BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.DS NUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp Hồ Chí Minh, 04/2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp Hồ Chí Minh, 04/2019 DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TS DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ ThS.DS NGUYỄN HOÀNG THẢO MY MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U 2.2 TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG 2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U – NGHỆ 11 Sơ lược Dầu Mù u – Nghệ 11 Các nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u – Nghệ 12 Phương pháp định lượng hoạt chất Dầu Mù u – Nghệ 12 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I chế phẩm dầu Mù u – Nghệ 15 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN I VÀ CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U – NGHỆ 17 Khảo sát điều kiện chiết calophyllolid curcumin I từ Dầu Mù u – Nghệ17 Khảo sát điều kiện sắc ký 18 Thẩm định quy trình phân tích 24 Các tiêu kiểm nghiệm Dầu Mù u – NghệError! Bookmark not defined CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 31 5.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID, CURCUMIN TRONG DẦU MÙ U - NGHỆ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitril C Nồng độ CĐC Chất đối chiếu DCM Dicloromethan dd Dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV MeOH Methanol EtOH Ethanol H Chiều cao pic HL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography M Khối lượng MHA Mueller – Hinton Agar N Số đĩa lý thuyết PA Purity angel PDA Photodiode array PT Purity threshold ppm Parts per million - Phần triệu RS Độ phân giải S Diện tích pic SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography tR Thời gian lưu TSA Tryptic Soy Agar UV Ultraviolet - Tử ngoại Danh mục hình ảnh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cơng thức khai triển Calophyllolid Hình 2.2 Phản ứng mở vòng lacton Calophyllolid Hình 4.1 Kết khảo sát dung mơi hịa tan mẫu dầu Mù u – Nghệ HPLC 17 Hình 4.2 SKĐ mẫu chuẩn trước sau xử lý qua SPE 18 Hình 4.3 Kết khảo sát pha động mẫu dầu Mù u – Nghệ 19 Hình 4.4 Các SKĐ khảo sát chương trình dung mơi với kỹ thuật gradient 20 Hình 4.5 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời curcumin calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ HPLC 25 Hình 4.6 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic curcumin I 26 Hình 4.7 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic calophyllolid 27 .i Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Tỷ lệ phục hồi mẫu chuẩn trước sau qua SPE 18 Bảng 4.2: Kết khảo sát thành phần pha động mẫu Dầu Mù u – Nghệ 19 Bảng 4.3: Các hệ gradient khảo sát mẫu dầu Mù u – Nghệ 20 Bảng 4.4: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu curcumin 22 Bảng 4.5: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu thử chứa curcumin 22 Bảng 4.6: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu calophyllolid 23 Bảng 4.7: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu thử chứa calophyllolid 23 Bảng 4.8: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu curcumin I 26 Bảng 4.9: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid 26 Bảng 4.10: Biện luận kết trắc nghiệm phương trình hồi quy tuyến tính 27 Bảng 4.11: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng đồng thời curcumin, calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ phương pháp HPLC (n = 6) 28 Bảng 4.12: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời curcumin, calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ phương pháp HPLC 28 Bảng 4.13: Kết khảo sát độ pic curcumin I 29 Bảng 4.14: Kết khảo sát độ pic calophyllolid 29 Bảng 4.15: Kết thẩm định quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I phương pháp HPLC 30 Bảng 4.16: TCCS dầu Mù u - Nghệ Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ - Dầu Mù u, nguyên liệu ép từ Mù u (Calophyllum inophyllum Linn., Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Từ năm 1918, nhà khoa học Pháp bắt đầu nghiên cứu tác dụng chỗ da khả làm