BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ỉỊc ĩỊí ỳ ĩj? ĩjí NGUYỄN THỊ HƯỚNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL VÀ QUININ SULFAT TRONG VIÊN NÉN ANTIGRIP F BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược s ĩ KHOÁ 1998-2003) Người hướng dẫn: Nơi thực hiện: Thời gian thực hiện: TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ TS. THÁI DUY THÌN PHÒNG HOÁ LÝ I - VIỆN KIEM n g h iệ m BỘ MÔN HOÁ DƯỢC - ĐẠI HỌC DƯỢC HN 2/2003 ĐẾN 5/2003 Hà Nội 5-2003 LỜI CẢM ƠN Khoá luận thực hoàn thành phòng Hoá Lý -Viện Kiểm nghiệm Bộ môn Hoá Dược-Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong trình thực khoá luận tốt nghiệp, nhận hướng dẫn tận tình thầy cô hướng dẫn, cán phòng Hoá LýlViện Kiểm nghiệm , cán môn hoá dược Trước tiên xin chân thành cảm ơn hướng dẫn tân tình TS. Thái Phan Quỳnh Như-Trưởng phòng Hoá Lý 1-Viện Kiểm nghiệm TS. Thái Duy Thìn -Bộ môn Hoá Dược -Trường Đại học Dược Hà Nội giúp có tài liệu kỹ cần thiết trình thực khoá luận. Đồng thời xin cảm ơn giúp đỡ tận tình thầy cô, kỹ thuật viên khác môn Hoá Dược cán phòng Hoá Lý -Viện Kiểm nghiệm giúp hoàn thành khóa luận thời gian ngắn nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp tài liệu có liên quan. Hà nội, tháng năm 2003 Nguyễn Thị Hướng MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN ĐỂ . Phần 1: TỔNG QUAN 1.1. Paracetamol .3 1.2. Quinin sulfat 1.3. Phương pháp khảo sát khoá luận (HPLC) . Phần 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ .16 2.2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 16 2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 20 2.3.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20 2.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính diện tích pic nồng độ chất: paracetamol quinin sulfat . 25 2.3.3. Khảo sát độ xác .28 2.3.4. Khảo sát độ 31 .3 .5 . ứng dụng phương pháp để định lượng đồng thời paracetamol quinin sulfat viên nén Antigrip F 32 2.4. SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG . 34 2.5. BÀN LUẬN .36 Phần 3: KÊT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT . 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 NHỮNG CHỮ VIẾT TAT CTD-VTYT : Công ty Dược - Vật tư y tế. HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao. nm : Nanomet. |um : Micromet. III : Microlit. : Microgam. PA : Tinh khiết phân tích (pure analysis). SKĐ : Sắc ký đồ. UV-VIS : Tử ngoại - khả kiến ĐẶT VÂN ĐỂ • Với phát triển nhanh chóng khoa học kỹ thuật, đặc biệt cá< thành tựu khoa học ngành dược, dạng bào chế đa thành phần nhằn phối hợp tác dụng dược lý hoạt chất ngày sản xuất, lưi hành, sử dụng rộng rãi. Nhiều biệt dược trở nên quen thuộc với người tiêi dùng. Trong số nhóm thuốc hạ nhiệt, giảm đau phổ biến nhất, thườn) phối hợp thành phần nhằm nâng cao hiệu điều trị đồng thồ giảm bớt tác dụng phụ chất dùng liều cao. Dược điển M1 (USP 24 năm 2000) có nhiều chế phẩm kết hợp Acetaminophen vớ aspirin, cafein, codein, diphenhydramine, pseudoephedrine, aspirin cafein Đối với Quinin sulfat Dược điển Mỹ có chuyên luận viên nén Quinii sulfat đơn thành phần [16]. Trên thị trường Quininsulfat phối hợp vớ Pyrimethamin Sulfadoxin viên Fansimef (xí nghiệp dược phẩm 780 [6 ]. Hiện dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam công thứ< phối hợp Paracetamol Quininsulfat. Trên thị trường có số chế phẩn viên AntigripF Tiphagrip CTD-VTYT Tiền Giang (Tiphaco), viêi Anogin quinin CTD-VTYT Trà Vinh phối hợp Paracetamol vi Quininsulfat để điều trị chứng cảm sốt, nhức đầu, đau mẩy. Để địnl lượng thành phần này, hầu hết dược điển có phương pháp đối vớ chế phẩm đơn thành phần, với chế phẩm đa thành phần tiêi chuẩn nhà sản xuất đưa khác nhau: Phương pháp quang phổ hấ] thụ tử ngoại-khả