BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GNETOL VÀ OXY-TRANS-RESVERATROL TRONG DƯỢC LIỆU DÂY GẮM Chủ nhiệm đề tài PGS TS Trần Hùng Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GNETOL VÀ OXY-TRANS-RESVERATROL TRONG DƯỢC LIỆU DÂY GẮM Chủ nhiệm đề tài PGS TS TRẦN HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 ii THÀNH VIEN THAM GIA Ds Lê Đình Phú PGS TS Trần Hùng PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy iii MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC SƠ ĐỒ x DANH MỤC PHỤ LỤC xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Đặc điểm thực vật học chi Gnetum 1.1.2 Đặc điểm thực vật học loài Dây gắm rộng Gnetum latifolium Blume var latifolium 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Nhóm stilbenoid .4 1.2.2 Nhóm flavonoid .5 1.2.3 Nhóm alkaloid 1.2.4 Nhóm lignan 1.2.5 Các thành phần hóa học khác .7 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 1.3.1 Ức chế enzyme xanthin oxidase, hạ acid uric huyết 1.3.2 Chống oxy hóa .8 1.3.3 Kháng khối u 1.3.4 Kháng khuẩn 1.3.5 Ức chế enzyme tyrosinase .9 1.3.6 Hạ đường huyết 10 1.3.7 Giảm đau, kháng viêm 10 1.3.8 Chống kết tập tiểu cầu 10 iv 1.3.9 Kháng virus cúm 10 1.4 CÔNG DỤNG TRONG DÂN GIAN 10 1.5 PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC THÀNH PHẦN STILBENOID TRONG CHI DÂY GẮM 11 1.6 CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 13 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị 13 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời gnetol oxy-transresveratrol thân Dây gắm 14 2.2.2 Thẩm định quy trình định lượng 16 2.2.3 Ứng dụng quy trình định lượng mẫu dược liệu, mẫu cao dược liệu chế phẩm Dây gắm 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .21 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GNETOL VÀ OXY-TRANS-RESVERATROL TRÊN THÂN DÂY GẮM 21 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 21 3.1.2 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 27 3.2 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 31 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 31 3.2.2 Độ đặc hiệu 32 3.2.3 Tính tuyến tính .33 3.2.4 Độ lặp lại 35 3.2.5 Độ 37 3.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 38 3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY DỰNG TRÊN MẪU DƯỢC LIỆU, MẪU CAO DƯỢC LIỆU VÀ MẪU CHẾ PHẨM 39 v 3.3.1 Mẫu dược liệu 39 3.3.2 Mẫu cao dược liệu 40 3.3.3 Mẫu chế phẩm 41 3.4 BÀN LUẬN 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 ĐỀ NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên mẫu Ý nghĩa ABTS 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Thuốc thử ABTS ACN DPPH Acetonitril 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Thuốc thử DPPH E12 ED50 Median effective dose IC50 MA4 Half maximal inhibitory concentration MIC Minimal inhibitory concentration PDA Photodiode array Dãy diod quang TT UPLC Ultra performance liquid chromatography UV Ultraviolet VS Vanillin-sulfuric vii Gnetol Liều có tác dụng 50% mẫu thử Nồng độ ức chế 50% Oxy-trans-resveratrol Nồng độ ức chế tối thiểu Thuốc thử Sắc kí lỏng siêu hiệu Tia tử ngoại Thuốc thử vanillin-sulfuric DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2 Một số chế phẩm chứa Dây gắm hiện bày bán thị trường 12 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ tinh khiết của gnetol (E12) UPLC 22 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ tinh khiết của oxy-trans-resveratrol (MA4) UPLC 22 Bảng 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết gnetol 27 Bảng 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết oxy-trans-resveratrol 27 Bảng 3.7 Kết khảo sát số lần chiết gnetol 28 Bảng 3.8 Kết khảo sát số lần chiết oxy-trans-resveratrol 28 Bảng 3.9 Kết tóm tắt khảo sát tính tương thích hệ thống 31 Bảng 3.10 Mối tương quan nồng độ diện tích pic của gnetol oxy-trans-resveratrol 33 Bảng 3.11 Kết xử lý thống kê 33 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại của gnetol 35 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ lặp lại của oxy-trans-resveratrol 35 Bảng 3.14 Kết hàm lượng gnetol 36 Bảng 3.15 Kết hàm lượng oxy-trans-resveratrol 36 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ của gnetol 37 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ của oxy-trans-resveratrol 37 Bảng 3.18 Kết khảo sát LOD LOQ của gnetol oxy-trans-resveratrol 38 Bảng 3.19 Độ ẩm mẫu dược liệu 39 Bảng 3.20 Kết tính tốn hàm lượng gnetol mẫu dược liệu 39 Bảng 3.21 Kết tính toán hàm lượng oxy-trans-resveratrol mẫu dược liệu 40 Bảng 3.22 Độ ẩm mẫu cao dược liệu 40 Bảng 3.23 