lành da dược liệu Khoa học đại có nhiều cơng trình chứng minh tác dụng dược lý dầu tính kháng viêm, kháng khuẩn [34], [39], trị sẹo [34],[68] chữa bỏng [24] mau lành vết thương [52], [60] Y học không ngừng phát triển, sản phẩm điều trị vết thương da cải tiến, nguyên liệu dầu Mù u vị thuốc thu hút quan tâm nhà Dược học nước sản phẩm [6], [7], [22], [46] - Từ nghiên cứu thành phần đến nghiên cứu ứng dụng qua dòng sản phẩm tiêu dùng từ dầu Mù u như: chế phẩm dầu dùng ngồi, tinh dầu, xà bơng, kem dưỡng hay băng gạc; dầu Mù u ngày phân tích sâu thành phần tác dụng lẫn đa dạng hóa chế phẩm để khai thác tác dụng điều trị dược liệu - Tại Việt Nam nay, sản phẩm dùng da nói chung điều trị nói riêng từ dầu Mù u xuất nhiều thị trường, nhiên sản phẩm từ dầu Mù u quản lý chất lượng tiêu chuẩn kiểm nghiệm hạn chế Đặc biệt tiêu chuẩn có tiêu định lượng sử dụng chất đối chiếu calophyllolid – chất maker chiết xuất định danh thành phần dầu Mù u [48], [51], [60] - Mặt khác, sản phẩm có kết hợp dầu Mù u Nghệ vàng nhằm hỗ trợ tác dụng để tăng tác dụng mau liền sẹo, tiêu viêm, nuôi dưỡng tái tạo da xem bước đột phá việc phối hợp tác dụng tương hỗ hai loại dược liệu đa dạng hóa sản phẩm từ dầu Mù u Chế phẩm Dầu Mù u kết hợp với Nghệ (hay gọi tắt Dầu Mù u – Nghệ) hướng nghiên cứu kế thừa từ liệu khoa học chứng minh tác dụng tương hỗ Dầu Mù u Nghệ vàng, ứng dụng công nghệ bào chế đại tạo sản phẩm Chúng tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình định lượng calophylloid curcumin I dầu Mù u – Nghệ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” nhằm góp phần cơng tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U Sơ lược Mù u Tên khoa học: Calophyllum inophyllum Linn (Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc chi Calophyllum chi lớn họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Tên gọi khác: Hồ đồng, Kungtung, Khchyong (Campuchia),YaraboTetihabocu (Nhật Bản), Alexandrian Laurel (Pháp), Dilo (Fiji), Kamanu (Hawail) [1], [3], [10] Mù u phân bố rộng rãi từ Thái Lan, Malaysia đến Lào, Campuchia, Indonesia số đảo Nam Thái Bình Dương số tỉnh miền Nam Trung Quốc, đặc biệt nhiều Ấn Độ Mù u thân mộc, cao đến 20 – 25 m, đường kính trung bình 30 – 35 cm Lá mọc đối, phía cuống lại, đầu tù, phiến dài 10 – 17 cm, gân nhỏ, chạy song song rõ hai mặt Hoa to, thơm, có màu trắng , mọc thành xim hay kẽ đầu cành đặc điểm bật phân biệt Mù u với loại thân mộc khác [5] Tại Việt Nam, dược liệu dân gian phân bố chủ yếu vùng núi thấp miền Bắc, miền Trung đặc biệt khu vực Tây Nam Bộ Khu vực miền Tây Nam Bộ với số tỉnh điển hình như: Tiền Giang, Long An, … thường gặp Mù u dọc theo bờ kênh rạch cao vùng cát ven bờ biển [5], [16] Tổng quan Dầu Mù u Theo chuyên luận Mù u DĐVN V; dầu Mù u (Oleum calophylii inophylii) định nghĩa dầu ép từ hạt Mù u tinh chế loại bỏ phần “nhựa” với thể chất dầu lỏng, sánh, màu vàng tới vàng sậm, mùi thơm hắc đặc trưng [28] Các nghiên cứu nước việc ly trích Dầu Mù u từ hạt với phương pháp khác cho hàm lượng hoạt chất thành phần hóa học có khác biệt Năm 2016, Nguyễn Hữu Hiếu cộng khoa Kỹ thuật Hóa học – trường Đại học Bách Khoa TP.HCM tối ưu hóa q trình kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn (SCF – CO2) phân tích thành phần hệ thống GC – MS so sánh với phương pháp ép học chiết với ether dầu hỏa [9] Trước đó, xét quy mô công nghiệp, luận án Đinh Văn Trạch (2013) sâu vào phương pháp ép lạnh học với hệ thống cô thu Tổng quan tài liệu hồi dung môi nhằm nâng cao hiệu suất chiết xác định số thành phần kỹ thuật GC – MS HPLC [29] Nghiên cứu công bố vào tháng 8/2017 Malaysia dùng kỹ thuật chiết siêu âm (Ultrasonic – assisted extraction, gọi tắt UAE) dùng mơ hình Patricelli để đánh giá động học trình chiết xuất tối ưu hóa quy trình [54] 2.1.2.1 Thành phần hóa học Từ năm 1985, nghiên cứu Mù u Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM PGS.TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ cho thấy hạt Mù u chứa 41- 51 % dầu thơ, hàm lượng dầu béo chất nhựa dầu thô 71,5 % 28,5 % Các nghiên cứu tiếp nối Khoa Dược năm 2009 xác định rõ thành phần kỹ thuật GC-FID [18], [23] Hoạt