chuột Sprague-Dawley chỉ ra rằng dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg), nhưng lại làm giảm đáng kể lượng nước tiểu ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg).
Nghiên cứu cho thấy rằng các dịch chiết n-butanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) có tác dụng làm tăng lượng nước tiểu, trong khi dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800 mg/kg) lại làm giảm lượng nước tiểu Điều này chỉ ra rằng tác động sinh học của các dịch chiết Trạch tả lên thận có sự khác biệt tùy thuộc vào hàm lượng, vì vậy cần chú ý đến liều lượng khi áp dụng trong lâm sàng.
Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2017) đã đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần tối ưu cho hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate với tỷ lệ 7.2: 0.6: 2.8: 3.0.
Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley đã chứng minh tác dụng hạ lipid máu của alisol A 24-acetat với liều 425 mg/kg Nghiên cứu gần đây trên chuột có tình trạng tăng lipid máu cho thấy Trạch tả với liều 2,26 g/kg/ngày có khả năng giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, đồng thời làm tăng nồng độ HDL huyết thanh Điều này cho thấy Trạch tả có thể giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì tăng cường quá trình chuyển hóa cholesterol.
Nghiên cứu trên chuột đột biến gen apoE cho thấy Trạch tả và simvastatin ở liều gấp 10 lần so với liều dùng cho người có hiệu quả điều trị đáng kể đối với bệnh xơ vữa động mạch, bằng cách giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL.
Trạch tả có khả năng giảm cholesterol ở chuột, giúp ngăn ngừa tăng lipid máu Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện tại còn hạn chế, nên việc ứng dụng trong điều trị lâm sàng vẫn chưa được xác định rõ ràng.
Trạch tả đã được sử dụng từ lâu trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tiểu đường Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại protostane có khả năng hạ đường huyết bằng cách ức chế hoạt động α-glucosidase và thúc đẩy hấp thu glucose mà không làm tăng adipogenesis như thiazolidinediones Tuy nhiên, các thử nghiệm hiện tại chỉ được thực hiện trên in vitro và cần nghiên cứu thêm trên cơ thể người để có thể áp dụng trong lâm sàng.
Ức chế hình thành sỏi thận
Nghiên cứu dược lý hiện đại đã chứng minh rằng triterpenoids có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận, với một thí nghiệm trên chuột cho thấy sau 4 tuần điều trị 0,5 mL/kg, hàm lượng canxi trong mô thận và lượng canxi bài tiết trong nước tiểu giảm rõ rệt Ngoài ra, nghiên cứu của Cao và cộng sự cũng chỉ ra rằng việc sử dụng 1 mL/ngày các thành phần hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm giảm sự hình thành canxi oxalate ở thận.
Nghiên cứu của Kubo và cộng sự từ năm 1997 đã chỉ ra rằng dịch chiết methanol từ Trạch tả với liều 50 mg/kg và 200 mg/kg có tác động tích cực đến hệ miễn dịch ở chuột, đặc biệt là trong trường hợp bệnh nhân có hiện tượng arthus Kết quả cho thấy dịch chiết Trạch tả ảnh hưởng đến các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III.
Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat
1.2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA
Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy – methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one
Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 91 0 C
- Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol
Nghiên cứu sơ bộ cho thấy rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra các dẫn xuất tiềm năng chống lại virus viêm gan B (HBV) Đã tổng hợp 40 dẫn xuất của AA và khảo sát ảnh hưởng của chúng đối với virus HBV in vitro, trong đó 14 chất được xác định là tiềm năng Hợp chất 6a cho thấy hoạt tính cao, đặc biệt là trong việc ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt với IC50 là 0,024 mM và kháng nguyên HBV e với IC50 là 0,028 mM, cho thấy chỉ số an toàn cao (SIHBsAg > 108, SIHBeAg > 93).
Các thử nghiệm trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23 và A24 có hoạt tính cao trong việc ức chế sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV, với giá trị IC50 lần lượt là 0,0048 mM, 0,0044 mM và 0,014 mM Đồng thời, các hợp chất này cũng cho thấy khả năng ức chế kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng là 0,011 mM, 0,012 mM và 0,018 mM.