Kết tính tốn hàm lượng gnetol mẫu cao dược liệu 41 Bảng 3.24 Kết tính tốn hàm lượng oxy-trans-resveratrol mẫu cao dược liệu 41 Bảng 3.25 Kết tính tốn hàm lượng oxy-trans-resveratrol mẫu chế phẩm 42 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 Dây gắm rộng [4] Hình 1.3 Cấu trúc stilben monomer có chi Gnetum Hình 1.7 Cấu trúc flavonoid có chi Gnetum Hình 1.8 Cấu trúc alkaloid có chi Gnetum Hình 1.9 Cấu trúc lignan có chi Gnetum Hình 1.10 Một số chế phẩm Dây gắm thị trường 12 Hình 3.11 Sắc ký đồ chất đối chiếu gnetol 21 Hình 3.12 Sắc ký đồ chất đối chiếu oxy-trans-resveratrol 21 Hình 3.13 Phổ hấp thu UV của chất đối chiếu gnetol 21 Hình 3.14 Phổ hấp thu UV của chất đối chiếu oxy-trans-resveratrol 21 Hình 3.15 Phổ 3D của gnetol 22 Hình 3.16 Phổ 3D của oxy-trans-resveratrol 22 Hình 3.17 Độ tinh khiết của gnetol 22 Hình 3.18 Độ tinh khiết của oxy-trans-resveratrol 22 Hình 3.19 Chương trình rửa giải sắc ký đồ khảo sát 23 Hình 3.20 Chương trình rửa giải sắc ký đồ khảo sát 23 Hình 3.21 Chương trình rửa giải sắc ký đồ khảo sát 24 Hình 3.22 Chương trình rửa giải sắc ký đồ khảo sát 24 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu thử bước sóng 218 nm 25 Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu thử bước sóng 307 nm 25 Hình 3.25 Sắc ký đồ mẫu thử bước sóng 310 nm 25 Hình 3.26 Sắc ký đồ mẫu thử bước sóng 325 nm 25 Hình 3.27 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26 Hình 3.28 Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột 26 Hình 3.29 Thời gian chiết gnetol 27 Hình 3.30 Thời gian chiết oxy-trans-resveratrol 27 Hình 3.31 Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết 27 Hình 3.32 Số lần chiết gnetol 28 Hình 3.33 Số lần chiết oxy-trans-resveratrol 28 ix Hình 3.34 Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết 28 Hình 3.35 Sắc ký đồ mẫu thử với chương trình rửa giải chọn 29 Hình 3.36 Phổ 3D của mẫu thử với chương trình rửa giải chọn 29 Hình 3.37 Phổ UV và độ tinh khiết pic gnetol 30 Hình 3.38 Phổ UV và độ tinh khiết pic oxy-trans-resveratrol 30 Hình 3.39 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống 32 Hình 3.40 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu 32 Hình 3.41 Sắc ký đồ khảo sát tính tuyến tính 34 Hình 3.42 Đường tuyến tính của gnetol oxy-trans-resveratrol 35 Hình 3.43 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại 36 Hình 3.44 Sắc ký đồ khảo sát độ 38 Hình 3.45 Sắc ký đồ LOQ của E12 38 Hình 3.46 Sắc ký đồ LOQ của MA4 38 Hình 3.47 Sắc ký đồ LOD của E12 38 Hình 3.48 Sắc ký đồ LOD của MA4 38 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình chiết mẫu Dây gắm đề nghị 15 Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử 29 x Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thân Dây gắm Kiên Giang PL.11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thân Dây gắm Củ Chi tháng 10/2017 PL.12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thân Dây gắm Củ Chi tháng 3/2018 PL.13 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.14 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thân Dây gắm Củ Chi tháng 6/2018 PL.15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 10 Sắc ký đồ mẫu hoa Dây gắm Củ Chi PL.16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 11 Sắc ký đồ mẫu Dây gắm Củ Chi PL.17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 12 Sắc ký đồ mẫu cao cồn tồn phần PL.18 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 13 Sắc ký đồ mẫu cao phân đoạn chloroform PL.19 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 14 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm viên nang GútBye PL.21 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 15 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm viên nén Vương Gút Khang PL.22 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 16 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm viên hoàn Viên Cao Gắm PL.23 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... dựng quy trình định lượng đồng thời gnetol oxy- trans- resveratrol thân Dây gắm - Xây dựng phương pháp thẩm định quy trình định lượng xây dựng theo hướng dẫn của ICH - Ứng dụng quy trình định lượng. .. 2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời gnetol oxy- transresveratrol thân Dây gắm 14 2.2.2 Thẩm định quy trình định lượng 16 2.2.3 Ứng dụng quy trình định lượng mẫu dược liệu,... dụng quy trình định lượng mẫu dược liệu, mẫu cao dược liệu chế phẩm Dây gắm Áp dụng quy trình định lượng xây dựng thẩm định để xác định hàm lượng gnetol oxy- trans- resveratrol có mẫu dược liệu,