chất hạt Mù u thuộc nhóm 4-phenyl courmarin; hàm lượng courmarin xác định dầu Mù u thô 0,77 %; Dầu Mù u tinh chế 0,5 %; nhựa dư phẩm 0,15% bã phương pháp ép lạnh để chiết xuất dầu 1,75 – 2,13 % Các dẫn xuất courmarin quan trọng biết đến bao gồm: calophyllolid (C25H22O5), inophyllolid (C25H22O5), acid calophyllolid (C25H24O6), acid inophyllolid (C17H22O3)… [17], [18], [20] Theo liệu chuyên mục Mù u “Những thuốc vị thuốc Việt Nam (2007)” chuyên đề dầu Mù u (Tamanu oil) nhóm tác giả A.C.Dweck thành phần hóa học loại dầu Mù u thuộc khu vực Châu Á châu Phi cho thấy Tocopherol Tocotrienol xem chất chống oxi hóa tự nhiên tạo nên ổn định dầu Trong Calophyllum inophyllum L thành phần DTocotrienol (236,0 mg/kg), sau C-Tocotrienol với hàm lượng cao (64130mg/kg) [5], [32] 2.1.2.2 Tác dụng dược lý Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Các thực nghiệm nhóm nghiên cứu Đại học Paris Descartes (Pháp) cuối năm 2015 cho thấy nhóm hoạt chất phenyl courmarin cho hoạt tính kháng khuẩn điển hình nhất, kể vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Hoạt tính kháng khuẩn dầu Mù u thể mạnh vi khuẩn gram dương yếu vi khuẩn gram Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.24 Phụ lục Thẩm định quy trình phân tích 4.1.3.1 Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử mẫu thử thêm chất đối chiếu Các SKĐ Hình 4.5 Hình A SKĐ mẫu trắng Hình B SKĐ, độ tinh khiết mẫu đối chiếu curcumin I calophyllolid Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.25 Phụ lục Hình C SKĐ, độ tinh khiết phổ UV pic calophyllolid, curcumin I mẫu Dầu Mù u – Nghệ Hình D SKĐ mẫu thử Dầu Mù u – Nghệ thêm chất đối chiếu Hình 4.5 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời curcumin I calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ HPLC Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.26 Nhận xét:  SKĐ mẫu trắng không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu SKĐ hai chất đối chiếu curcumin I calophyllolid  SKĐ mẫu thử cho pic curcumin calophyllolid có thời gian lưu tương tự với pic SKĐ mẫu đối chiếu; mẫu thử thêm chất đối chiếu  Pic curcumin calophyllolid cần định lượng mẫu đạt yêu cầu độ tinh khiết pic, trùng khớp phổ UV so với mẫu đối chiếu Như vậy, quy trình đáp ứng yêu cầu tính đặc hiệu quy trình định lượng 4.1.3.2 Tính tuyến tính Bảng 4.8: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu curcumin I Nồng độ (ppm) Diện tích pic (µV x giây) 16 Lần 18530 35670 71845 87211 136716 278460 Lần 18239 36892 72243 87949 136260 278354 Trung bình 18385 36281 72044 87580 136488 278407 Bảng 4.9: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid Nồng độ (ppm) Diện tích pic (µV x giây) 10 20 25 40 80 Lần 146676 283376 577741 749098 1181209 2330649 Lần 146414 282804 564619 752352 1178716 2350019 Trung bình 146545 283090 571180 750725 1179963 2340334 Diện tích pic (µV x giây) 300000 y = 17386x R² = 0.9996 200000 100000 0 15 20 Nồng10độ curcumin (ppm) Hình 4.6 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic curcumin Phụ lục Diện tích pic (µV x giây) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.27 2500000 y = 29309x R² = 0,9998 2000000 1500000 1000000 500000 0 20 40 60 80 100 Nồng độ calophyllolid (ppm) Hình 4.7 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic calophyllolid Biện luận kết dựa vào giả thuyết thống kê: Bảng 4.10: Biện luận kết trắc nghiệm phương trình hồi quy tuyến tính CĐC F Hệ số b Hệ số bo Biện luận Kết luận Curcumin I F = 14401,95 > F0,05 = 7,71 Phương trình hồi quy Calophyllolid F = 17933,83 > F0,05 = 7,71 tương thích Curcumin I t = 1200,01 > t0,05 = 2,78 Hệ số b có ý nghĩa Calophyllolid t = 133,92 > t0,05 = 2,78 thống kê Curcumin I to = 1,18 < t0,05 = 2,78 Hệ số bo khơng có ý Calophyllolid to = 0,18 < t0,05 = 2,78 nghĩa thống kê Nhận xét: có tương quan nồng độ diện tích pic khoảng nồng độ khảo sát, giá trị hệ số R2 > 0,998 Phương trình hồi quy: Curcumin I: y = 17386 x R2 = 0,9996 Calophyllolid: y = 29309 x R2 = 0,9998 4.1.3.3 Độ xác Tiến hành sắc ký mẫu thử 100% nồng độ định lượng, thực ngày mẫu thử thực ngày khác Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.28 