kiến, phương pháp chuẩn độ môi trường khan, phương pháj acid-base. Các phương pháp thường phải chiết tách phức tạp, tốn nhiềi thời gian. Hiện nhu cầu sử dụng sản xuất thuốc đa thành phần ( nước nhập ngày tăng, đòi hỏi phải tăng cường côn< tác quản lý, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc,. Để đáp ứng nhiệm VI cần phải có biện pháp quản lý chặt chẽ, đồng có phươnị pháp kiểm nghiệm thuốc phù hợp cho phép định lượng hàng loạt chế phẩm loại. Mặt khác với phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật, nhiều máy móc thiết bị với kỹ thuật phân tích đại, đời, áp dụng vào thực tế kiểm nghiệm. Chính luận văn tiến hành nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol quinin sulfat viên nén Antigrip F phương pháp HPLC với mục đích: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol quinin sulfat phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao. - Đánh giá, so sánh với phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến nhằm cho sở lựa chọn áp dụng. Đồng thời mong góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng ngành quốc gia cho dạng thuốc có thành phần tương tự. Phần l:T ổN G QUAN 1.1. PARACETAMOL. [1], [12], [15], [16], 1.1.1. Công thức: HO— — N H - C O —CH3 [C8H9N 2]. - Tên khoa học: N-Acetyl-p-Aminophenol; p-Hydroxyacetanilid. - Tên khác: Acetaminophen. 1.1.2. Tính chất: - Bột kết tinh trắng, không màu, dễ tan ethanol, khó tan nước, hầu không tan cloroform, tan kiềm tạo muối phenolat. - Nhiệt độ nóng chảy từ 168°c - 172°c. - Cho phản ứng -OH phenol tự do: Với Fe3+ cho màu lam tím. - Dễ bị thuỷ phân chức amid không bền. - Tạp chất cần ý: Là p-Aminophenol, thường xác định giới hạn tạp chất phép đo nitrit phương pháp sắc ký lớp mỏng. 1.1.3. Tác dụng dược lý: [7], [12]. - Thuộc nhóm thuốc chống viêm phi steroid có tác dụng hạ nhiệt, giảm đau. So với Aspirin, paracetamol xuất tác dụng nhanh trì lâu hơn, hạ nhiệt êm dịu hơn, giảm đau tốt hơn, tác dụng phụ nên hay dùng để hạ sốt giảm đau hơn. - Không có tác dụng chống viêm chống ngưng kết tiểu cầu chủ yếu ức chế prostaglandin ngoại vi yếu nên dùng để hạ sốt nguyên nhân gây sốt kể trường hợp chống định Aspirin (sốt xuất huyết, sốt virus). - Với liều điều trị thông thường paracetamol tác dụng phụ, không gây rối loạn đông máu không gây tổn thương đường tiêu hoá. - Liều cao người lớn gây viêm gan, hoại tử gan. 1.1.4. Một số phương pháp áp dụng để định lượng paracetamol Phương pháp chuẩn độ nitrit: [1], [10]. Nguyên tắc: Thuỷ phân paracetamol môi trường acid HC1 10% nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một, chuẩn độ dung dịch natri nitrit môi trường acid tạo hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá). Phương pháp đo quang: [15]. Nguyên tắc:Dựa vào khả hấp thụ tử ngoại phân tử paracetamol methanol có cực đại hấp thụ 245 nm môi trường kiềm có cực đại hấp thụ 257 nm. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: [4], [10], [16]. Nguyên tắc: Dựa vào khả phân bố khác Paracetamol pha tĩnh pha động, trình sắc ký thực được. Kỹ thuật phát dựa vào tính chất hấp thụ u v nêu Định lượng nỉtơbằng phương pháp Kendal: [12] Nguyên tắc: Phương pháp dựa phân huỷ phân tử hữu có chứa nitơ đun với H2S0 đặc với có mặt Kali hay Natri sulfat. Khi nitơ chuyển thành NH3, kết hợp với H2S0 tạo thành (NH4)2S04. Thêm NaOH vào hỗn hợp phản ứng cất kéo NH3 giải phóng nước vào dung dịch chuẩn H2S0 0.1N dư, chuẩn độ acid dư dung dịch NaOH 0.1N. ❖ Định lượng theo phương pháp đo Cerỉ: [1], [14]. Nguyên tắc: Trong dung dịch acid có mặt Paracetamol chất khử, Ceri IV chất oxy hoá kết hợp với điện tử chuyển thành Ceri III. Phát điểm kết thúc feroin (phức chất sắt 0-phenatrolin), sắt phức hợp sắt II sắt III. Phức chất sắt II có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh. Khi đến điểm tương đương, lượng Ceri IV thừa oxy hoá phức chất sắt II thành sắt III thị chuyển màu. [(Cl2H8N 2)3Fe]2+ - e' ► [(C12H8N 2)3Fe]3+ 1.2. QUININ SULFAT. [1], [3]. 