Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất
Nấm Linh chi được thu hái từ các hộ sản xuất ở nhiều tỉnh như Sa Pa (Lào Cai), TP Hưng Yên, Thạch Thành (Thanh Hóa), Đơn Dương (Đà Lạt) và Yên Khánh (Ninh Bình) Qua việc phân tích các thành phần chính của nấm, chúng tôi đã chọn ra mẫu nấm Linh chi tốt nhất để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1 Các mẫu nấm Linh chi thu thập dùng cho nghiên cứu
Tên mẫu nấm Linh chi
3.1.2 Hóa chất và thiết bị
3.1.2.1 Hóa chất α-glucosidase từ ruột non chuột (rat interstinal aceton power); p- Nitrophenyl α-D-glucopyranoside (PNP-G); NaCL; Tris Base; đệm phosphat 0,1
M (lấy từ Sigma Chemical Co, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7 (Trung Quốc); acarbose (Glucobay, 100mg) (Bayer Medical Co Leverkusen, Đức) Các hóa chất thông dụng…
Tủ sấy và nồi thanh trùng nhập khẩu từ Trung Quốc, máy đo quang phổ Zuzi 4110ED từ Đức, cùng với tủ cấy vô trùng Labgard từ Mỹ và tủ lạnh Sanyo từ Nhật Bản, tạo thành một hệ thống thiết bị hiện đại Ngoài ra, tủ nuôi lắc và kính hiển vi quang học Olympus-CH2 cũng từ Nhật Bản, cùng với máy đánh sóng siêu âm LC30 và máy li tâm từ Đức, đều góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu Hệ thống chiết xuất và cô chân không quy mô 70 lít/mẻ, kết hợp với thiết bị siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6.0 và bể siêu âm dung tích 20 lít, hoạt động với tần số 20 kHz và công suất tối đa 3000 W, đảm bảo quy trình chiết xuất và xử lý mẫu đạt tiêu chuẩn cao.
Thời gian và địa điểm
Nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát, lựa chọn nấm Linh chi (Ganoderma Lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs)
- Chủng nấm Linh chi: nấm Linh chi được thu thập ở 5 địa phương khác nhau Lào Cai, Hưng Yên, Thanh Hóa, Đà Lạt, Ninh Bình.
- Chỉ tiêu đánh giá: độ ẩm (%), cellulose (%), lipid (%), protein (%), polysaccharide (mg%), β- glucan (mg%), triterpenoid (mg%) và hoạt tính kìm hãm α- glucosidase (AGIs) (%).
3.3.2 Xác định điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
- Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi;
+ Loại dung môi: nước cất, ethanol 96%, methanol 96%, isopropy alcohol 96%;
+ Chỉ tiêu : Hoạt tính AGIs (%).
- Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
+ Chỉ tiêu: Hoạt tính AGIs (%).
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi + Nhiệt độ: 25, 35, 45, 55, và 65 ± 2 o C;
+ Chỉ tiêu: Hoạt tính AGIs (%).
- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và Linh chi nguyên liệu đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
+ Tỉ lệ Linh chi nguyên liệu/dung môi: 1/6, 1/8, 1/10, 1/12, 1/14, 1/16, 1/18; + Chỉ tiêu: Hoạt tính AGIs (%).
-Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
Cường độ sóng siêu âm: 0 (không siêu âm), 2, 4, 6 và 8 W/cm 2
+ Chỉ tiêu: Hoạt tính AGIs (%).
3.3.3 Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi
-Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs
+ Chỉ tiêu: Hoạt tính AGIs (%) và cảm quan.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp nghiên cứu tổng quát
Khảo sát nấm Linh chi thu thập được ở Lào Cai, Ninh Bình, Thanh Hóa, Đà Lạt,
↓ Tuyển chọn nấm Linh chi nguyên liệu có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao.
↓ CHIẾT XUẤT AGIs TỪ NẤM LINH CHI Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
↓ Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
↓ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và nấm Linh chi nguyên liệu đến khả năng chiết xuất AGIs
↓ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
↓ Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
AGIs từ nấm Linh chi
↓ Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm AGIs đến chất lượng chế phẩm
↓ Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm
↓ Ứng dụng chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm Linh chi cho tạo thực phẩm chức năng
↓ Đề xuất quy trình chiết xuất chất chiết có khả năng kìm hãm α- glucosidase từ nấm Linh chi
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
3.4.2 Khảo sát, lựa chọn nấm Linh chi (Ganoderma Lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs)
Mẫu nấm Linh chi đã được thu thập từ các hộ sản xuất tại 5 tỉnh: Lào Cai, Hưng Yên, Thanh Hóa, Đà Lạt và Ninh Bình Nghiên cứu nhằm xác định thành phần dinh dưỡng và hoạt tính AGIs của nấm Linh chi nguyên liệu.