Bảng 4.11: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng đồng thời curcumin I, calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ phương pháp HPLC (n = 6) Mẫu Curcumin I KL cân (g) Calophyllolid S (µV x Lượng Hàm lượng S (µV x Lượng Hàm lượng giây) Cur (g) (%) giây) Cal (g) (%) 1,0154 62057 0,0004 0,035 647172 0,0022 0,218 1,0115 61474 0,0004 0,035 671561 0,0023 0,227 1,0102 59733 0,0003 0,034 659254 0,0022 0,223 1,0245 60004 0,0003 0,034 654654 0,0022 0,218 1,0068 58555 0,0003 0,033 668902 0,0023 0,227 1,0015 59897 0,0003 0,034 654414 0,0022 0,223 Số liệu TB = 0,0343 % TB = 0,2224 % thống kê RSD% = 2,00 RSD% = 1,79 Nhận xét: RSD% hàm lượng curcumin I, calophyllolid mẫu phân tích ngày < 2% RSD ≤ 2,0% Quy trình đạt yêu cầu độ lặp lại Bảng 4.12: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời curcumin I, calophyllolid Dầu Mù u – Nghệ HPLC Ngày Curcumin KL cân (g) Calophyllolid S (µV x Lượng Hàm lượng S (µV x Lượng Hàm lượng giây) (%) (%) Cur (g) giây) Cal (g) 1,0034 61057 0,0004 0,035 647172 0,0022 0,220 1,0215 61474 0,0004 0,035 669761 0,0023 0,224 1,0002 59933 0,0003 0,034 660254 0,0023 0,225 1,0145 59004 0,0003 0,033 650654 0,0022 0,219 1,0068 58555 0,0003 0,033 665902 0,0023 0,226 1,0065 60897 0,0003 0,035 650414 0,0022 0,221 Nhận xét: RSD% hàm lượng curcumin I, calophyllolid mẫu phân tích liên ngày < 2% RSD ≤ 2,0% Quy trình đạt yêu cầu độ xác trung gian Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.29 4.1.3.4 Độ Bảng 4.13: Kết khảo sát độ pic curcumin I Mức hàm Lần KL mẫu S thử (g) (µVxgiây) lượng 50% 100% 150% C chuẩn Nồng độ C chuẩn Tỷ lệ thêm vào mẫu đo tìm thấy phục hồi (ppm) (ppm) (ppm) (%) 1,0011 90083 1,728 5,18 1,75 101,13 1,0045 89808 1,728 5,17 1,72 99,54 1,0155 90014 1,728 5,18 1,69 98,04 1,0195 119828 3,456 6,89 3,40 98,24 1,0075 120765 3,456 6,95 3,49 100,99 1,0098 121373 3,456 6,98 3,52 101,78 0,9996 149837 5,184 8,62 5,19 100,11 1,0000 150284 5,184 8,64 5,21 100,58 1,0185 149779 5,184 8,61 5,12 98,79 TB 99,91 Bảng 4.14: Kết khảo sát độ pic calophyllolid Mức hàm Lần lượng 50% 100% 150% KL mẫu S thử (g) (µVxgiây) C chuẩn Nồng độ C chuẩn thêm vào mẫu đo tìm thấy phục hồi (ppm) (ppm) (ppm) Tỷ lệ (%) 1,0011 967924 10,9 33,03 22,26 99,23 1,0045 976050 10,9 33,31 22,34 100,62 1,0155 976294 10,9 33,32 22,58 98,46 1,0195 1307680 21,8 44,63 22,67 100,70 1,0075 1285965 21,8 43,88 22,41 98,52 1,0098 1309397 21,8 44,68 22,46 101,95 0,9996 1612677 32,7 55,03 22,23 100,31 1,0000 1609301 32,7 54,92 22,24 99,93 1,0185 1603992 32,7 54,74 22,65 98,12 TB 99,76 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.30 Nhận xét: Tỉ lệ phục hồi (%) curcumin I calophyllolid nằm khoảng 98 – 102 % RSD ≤ 2,0 % Quy trình đạt yêu cầu độ Bảng 4.15: Kết thẩm định quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I phương pháp HPLC Chỉ tiêu Kết Độ đặc hiệu Đáp ứng yêu cầu tính đặc hiệu Độ lặp lại RSD% hàm lượng curcumin = 2,00 ≤ 2% RSD% hàm lượng calophyllolid = 1,79 < 2% Độ xác RSD% hàm lượng curcumin = 1,98 < 2% trung gian RSD% hàm lượng calophyllolid = 1,31 < 2% Tính tuyến tính Phương trình hồi quy curcumin: y = 17386 x, R2 = 0,9996 Phương trình hồi quy calophyllolid: y = 29309 x, R2 = 0,9998 Độ Pic curcumin có tỷ lệ phục hồi từ 98 – 102% (RSD% = 1,34) Pic calophyllolid có tỷ lệ phục hồi từ 98 – 102% (RSD% = 1,28) Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.31 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Qua thời gian nghiên cứu, đề tài thu kết theo mục tiêu nghiên cứu sau: 5.