> 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156 Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F@,9%) [51]
Nghiên cứu của Ma và cộng sự (2016) đã chỉ ra rằng AA có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với các chủng Gram dương như Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, với giá trị MIC dao động từ 12,5 đến 100 mg/mL.
Nghiên cứu của Kubo và cộng sự (1997) cho thấy rằng hàm lượng AA 0,05mmol/kg và 0,2mmol/kg có tác động tích cực đối với bệnh nhân có hiện tượng arthus.
1.2.2 Tổng quan về alisol B 23 – acetat
1.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23
Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3- [(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-
1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl] acetate
Tên thông thường: alisol B 23 - acetat
1.2.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý
Nghiên cứu của Chen và cộng sự chỉ ra rằng ở bệnh nhân thận mãn tính, sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/β-catenin gây tổn thương tế bào biểu mô ống thận Tuy nhiên, tình trạng này đã được cải thiện khi áp dụng liệu pháp với AB23.
Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột
Nghiên cứu cho thấy NASH được gây ra khi chuột ăn chế độ thiếu methionine và choline trong 4 tuần, sau đó thu thập mẫu máu và gan Kết quả cho thấy việc điều trị với AB23 giúp giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó giảm nguy cơ viêm và xơ gan.
Nghiên cứu cho thấy AB23 có tác dụng bảo vệ gan và chống ứ mật do 17α-ethinylestradiol (EE) gây ra Cụ thể, AB23 giảm tổng hợp acid mật bằng cách ức chế gen Cyp7a1 và Cyp8b1, đồng thời tăng cường chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1.
AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17]
Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng
Năm 2016, Zhang và cộng sự đã sử dụng xét nghiệm MTT kết hợp với phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư buồng trứng sau khi điều trị bằng AB23 Kết quả cho thấy AB23 có khả năng ức chế đáng kể biểu hiện của ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, làm giảm mức độ protein CDK4, CDK6 và cyclin D, từ đó ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1 Hơn nữa, AB23 còn ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư buồng trứng.
Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21], ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian P- glycoprotein [41]…
Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong
TLTK Đối tƣợng phân tích Điều kiện phân tích
[55] AA, alisol A 24- acetate và AB23
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
+ Nhiệt độ cột: 35 O C + Thể tớch tiờm mẫu: 10àL
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C 18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 208 nm + Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút + Nhiệt độ cột: 25 O C
[22] AB23 - Dung môi chiết: ACN
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C 18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (75:25)
+ Bước sóng phát hiện: 215 nm
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Trạch tả còn rất ít
Nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) đã tiến hành phân lập và xác định bảy chất từ mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp Các chất được xác định bao gồm alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca-9,12-dienoic acid và octadeca-9,12-dienoic acid methyl ester.
AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]
1.3.3 Tiêu chuẩn về dƣợc liệu Trạch tả trong một số Dƣợc điển
Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…
Dược điển Trung Quốc (2015) quy định sử dụng HPLC để định lượng
AB23 được chiết xuất từ thân rễ Trạch tả bằng phương pháp siêu âm Quy trình thực hiện bao gồm việc sử dụng 0,5 g mẫu dược liệu với 25 ml ACN trong thời gian 30 phút Hệ dung môi pha động được sử dụng là ACN:W theo tỷ lệ 73:27 (v/v), với detector UV hoạt động ở bước sóng 208nm và cột C18.
Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23 tính theo mẫu khô kiệt [9]
Dược điển Hồng Kông cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong
30 phút Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút Pha động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải:
Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông
Dược điển Hồng Kông cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082% alisol B monoacetat [38]
Chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV) hiện chưa quy định chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính, chỉ đưa ra các tiêu chí thông thường như độ ẩm, tro toàn phần và tro không tan trong acid Do đó, tài liệu này không thể đánh giá chính xác chất lượng dược liệu Trạch tả tại Việt Nam cũng như các mẫu nhập khẩu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 3/2018 Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả tại một số cơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã xây dựng
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu
Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu
1 M1 Vũ Thị Bình 30 Lãn Ông
2 M2 Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông
3 M3 Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông
5 M5 Phan Thị Tý 63A Lãn Ông
2.1.2 Hóa chất và dung môi
Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%
Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%
Các dung môi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết của hãng Merck
Các dung môi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết phân tích
2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)
Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)
Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45) Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15- LC)
Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5)
Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu bao gồm các thiết bị chính như bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A và bộ phận ổn nhiệt CTO-20A.
Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng
- Khảo sát hệ dung môi pha động
2.2.2 Định lƣợng AA bằng HPLC
2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng
+ Dung môi chiết + Tỷ lệ dung môi chiết
2.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp
- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
- Tính thích hợp hệ thống
2.2.3 Phân tích mẫu thực Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính AA và AB23; định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng
Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với
Sử dụng 30 ml methanol (MeOH) trong 30 phút, sau đó lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm Tiến hành cô cạn dung môi và hòa tan cặn trong 1 ml MeOH, thu được dịch để thực hiện chấm sắc ký lớp mỏng.
- Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH
- Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml
- Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254
- Pha động: Để tìm được hệ dung môi phù hợp, cho các vết tách biệt nhau trên bản
Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)
Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)
Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) + Định tính AB23:
Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)
Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)
Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)
- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol
2.3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC 2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử:
Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả cho vào ống ly tâm 50 ml, sau đó thêm khoảng 25 ml EtOH Tiến hành siêu âm trong 30 phút và lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc AA, cần cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn AA và hòa tan trong khoảng 5 ml MeOH Kết quả sẽ tạo ra dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml Sau đó, tiến hành pha loãng để tạo ra các dung dịch chuẩn trung gian với nồng độ phù hợp.
2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát chương trình pha động được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi ACN (kênh A) kết hợp với H2O (kênh B) ở các tỷ lệ khác nhau để đánh giá hiệu quả của quá trình rửa giải.
Các kết quả khảo sát cho thấy thời gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (RS) và hệ số kéo đuôi của pic (AS) đều được đánh giá và so sánh Độ phân giải (RS) đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5, trong khi hệ số kéo đuôi (AS) nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5 Thời gian lưu (tR) của các chất phân tích không được quá dài nhưng cần đảm bảo rằng chúng được tách biệt rõ ràng.
2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là EtOH, hỗn hợp MeOH : H O với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi
Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết là bước quan trọng để xác định dung môi phù hợp Việc tiến hành chiết với các thể tích dung môi khác nhau giúp lựa chọn thể tích chiết tối ưu, từ đó nâng cao hiệu quả chiết xuất.
- Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút, 90 phút
2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Tính chọn lọc là khả năng đánh giá chính xác chất cần phân tích, ngay cả khi có sự hiện diện của các thành phần khác như tạp chất hoặc chất cản trở.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện qua sắc ký đồ từ mẫu chuẩn và mẫu phân tích thêm chuẩn Để đảm bảo độ chính xác, pic của chất cần phân tích phải hoàn toàn tách biệt với các pic tạp.
Tiến hành chạy sắc ký cho mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng theo chương trình đã chọn Ghi nhận các thông số quan trọng như thời gian lưu và diện tích pic để đảm bảo tính chính xác trong phân tích.
Thời gian lưu của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng cần phải tương đương để đảm bảo tính chính xác Đồng thời, pic AA trong mẫu thử phải được tách biệt hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống phân tích có thể nhận diện tín hiệu có ý nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền, tuy nhiên vẫn chưa đủ để tiến hành định lượng.
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể được xác định bằng phương pháp khảo sát, đảm bảo kết quả đạt độ chính xác mong muốn.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10
Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích
Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích xác định nồng độ mà tại đó tín hiệu đo được có mối quan hệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích.
Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn với nồng độ thay đổi để khảo sát sự phụ thuộc giữa tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa tín hiệu và nồng độ, quan sát sự thay đổi cho đến khi không còn tính tuyến tính Khoảng tuyến tính được xác định từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) đến giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích, và được đánh giá thông qua giá trị R², với yêu cầu 0,99 ≤ R² ≤ 1.