- Hàm lượng: cellulose (%), lipid (%), protein (%), polysacharide hòa tan (mg%), β-glucan (mg%), triterpenoid (mg%),
=> Để chọn ra được mẫu nấm Linh chi tốt nhất để phục vụ các lần thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3.1 Chiết xuất bằng dung môi khác nhau
Mỗi mẫu 500g nấm Linh chi (hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) được chiết xuất bằng các dung môi như ethanol 96%, methanol 96%, isopropyl alcohol 96% và nước cất Quá trình chiết xuất diễn ra ở nhiệt độ 60ºC, sử dụng siêu âm với cường độ 8W/cm2 và tần số 20 kHz trong bể siêu âm 20 lít, kéo dài 6 phút Dịch chiết thu được được xác định có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.2 Chiết xuất bằng nồng độ dung môi khác nhau
Mẫu nấm Linh chi 500g (hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) được khảo sát với các nồng độ dung môi chiết xuất AGIs: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96% Quá trình chiết xuất diễn ra ở nhiệt độ 60ºC, sử dụng siêu âm với cường độ 8W/cm2 và tần số 20 kHz trong bể siêu âm 20 lít, kéo dài 6 phút Dịch chiết thu được được xác định có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.3 Chiết xuất bằng các nhiệt độ khác nhau
Mẫu 500g nấm Linh chi được nghiên cứu với các nhiệt độ chiết xuất khác nhau là 25, 35, 45, 55 và 65 ± 20ºC Quá trình chiết xuất sử dụng dung môi 50% ethanol, siêu âm với cường độ 8W/cm2 và tần số 20 kHz trong bể siêu âm dung tích 20 lít, kéo dài trong 6 phút Dịch chiết thô sau đó được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.4 Chiết xuất bằng các tỉ lệ khác nhau giữa nấm Linh chi nguyên liệu và dung môi
Mỗi mẫu khảo sát xác định tỷ lệ nấm Linh chi nguyên liệu/dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs có tỷ lệ như sau: 1/6; 1/8; 1/10; 1/12; 1/14; 1/16; 1/18.
Chiết xuất nấm Linh chi được thực hiện ở nhiệt độ 60ºC với siêu âm cường độ 8W/cm² và tần số 20 kHz trong bể siêu âm 20 lít, trong thời gian 6 phút Mẫu phân tích được thu thập từ các thí nghiệm khảo sát với 100 g nấm Linh chi, sau đó lọc để thu dịch chiết và xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.5 Chiết xuất theo các mốc thời gian và cường độ sóng siêu âm khác nhau
Mẫu nấm Linh chi 500g được khảo sát với các điều kiện chiết xuất khác nhau về thời gian và cường độ siêu âm, cụ thể là không siêu âm, 2, 4, 6 và 8 W/cm², trong khoảng thời gian từ 0 đến 22 phút Dung môi sử dụng là 50% ethanol với tần số siêu âm 20kHz trong bể siêu âm 20 lít Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết thô được xác định để đánh giá hiệu quả chiết xuất.
3.4.4 Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi
3.4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs
Mẫu 1 lít dịch chiết từ nấm Linh chi được chiết xuất ở nhiệt độ 60ºC trong 10 phút bằng siêu âm 20kHz với cường độ 8 W/cm², sử dụng ethanol 50% và bột nấm Linh chi có kích thước hạt Φ 0,8 mm với tỷ lệ 100 g/l Nghiên cứu xác định quá trình cô sấy ở các nhiệt độ khác nhau: 50, 60, 70, 80, 90 và 100±2ºC, trong điều kiện chân không 0,8 atm, đạt độ ẩm 3,5% Sản phẩm thu được được nghiền thành chế phẩm AGIs, sau đó tiến hành xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase và đánh giá cảm quan của chế phẩm AGIs.