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID, CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U - NGHỆ Các tiêu kiểm nghiệm chung thành phẩm Các tiêu tỷ trọng, số acid, số xà phịng hóa số iod thực lô nghiên cứu lặp lại lần với tiêu để có mức TCCS kiến nghị vế số hóa lý sau: Chỉ số Acid: - 12 Chỉ số xà phòng: 200 - 220 Chỉ số Peroxyd: < 10 Tỷ trọng: 0,9186 – 0,9229 Với thành phẩm tích 10ml, giới hạn thể tích +10% Xây dựng quy trình định lượng đồng thời calophyllolid, curcumin I dầu Mù u – Nghệ Khảo sát điều kiện chiết xuất calophyllolid Khảo sát điều kiện chiết xuất calophyllolid dầu cho thấy methanol dung mơi tối ưu để hồn tan mẫu so với ACN SKĐ bị tượng đỉnh thành dãy cao so với đường Về phương pháp chiết áp dụng kỹ thuật SPE với quy trình chiết chọn MetOH 100% thay MetOH 90 Cắn courmarin tiến hành sắc ký với tỉ lệ dung môi khác cho thấy tỉ lệ 60 : 40 dung môi hữu dung môi phân cực (một số loại nước acid) cho đỉnh có thơng số sắc ký tối ưu Khảo sát điều kiện sắc ký Trong khảo sát điều kiện sắc ký, nước acid chọn acid formic 0,1% (pH 3,5) để hạn chế tượng đường tương đối cao xử lí mẫu dầu Đồng thời kỹ thuật rửa giải gradient lựa chon giải dược vấn đề độ tinh khiết lẫn độ phân giải so với hệ đẳng dịng thơng thường Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.32 Thẩm định quy trình phân tích Quy trình phân tích với điều kiện sắc ký chọn cho tính phù hợp hệ thống thỏa điều kiện theo ICH Các tiêu Độ lặp lại, độ xác trung gian, đường tuyến tính, độ thỏa yêu cầu thẩm định Hàm lượng trung bình curcumin I calophyllolid dầu Mù u – Nghệ lô nghiên cứu 0,0343% 0,2224% với điều kiện sắc ký chọn Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Inerstil C18 (250 x 4,6 mm; m) - Detector: PDA - Nhiệt độ cột: 40 oC - Tốc độ dịng: ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Bước sóng phát : 270nm - Pha động: hệ gradient acetonitril  acid formic 0,1% Thời gian (phút) Tỉ lệ ACN – HCOOH (pH 3,5) 60:40 10 55:45 25 65:35 35 60:40 Dung dịch đối chiếu: Hỗn hợp chất đối chiếu pha dung mơi methanol vào bình định mức 10ml với nồng độ curcumin I 3,5 ppm calophyllolid 21,4 ppm Dung dịch thử: cân xác khoảng 1g dầu, chiết kỹ thuật SPE thu dung dịch thử nghiệm có nồng độ chất cần định lượng tương đương dung dịch đối chiếu Kiến nghị:  Hiện chưa có nghiên cứu xác định đồng thời hai hoạt chất mẫu dạng dầu Sự phối hợp dược liệu nhằm mang lại hiệu điều trị tốt vết thương da có nghiên cứu rõ rệt tác dụng lâm sang [25], [28] Kết thự nghiệm cho thấy có mặt hàm lượng % mẫu cần định lượng với lượng calophyllolid gấp khoảng lần so với curcumin I Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.33 Phụ lục Do công thức phối hợp khác nguyên liệu ban đầu nên tỉ lệ thay đổi theo thành phẩm cuối  Kỹ thuật SPE áp dụng để loại tạp dầu béo không làm biến đổi lượng hoạt chất cần định lượng đồng thời tối ưu cho tiêu độ lặp lại độ thẩm định Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.34 Phụ lục TÀI LIỆU THAM KHẢO 1] 2] 3] 4] 5] 6] 7] 8] 9] 10] 11] 12] 13] 14] 15] 16] 17] 18] 19] Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc Động Vật làm thuốc Việt Nam (II), Nhà Xuất Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội, pp 305-306 Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (1998), "Điểm lại số cơng trình nghiên cứu ứng dụng dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược(37/98), pp 10-13 Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Trịnh Hoàng Dương , Hà Diệu Ly (2011), "Chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng (Rhizoma Curcuma longa) xây dựng liệu chuẩn curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu", Tạp chí Dược học 424, pp 64-66 Đỗ Tất Lợi (2007), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Minh Hiển, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Văn Thị , Bùi Thị Thu Thảo (2013), "Nghiên cứu xác định calophyllolid HPLC- DAD ứng dụng kiểm nghiệm dung dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù U", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc(2/2013), pp 14-18 Hà Minh Hiển, Paul WS Heng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch Huệ (2011), "Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu calophyllolid dùng kiểm nghiệm nghiên cứu dược liệu Mù U Calophyllum inophyllum L", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, pp 15-19 Phạm Thị Đoan Hạnh (2003), Tiêu chuẩn hóa chế phẩm Gel kháng viêm sản xuất từ Dầu Mù u, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Nguyễn Hữu Hiếu, Nguyễn Trọng Huy, Trần Thị Minh Thùy (2016), "Tối ưu hóa q trình trích ly Dầu Mù u kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn", Tạp chí Hóa học(19/2/2016), pp 