Tính thích hợp hệ thống:
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị và ghi lại các giá trị thời gian lưu cùng diện tích pic Độ tương thích của hệ thống được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích, với yêu cầu giá trị thời gian lưu và diện tích pic của AA có RSD ≤ 2%.
THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Định tính AA và AB23 bằng TLC
Chuẩn bị mẫu: mẫu thử và mẫu đối chiếu được chuẩn bị như mục
Để tiến hành thí nghiệm, chấm riêng biệt 5 µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu lên bản mỏng Sau khi hoàn tất, để khô bản mỏng ngoài không khí, sau đó phun dung dịch thuốc thử lên bề mặt Cuối cùng, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 105 độ C trong 5 phút.
Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử
Khảo sát hệ dung môi pha động:
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:
Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)
Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)
Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)
Kết quả: Sắc ký đồ định tính AB23 trong Trạch tả được trình bày như hình 3.1
Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366
Quan sát dưới ánh sáng thường
Kết quả định tính TLC cho thấy chất AB23 có giá trị Rf trong khoảng 0,16 – 0,6 với ba hệ dung môi khảo sát Tuy nhiên, không phát hiện vết AB23 tương ứng trong mẫu thử, điều này chứng tỏ các mẫu Trạch tả không chứa thành phần AB23 Do đó, chúng tôi đã chọn hệ dung môi A để định tính thành phần AB23 trong các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường.
Khảo sát hệ dung môi pha động:
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:
Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)
Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)
Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1)
Kết quả: Sắc ký đồ định tính AA trong Trạch tả được trình bày như hình 3.2
Hình 3.2 Khảo sát định tính AA
Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366
Quan sát dưới ánh sáng thường
Trong các hệ dung môi được khảo sát, hệ dung môi B cho giá trị Rf của AA đạt khoảng 0,4 và có vết tách biệt rõ ràng khỏi các vết khác Do đó, chúng tôi đã quyết định sử dụng hệ dung môi pha động hexan: aceton (1,5:1) (v/v) để tiến hành sắc ký.
Sau khi tiến hành khảo sát và tham khảo tài liệu, chúng tôi đã phát triển phương pháp định tính AB23 và AA thông qua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng với các điều kiện được xác định cụ thể.
- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)
- Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 1 mg chất chuẩn AB23, AA tương ứng hòa tan trong khoảng 2 ml methanol
Để chuẩn bị dung dịch thử, cân khoảng 1 g dược liệu đã được tán nhỏ và tiến hành chiết siêu âm với 30 ml MeOH trong 30 phút Sau đó, lọc dung dịch qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH Dịch này sẽ được sử dụng để chấm sắc ký lớp mỏng.
Định tính AB23: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v)
Định tính AA: hexan: aceton (1,5:1) (v/v)
Để tiến hành thử nghiệm, trước tiên hãy đưa lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch thử và 5 μl dung dịch chất đối chiếu Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra và để khô ngoài không khí ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol lên bản mỏng và sấy ở 105 o C trong vài phút Cuối cùng, quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 và ánh sáng thường để phân tích kết quả.
Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử, cần có vết có màu sắc và giá trị Rf giống hệt với vết của dung dịch chất đối chiếu.
3.1.3 Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả
Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu Trạch tả
Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả
Quan sát dưới đèn UV 366 Quan sát dưới ánh sáng thường
- M1 – M7: Các mẫu thử dược liệu Trạch tả, lần lượt từ M1 – M7
- C: Mẫu chất đối chiếu AB23
- C’: Mẫu chất đối chiếu AA
Trên sắc ký đồ của các mẫu M1 – M7, các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AA được ghi nhận Ngược lại, không có vết nào có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AB23 Do đó, có thể tạm kết luận rằng chỉ có sự hiện diện của AA trong các mẫu này.