3.4.4.2 Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs Bảng
3.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột hoà tan dạng
Thí nghiệm được tiến hành với 12 người tham gia, tất cả đều trong độ tuổi từ 18 đến 45 Tiêu chí lựa chọn bao gồm việc không có bệnh về giác quan, có tinh thần hợp tác và không tiêu thụ các sản phẩm có vị mạnh cũng như không hút thuốc trong vòng 2 giờ trước khi thí nghiệm Ngoài ra, người thử nghiệm cũng không được sử dụng mỹ phẩm như son môi, nước hoa hay xà phòng thơm ngay trước khi thực hiện thí nghiệm và cần đến phòng thí nghiệm đúng giờ.
Phép thử thị hiếu được thực hiện với thang điểm 9, khảo sát 5 sản phẩm bột uống liền gồm W1, W2, W3, W4 và W5 Mỗi công thức bột uống liền được kiểm tra với 100 túi/liều, mỗi túi chứa 300 mg bột.
Tất cả các mẫu thử nghiệm cần phải đồng nhất về dụng cụ, lượng sản phẩm và dạng vật chứa Bột AGIs Linh chi hoà tan được pha với nước cất ở nhiệt độ 90 độ C theo tỉ lệ 1 gói bột (300 mg) cho 100 ml nước Sau đó, mẫu sẽ được giữ ở nhiệt độ 50 độ C trước khi đưa cho người thử nghiệm trong điều kiện nhiệt độ thí nghiệm.
- Cách thức trình bày mẫu: Mẫu được mã hóa bằng 3 chữ số ngẫu nhiên, thứ tự sắp xếp mẫu tuân theo hình vuông Williams.
Bảng 3.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông
Williams tương ứng với 5 mẫu khảo sát
Với A: là W3; B: là W4; C: là W1; D: là W5 và E: là W2
Điều kiện thí nghiệm cho phép thử được thực hiện theo tiêu chuẩn ISO 8589 trong một phòng thí nghiệm cảm quan sạch sẽ, không có mùi lạ, thoáng mát và yên tĩnh Phòng thử được ngăn cách với khu chuẩn bị mẫu, với mỗi đợt thử nghiệm có 10 người tham gia Độ chiếu sáng trong phòng phải đồng nhất ở mọi vị trí, nhiệt độ được duy trì ở mức 20 ± 2 độ C và độ ẩm tương đối từ 70 đến 85%.
Để tiến hành đánh giá cảm quan, người thử sẽ nhận phiếu hướng dẫn và được giải thích về quy trình thí nghiệm cũng như nhiệm vụ của mình Mỗi người thử sẽ lần lượt nhận các mẫu thử được đựng trong ly thủy tinh mã hóa, kèm theo phiếu trả lời tương ứng Trước khi thử mẫu đầu tiên, người thử cần thanh vị bằng nước lọc Sau khi hoàn thành đánh giá một mẫu, phiếu trả lời và mẫu cũ sẽ được thu lại, và mẫu tiếp theo sẽ được cung cấp kèm theo phiếu trả lời mới Người thử tiếp tục thanh vị bằng nước lọc trước khi thử mẫu tiếp theo Sau khi đánh giá xong 5 mẫu, người thử sẽ nhận phiếu điều tra.
3.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo
Nguyên lý hoạt động của enzyme α-glucosidase là quá trình thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành glucose và p-nitrophenol, một hợp chất màu vàng, dưới sự xúc tác của enzyme này.
Khi mẫu thử có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, sự hình thành p-nitrophenol sẽ giảm, dẫn đến mật độ quang của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng không bị ức chế cũng giảm theo Mật độ quang của p-nitrophenol được đo ở bước sóng 405nm và được sử dụng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử.
Dịch chiết xuất được lọc và tách cặn bằng dung môi, sau đó được cô đặc bằng thiết bị cô chân không ở nhiệt độ 60 độ C và áp suất -0,8 atm để loại bỏ dung môi Kết quả thu được là cao khô, được hòa tan trở lại trong nước cất với lượng dịch chiết ban đầu, nhằm xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phương pháp của Toomoyuki et al., 1999.
Cho 0,1 ml enzyme α-glucosidase được ủ với 0,05ml mẫu ở nhiệt độ 37 o C trong thời gian 10 phút.
Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phản ứng 0,05 ml pNPG nồng độ 4mM và ủ ở nhiệt độ 37 o C với thời gian 20 phút.