82-87 Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ TP HCM, pp 457 ASTM International (2005), Standard test methods of sampling and chemical analysis of soaps and soap products, D460-91, USA Jan McBarron, M.D , N.D (2012), Curcumin the 21st Century Cure, Your health Books Nguyễn Hoàng Thảo My (2014), Xây dựng phương pháp sản xuất tiêu chuẩn hóa xà bơng từ Dầu Mù u, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Nguyễn Vĩnh Niên, Ngô Phi Hậu (1998), "Tính kháng nấm ngồi da Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược số 37/1998, pp 17-19 Bộ khoa học công nghệ (2008), Tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1557:1991 xà phòng bánh phương pháp thử, định số 2925/QĐ-BKHCN ngày 30/12/2008 Nguyễn Duy Cương , Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), Từ điển bách khoa Dược học, Nhà xuất Từ điển Bách Khoa, pp 411 Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (1998), "Điểm lại số cơng trình nghiên cứu ứng dụng Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược, số 37/98, pp 2-6 Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (1998), "Một số kết nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược số 37/98, pp 10-13 Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Đặng văn Giáp, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Thị Hồng Hương, Vĩnh Định, Nguyễn Tuấn Dũng, Mai Phương Mai, Nguyễn văn Thanh , Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.35 20] 21] 22] 23] 24] 25] 26] 27] 28] 29] 30] 31] 32] 33] 34] Phụ lục Trần văn Bé Bảy (2002), "Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm từ dầu Mù U : thuốc mỡ Balsino ", Tạp chí Y học thành phố Hồ chí Minh.Chuyên đề nghiên cứu khoa học Dược (4), pp 296-299 Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Thị Hồng Hương, Phạm Thị Mỹ Nhung, Nguyễn Thị Thu Ngân, Nguyễn Thị Mai Hương , Dương Thị Thanh Xuân (1993), "Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học số chế phẩm từ dầu hạt Mù U (Calophyllum inophyllum ,Clusiaceae)", Dược học số chuyên san 1993, pp 43-46 Nguyễn Thị Hồng Phúc (2007), Xây dựng quy trình định lượng Calophyllolid dầu Mù u phương pháp sắc kí khí sắc kí lỏng hiệu cao, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Y Dược Tp.HCM Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Hà Minh Hiển, Nguyễn Văn Thị , Võ Thị Bạch Huệ (2009), "Phân lập số hợp chất phenol từ nhựa Mù U dư phẩm", Tạp chí Dược học 49 (395), pp 30-33 Phan Văn Hồ Nam, Nguyễn Thị Nguyên Sinh, Trần Thị Thảo Phước , Võ Thị Bạch Huệ (2009), "Xác định số acid béo dầu Mù u (Calophyllum inophyllum l.) phương pháp sắc kí khí ( GC-FID)", Y học thành phố Hồ Chí Minh- Chuyên đề Dược 13 (1), pp 62-67 Phạm Đình Phú (2001), "Nhận xét lâm sàng điều trị tổn thương bỏng Dầu Mù u", Tạp chí Y học thảm họa bỏng 4, pp 64-66 Nguyễn Thị Hồng Phúc (2013), Tiêu chuẩn hóa chế phẩm gạc tẩm Dầu Mù u, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Y Dược Tp.HCM Hoàng Lê Trúc Phương (2014), Tinh chế dầu cám gạo thơ tiêu chuẩn hóa dầu cám gạo (Rice bran oil), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Tống Minh Tâm (2014), Đánh giá tác động kháng viêm số công thức nano chứa dầu Mù u Curcumin mơ hình gây viêm da chuột trắng dầu Ba Đậu, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Bộ Y Tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV Đinh Văn Trạch (2013), Tiêu chuẩn hóa Dầu Mù u thô dầu Mù u tinh chế sản xuất quy mô công nghiệp, Luận án chuyên khoa cấp 2, Đại học Y Dược Tp.HCM Trần Thanh Thạo, Võ Thị Bạch Huệ , Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2002), "Phân lập xác định cấu trúc Calophyllolid từ hạt Mù U (Calophullum inophyllum L.) mọc Việt Nam", Tạp chí Dược học(17/9/02), pp 16-18 Bộ Tài ngun Mơi trường (2008), Tiêu chí nhãn xanh Việt Nam 09 : 2014 xà phòng bánh, định số 154/QĐ-BTNMT ngày 25/01/2014 A.C Dweck , T Meadowsy (2002), "Tamanu (Calophyllum inophyllum) – the African,Asian, Polynesian and Pacific Panacea", International Journal of Cosmetic Science, pp 1-8 Ahmad V.U., Ali M.S., Mahmud S., Perveen S , Rizwani G.H (1998), "Antimicrobial