Định lượng AA bằng HPLC
Từ kết quả thu được trong mục 3.1.3 Nhận thấy có thể lựa chọn alisol
A làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng alisol A trong dược liệu Trạch tả
Dựa vào các nghiên cứu trước đây [22,54,55], cột C18 thường được sử dụng để định lượng AA trong Trạch tả Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn cột Eclipse XDB-C18 (4,6mm x 250nm, 5µm) để phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện tại.
3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động
Một số điều kiện sắc ký cố định:
- Cột Elipse XDB – C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 àm)
- Pha động: Acetonitril (ACN) và nước (H 2 O)
- Bước sóng phát hiện: 210 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được chuẩn bị như mục 2.3.2.1
Tiến hành khảo sát pha động là hệ dung môi ACN : H2O và thay đổi tỷ lệ giữa 2 thành phần theo 3 chương trình dung môi:
- Chương trình dung môi 1: ACN : H 2 O (80:20)
- Chương trình dung môi 2: ACN : H 2 O (70:30)
- Chương trình dung môi 3: ACN : H 2 O (60:40) Kết quả thu được trong hình 3.5
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động
Với chương trình dung môi 1 và 2 ta thấy AA được rửa giải sớm (tR 5,045 và 6,508) Với chương trình dung môi 2, pic AA rửa giải muộn hơn (tR
Chúng tôi đã tách hoàn toàn pic 9,676 khỏi các pic khác, tạo ra một pic gọn gàng và cân đối với hệ số kéo đuôi A S = 1,262 Độ phân giải của pic AA so với các pic liền kề đạt R S > 2,5, do đó chúng tôi quyết định sử dụng chương trình dung môi 3 cho phương pháp định lượng.
3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.3.1 Khảo sát dung môi chiết
Chúng tôi đã tiến hành chiết xuất trên cùng một nền mẫu phân tích theo quy trình dự kiến, sử dụng dung môi EtOH và MeOH: H2O với các tỷ lệ khác nhau Mỗi loại dung môi được phân tích lặp lại 3 lần bằng phương pháp HPLC theo điều kiện đã thiết lập, từ đó tính toán kết quả trung bình Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Dung môi (g) Diện tích pic
Khi sử dụng hỗn hợp dung môi chiết MeOH 80% (v/v), hàm lượng AA thu được đạt mức cao nhất, vì vậy chúng tôi đã chọn dung môi này để chiết xuất AA khỏi mẫu phân tích.
3.2.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Thực hiện chiết siêu âm theo quy trình đã nêu, sử dụng dung môi chiết MeOH 80% với ba thể tích khác nhau: 25ml, 50ml và 100ml Kết quả khảo sát chi tiết được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Thể tích dung môi chiết (ml) (g) Diện tích pic
Kết quả khảo sát cho thấy, chiết xuất với 25 ml MeOH 80% mang lại hàm lượng axit amin (AA) cao nhất Do đó, chúng tôi quyết định chọn thể tích dung môi chiết là 25 ml để tối ưu hóa hàm lượng AA.
3.2.3.3 Khảo sát thời gian chiết
Trên cùng một nền mẫu, tiến hành chiết siêu âm với 25ml MeOH 80% với thời gian chiết thay đổi: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút và 90 phút
Quy trình tương tự như mục 2.3.2.1 Phân tích lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết (phút) (g) Diện tích pic
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng AA trong mẫu tăng lên khi thời gian chiết dài hơn Tuy nhiên, khi thời gian chiết đạt 40 phút, sự thay đổi hàm lượng AA trở nên không đáng kể.
Do đó chúng tôi lựa chọn quy trình chiết siêu âm 30 phút để chiết AA ra khỏi nền mẫu
3.2.3.4 Quy trình xử lý mẫu đƣợc lựa chọn
Dựa trên kết quả khảo sát về dung môi chiết, tỷ lệ dung môi và thời gian chiết, chúng tôi đã xác định quy trình xử lý mẫu tối ưu cho phương pháp định lượng AA trong thân rễ Trạch tả.
Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng
Trong quá trình phân tích, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 3 mẫu bao gồm mẫu trắng, dung dịch AA chuẩn và dung dịch mẫu thử Kết quả đánh giá được thể hiện qua sắc ký đồ tương ứng, như được trình bày trong hình 3.7.
Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào ống ly tâm 50 ml
Dịch chiết Thêm chính xác 25 ml
Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu của AA trong mẫu thử và mẫu chuẩn tương đương, đồng thời pic AA không trùng với các pic khác, điều này chứng tỏ phương pháp và hệ thống sắc ký có độ đặc hiệu cao.
3.2.4.2 Tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.4, với kết quả đánh giá dựa trên giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn AA có nồng độ 104,2 àg/ml Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc lần lượt là 0,028% và 0,415%, đều dưới 2%, cho thấy rằng các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp, đảm bảo tính ổn định.
3.2.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Mẫu thử được phân tích để xác định nồng độ AA, sau đó tiến hành pha loãng cho đến khi đạt tỷ lệ S/N = 3 – 4 trên sắc ký đồ tại thời gian lưu của AA Từ đó, xác định được LOD Mỗi mẫu được lặp lại ba lần và kết quả trung bình được ghi nhận.
Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD
Tại nồng độ 0,17 àg/ml, tỷ lệ S/N = 3 – 4
Với kết quả này chúng tôi xác định:
Giới hạn phỏt hiện: LOD = 0,17 àg/ml
Giới hạn định lượng: LOQ = LOD x 3,3 = 0,51 àg/ml
3.2.4.4 Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính
Chuẩn bị dãy dung dịch AA chuẩn với nồng độ từ 4,17 àg/ml đến 416,8 àg/ml và tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện khảo sát trong mục 3.2.2 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ AA được trình bày chi tiết trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AA
Datafil e Nam e:LOD-0.1667-20ul-002.lcd Sam pl e Nam e:thu Sam pl e ID:01
Hình 3.9 Đường chuẩn của AA
Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 12779x – 6729,6 (R² = 1)
Ký hiệu: x: nồng độ alisol A (àg/ml) y: diện tích pic (mAU.s)
Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R
Kết quả đánh giá đường chuẩn trong bảng 3.7 cho thấy R² = 1 > 0,99, chứng tỏ đường chuẩn có độ tuyến tính cao, phù hợp cho việc thực hiện phân tích định lượng AA.
Ứng dụng phương pháp
Quy trình đã được xây dựng sẽ được áp dụng để định lượng AA trong một số mẫu trạch tả trên thị trường Mỗi mẫu sẽ được thực hiện ba lần để lấy kết quả trung bình.
Hàm lượng % AA trong dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức:
C: nồng độ AA trong dung dịch mẫu thử (àg/mL) m: khối lượng mẫu dược liệu đem phân tích (g) d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%)
Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu Trạch tả Tên mẫu Độ ẩm (%) Diện tích píc
Hàm lƣợng trung bình (kl/kl) %
Với 7 mẫu định lượng cho thấy, Trạch tả được trồng tại Ninh Bình có chứa hàm lượng AA cao nhất (0,374 %) Các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường có chứa hàm lượng AA dao động 0,23 – 0,38 %.
Bàn luận
Trạch tả, một loại dược liệu quý giá, đã được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền Trung Quốc và Việt Nam để điều trị nhiều bệnh lý liên quan đến khó tiêu.
Nhu cầu sử dụng sản phẩm thảo dược cho sức khỏe ngày càng tăng, dẫn đến việc Trạch tả được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam, đặc biệt là ở Ninh Bình và Hưng Yên Tỉnh Ninh Bình đang triển khai dự án xây dựng chỉ dẫn địa lý cho cây Trạch tả, tuy nhiên, phần lớn dược liệu này trên thị trường chưa được kiểm soát, gây ra tình trạng chất lượng kém, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và gây thiệt hại kinh tế Do đó, việc kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả là rất cần thiết.
DĐVN IV đã có chuyên luận về Trạch tả, nhưng nội dung còn thiếu chi tiết và chưa xây dựng phương pháp định tính, định lượng cho các hoạt chất chính Theo tài liệu tham khảo, cả Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc đều sử dụng AB23 làm "marker" trong quá trình kiểm nghiệm dược liệu Trạch tả.