studies on fractions and pure compounds of Calophyllum inophyllum Linn Guttiferae", Pak J Pharmacol (15), pp 13-25 Seuly Akter, Md.Saddam Hossain, Israt Jahan Bulbul , Yesmin Begum (2017), "Pharmacological study of Medicinal Plant Calophyllum inophyllum L on Swiss Albino Mice in the management of Pain and inflammation", European Journal of Medicinal Plants 18 (2), pp 1-10 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.36 35] 36] 37] 38] 39] 40] 41] 42] 43] 44] 45] 46] 47] 48] Phụ lục Tuty Anggranini , Sahadi Didi Ismanto and Dahlia (2015), "The making of transparent soap from Green Tea extract", International Journal on advanced science angineering information technology (4), pp 349-356 Brahat B.Aggarwal, Indra D Nhatt , Haruyo Ichikawa (2006), Curcumin Biological and madicinal Properties, the genus curcuma, Turmeric Book, ed Bean M.F., Eggleston D.S., Freyer A.J., Haltiwanger R.C , Patil A.D (1993), "The inophyllums, novel inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase isolated from the malaysian tree, Calophyllum inophyllum Linn.", J Med Chem 26 (36), pp 4131-4138 Cruz Alexandre Bella, Cechinel-Filho Valdir, Noldin Vania F Isaias Daniela E B., Pretto Juliana B , Sartori Mara R K (2004), "Antimicrobial Activity of Fractions and Compounds from Calophyllum brasiliense (Clusiaceae/Guttiferae)”", Z Naturforsch.(59c), pp 657-662 Zakaira Muhamad Bin, Ilham Zul , et al (2014), "Anti - infalmmatory activity of Calophyllum inophyllum fruits extracts", Procedia Chemistry 13, pp 218-220 Sai Krishna Borra, Prema Gurumurthy, Jaideep Mahendra, Jayamathi , Ram Chand (2013), "Anti - oxidation and free radical scavenging activity of curcumin determined by using different in vitro and ex vivo models", Journal of Medicinal Plants Research (36), pp 2680-2690 C.D.Weck (2003), "The role of Natural ingredients in anti - ageing of the skin", Australian society of Comestic Chemists C.V.B.Martins, D.L da Silva, A.T.M Neres, T.F.T.Magalhaes , et al (2009), "Curcumin as a promising antifungal of clinical interest", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 63 (2), pp 337-339 Ishita Chattopadhyay, Kaushik Biswas, Uday Bandyopadhyay , rANAJIT k bANERJEE (2004), "Turmeric and Curcumin : Biological actions and medicinal applications", Current Sciences 87 (1), pp 44-53 Gu Yu - Cheng, Huo Chang Hong, Li - Li Geng, Su Xiao Hui, Shi Wing Wen , Zhang Man - Li (2008), "Chemical constituents of the plants of the genus Calophyllum", Chemistry and Biodiversity 5, pp 2579-2608 Bohle D.S , Fotie J (2006), "Pharmacological and Biological Activities of Xanthones", Anti - infective Agents in Medicinal Chemistry, pp 15-31 David Febrilliant Susanto, Hakun Wirawasista Aparamarta, Arief Widjaja , Setiyo Gunawan (2017), "Identification of phytochemical compounds in Calophyllum inophyllum leaves", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, pp 1-9 Laure Frederic, Bianchini Jean-Pierre, Raharivelomanana Phila (2008), "Screening of anti HIV-1 inophyllum by HPLC - DAD of Calophyllum inophyllum leaf extracts from French Polynesia Island", Analytical Chimica Acta 624, pp 147-153 Ha Minh Hien, Paul WS Heng, Nguyen Van Thi, Nguyen Khac Quynh Cu , Vo thi Bach Hue (2011), "Development and validation of a GC- MS Method for Rapip Determinationof Calophyllolide in Calophyllum inophyllum L.: a quality control approach", Chinese Journal of Natural Medicines (6), pp 429-434 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.37 49] 50] 51] 52] 53] 54] 55] 56] 57] 58] 59] 60] 61] 62] 63] Phụ lục Sawarni Hasibuan, Sahirman , Amar Ma ruf (2014), "The quality of Transparent soap from Farmer's Crude Calophyllum seed oil", International Journal on advanced science angineering information technology 5, pp 47-51 Bouchara J-P, Landreau A., Larcher G., Morel C., Richomme P., Seraphin D , Tronchin G (2004), "Investigation of the antifungal activity pf caledonixanthone E and other xanthones against Aspergillus fumigatus ", Planta Medica 70, pp 569-571 L.Kalyanaraman, R.M0han Kumar, Peddy Vishweshwar, R.Pichai , S.Narasimhan (2010), "5-methoxy-2,2-dimethyl-6-[(E)-2-methylbut-2-enoyl]10-phenylpyrano[2,3-f]chromen-8-one (Calophyllolid)", Acta Cryst E66 Teddy Léguillie, Marylin Lecso-Bornet , et al (2015), "The wound healing and anti - bacterial activity of five ethnomadical Calophyllum inophyllum oils : an alternative therapeutic strategy to treat infected wounds", Plos one 10 (9), pp 120 Soheil Zorofchian Moghadamtousi, Hbash Addul Kadir, Pouya Hassadarvish , et al (2014), "A review on Antibacterial, Antiviral and Antifungal activity of Curcumin", BioMe Research International Volume 2014, pp 337-339 Faiznur Mohd.Fuad , Khairiah Abd.Karim (2017), "Kinetic study of oil extraction from Calophyllum inophyllum seeds using Ultrasonic - assisted Extraction Technique", Journal of Physical Science 28 (2), pp 57-69 Ghaguta Naz, Saiqa Ilyas, Zahida Parveen , Sumera Javed (2010), "Chemical analysis of essential oils from Turmeric (Curcuma longa) Rhizome through GCMS.", Asian Journal of chemistry 22 (4), pp 3153-3158 Czekai R, Majka J, Ptak-Belowska A, Szlachcic A, Targosz A, Magierowska K , Strzalka M (2016), "Role of curcumin in protection of gastric mucosa against stress-induced gastric mucosal damage Involvement of hypoacidity, vasoactive mediators and sensory neuropeptides.", Journal Physiol Pharmacol 67 (2), pp 261-275 Prasad S , Tyagi AK (2015), "Curcumin and its analogues : a potential natural compound against HIV infection AIDS", Food function (11), pp 3412-3419 Julie S.Jurenka (2009), "Anti - imflammatory properties of curcumin, a major constituent of Curuma longa : a review of Precinical and clinical research", Alternative Medicine Review 14 (2), pp 141-147 M.Akram Shahab-Uddin , Afzal Ahmed (2010), "Curcuma longa and Curcumin:a review article", Rom.Journal Biol – Plantbiol (55), pp 65-70 Shanmugapriya , Chen Yang (2016), "Calophyllum inophyllum: A medical Plant with multiple curative values", Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Medical (4), pp 1446-1452 W H Simmons , H A Appleton (2007), The Handbook of Soap Manufacture Ivan Stankoic (2004), "Curcumin ", Chemical and Technical assesment 61 (1), pp 1-6 Leu T., Bianchini J.P., Faure R., Herbette G., Mejer L , Soulet S (2009), "Elastase inhibitors and cancer preventive potential agents from Calophyllum inophyllum grown in French Polynesia", Planta Medica 75 (9), pp 20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.38 64] 65] 66] 67] 68] Phụ lục T.Daveedu , K.Prasad (2014), "Phytochemical examination and anti - solar activity of Calophyllum inophyllum", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science Research (4), pp 76-77 Vandana V, Kodanda Rama Rao CH, Somnath G , Babia L (2017), "Synthesis of Calophyllum inophyllum esters as biofuel feed stock", JOJ Material science (2) Santosh Kumar Yadav, Ajit Kumar Sah, Rajesh Kumar Jha, Phoolgen Sah , Dev Kumar Shah (2013), "Turmeric (Curcumin) remedies gastroprotective action", Pharmacognosy review (13), pp 42-46 Chen Ching Yu, Hung Meng-Chieh, Shen Ya-Ching , Wang Li-Tang (2003), "Inocalophyllins A,B and their methyl esters from the seeds of Calophyllum inophyllum", Chem.Pharm.Bull 51 (7), pp 802-806 Sheng Yu, Hui Yan, Li Zhang, Mingqiu Shan, Peidong Chen, Anwei Ding , Sam Fong Yau Li (2017), "A Review on the Phytochemistry, Pharmacology and Pharmacokinetics of Amentoflavon - a naturally occuring Bioflavonoid", Molecules 2017 22, pp 1-23 ... TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG TH? ?I CURCUMIN I VÀ CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM D? ?U MÙ U – NGHỆ 17 Khảo sát ? ?i? ? ?u kiện chiết calophyllolid curcumin I từ D? ?u Mù u – Nghệ1 7 Khảo sát ? ?i? ? ?u kiện sắc ký ... I m? ?u D? ?u Mù u – Nghệ Hình D SKĐ m? ?u thử D? ?u Mù u – Nghệ thêm chất đ? ?i chi? ?u Hình 4.5 Các SKĐ thẩm định tính đặc hi? ?u quy trình định lượng đồng th? ?i curcumin I calophyllolid D? ?u Mù u – Nghệ HPLC... định lượng, SKĐ m? ?u thử d? ?u Mù u – Nghệ ph? ?i có pic curcumin calophyllolid có th? ?i gian l? ?u phổ UV tương ứng v? ?i pic CĐC curcumin, calophyllolid SKĐ Định lượng curcumin, calophyllolid HPLC: - Quy