Qua khảo sát, nhận thấy dược liệu Trạch tả trên thị trường Việt Nam hầu như không chứa hoặc chỉ có rất ít hoạt chất cần thiết Ngược lại, hoạt chất AA có mặt trong tất cả các mẫu, do đó có thể sử dụng AA làm chỉ số để kiểm soát chất lượng dược liệu Trạch tả.
3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để định tính AA và AB23 trong thân rễ Trạch tả, thay vì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Lý do là vì TLC mang lại nhiều ưu điểm, bao gồm thời gian chuẩn bị mẫu và phân tích ngắn hơn, cũng như yêu cầu trang thiết bị đơn giản hơn Phương pháp này cho phép định tính nhanh chóng các mẫu dược liệu trên thị trường.
Phương pháp định tính mà chúng tôi phát triển sử dụng hệ dung môi đơn giản và thuốc thử nhạy màu, phổ biến trong các phòng phân tích tại Việt Nam Quy trình xử lý mẫu được thực hiện dễ dàng và nhanh chóng Kết quả sắc ký đồ cho thấy vết của AA và AB23 có màu sắc dễ nhận diện cùng với giá trị Rf phù hợp.
Dựa trên các điều kiện phân tích dự kiến, phương pháp đã được xây dựng đáp ứng đầy đủ các yêu cầu cần thiết cho một phương pháp định tính.
3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lƣợng
Xử lý mẫu là bước quan trọng trong phân tích định lượng, giúp loại bỏ tạp chất và tách lấy chất từ dược liệu Dựa trên tài liệu tham khảo và khảo sát tính chất của AA, chúng tôi đã phát triển một quy trình xử lý mẫu hiệu quả, phù hợp với điều kiện hiện tại.
Phương pháp chiết siêu âm là một kỹ thuật phổ biến trong việc chiết xuất hoạt chất từ dược liệu nhờ vào tính đơn giản và hiệu suất chiết xuất cao.
Nghiên cứu chiết hiện tại chủ yếu sử dụng các dung môi như methanol, ethanol, hoặc hỗn hợp MeOH : H2O và ACN : H2O Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu ứng dụng rộng rãi và phù hợp với quy mô của nhiều phòng kiểm nghiệm, chúng tôi đã khảo sát và nhận thấy rằng chiết siêu âm một lần là phương pháp hiệu quả.
25 ml MeOH 80% trong 30 phút là hợp lý về kinh tế, an toàn với môi trường và giảm được lượng dung môi sử dụng
Phương pháp HPLC mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng chọn lựa điều kiện phân tích linh hoạt, độ chọn lọc và độ nhạy cao, cũng như kết quả chính xác và quy trình thực hiện đơn giản.
AA là hợp chất hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, cho phép sử dụng detector UV-VIS để phân tích Với điều kiện sắc ký đã được thiết lập, pha động chỉ gồm acetonitril và nước, chương trình rửa giải đơn giản và đẳng dòng, phương pháp này có thể dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp Tất cả các tiêu chí thẩm định đều đạt yêu cầu của AOAC, với khoảng tuyến tính rộng cho phép định lượng AA trong nhiều đối tượng khác nhau.
3.4.5 Kết quả phân tích mẫu thân rễ Trạch tả
Chưa có tiêu chuẩn cho AA và AB23 trong dược liệu Trạch tả, và nghiên cứu chỉ áp dụng trên 7 mẫu thực Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều chứa AA với hàm lượng từ 0,23% đến 0,38% Tuy nhiên, cả 7 mẫu đều không phát hiện AB23 Đặc biệt, mẫu dược liệu Trạch tả được trồng và thu hái tại Ninh Bình có hàm lượng AA cao nhất.
Nguyên nhân khiến các mẫu thân rễ Trạch tả không xác định được AB23 có thể xuất phát từ quy trình xử lý sơ bộ chưa đạt yêu cầu, cũng như các yếu tố liên quan đến giống, vùng trồng, thời gian thu hái và quá trình sơ chế, bảo quản dược liệu Để có được đánh giá khách quan hơn, cần thực hiện các phương pháp định tính và định lượng.