1.2.1.Công thức + Nguồn gốc: Là alcaloid phân lập từ vỏ canh ki na [C20H24N2O2)2.H2SO4]. Phân tử Quinin gồm nhân quinolin gắn với nhân quinuclidin qua nhóm alcol bậc hai. + Tên khoa học: bis[(R)-(6-methoxyquinolin-4-yl)-[(2S,4S,5R)-5ethenyl-l-azabicyclo[2 .2 .2 ]oct-2 -yl]methanol] sulfat. 1.2.2. Tính chất: - Bột kết tinh trắng gần trắng tinh thể hình kim không màu, mịn. Vị đắng. Khó tan nước, tan nước sôi ethanol 96%, thực tế không tan ether. - Quinin có tính base hai nitơ mang lại, ứng dụng để điều chế muối quinin vững bền muối dễ hoà tan nước pha dung dịch tiêm. 1.2.3. Tác dụng dược lý: [7], [3]. + Có tác dụng chủ yếu lên thể vô tính hồng cầu, với p.falciparum. Còn diệt giao bào p.vivax p.malariae máu không diệt thể giao tử cuả p.falciparum. Là thuốc phòng cắt sốt, quinin độc tác dụng cloroquin nên hay dùng cho người bệnh vùng mà p.falciparum kháng với cloroquin . + Tác dụng hạ nhiệt: Thường phối hợp với paracetamol để điều trị chứng cảm sốt, nhứe đầu, đau mẩy. + Vị đắng, giúp ăn ngon, dễ tiêu (rượu bổ quinquina). 1.2.3.MỘÍ số phương pháp áp dụng để định lượng quinin sulfat: phương pháp đo acid môi trường khan: [1], [3]. Nguyên tắc: Hoà tan muối quininsulfat acid acetic khan acetic (có thể sử dụng nhiệt độ). Chuẩn độ acid percloric 0.1N, thị tím tinh thể. ❖ Phương pháp acid-base: [11]. Nguyên tắc: Định lượng H2S0 tổ hợp NaOH: Chế phẩm hoà tan hỗn hợp dung môi cồn - cloroform trung tính chuẩn độ NaOH 0.1N tới màu hồng, thị phenolphtalein. Phương pháp đo quang: [3], [13]. Nguyên tắc: Dựa vào khả hấp thụ tử ngoại phân tử quinin sulfat môi trường acid HC1 0,1 N có cực đại hấp thụ 250 nm. Phương pháp HPLC: [6], [16]. Nguyên tắc: Dựa vào khả phân bố khác quinin sulfat pha tĩnh pha động, trình sắc ký thực được. Kỹ thuật phát dựa vào tính chất hấp thụ u v nêu 1.3. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRONG KHOÁ LUẬN (HPLC): 1.3.1. Khái quát phương pháp sác ký lỏng hiệu cao. [1], [5], [9]. ❖ Khái niệm: sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hoá học với - Tại bước sóng 220 225 nm, pic có diện tích không thật lớn, đường nhiễu. - Tại bước sóng 290 305 nm, pic cân xứng, nhiên đáp ứng nhỏ dẫn đến diện tích pic nhỏ. - Tại bước sóng 235 nm, píc cân xứng, đáp ứng đủ lớn, bước sóng thích hợp lựa chọn. Tóm lại: Qua tham khảo tài liệu tiến hành thực nghiệm, xây dựng chương trình sắc ký định lượng đồng thời paracetamol quininsulfat sau: - Cột Lichrosorb RP 18 (250 X mm; 5|j,n). - Detector UV: 235nm. - Pha động: l,lg natriheptansulfonat lit hỗn hợp methanol-acid acetic 4%-diethylamin tỉ lệ (650: 350: 1) - Tốc độ dòng: lml/phút - Thể tích tiêm: 20|nl - Nhiệt độ phòng Với chương trình HPLC chọn, sắc ký đồ phân tách chất gần tối ưu, thời gian lưu paracetamol không nhỏ 2,3 phút quinin sulfat 4,9 phút thu sắc ký đồ tách tốt. 2.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính diện tích píc nồng độ chất: paracetamol quininsulfat. Chúng tiến hành khảo sát phụ thuộc tuyến tính nồng độ chất cần định lượng với diện tích pic chất chuẩn paracetamol quininsulfat. Pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp thành phần 25 paracetamol có nồng độ biến thiên khoảng |xg/ml đến 150fxg/ml Quinin sulfat từ l,2|xg/ml đến 30|xg/ml. Trong bình định mức 100 ml, cân xác khoảng 150 mg chất chuẩn paracetamol, 30 mg chất chuẩn quinin sulfat, hoà tan thêm dung môi hỗn hợp ethanol: nước tỷ lệ (1:1) vừa đủ. Từ dung dịch này, sau pha loãng với pha động (sử dụng bình định mức 25 ml) để có dung dịch chuẩn có nồng độ sau: bảng Bảng 1: Các nồng độ dung dịch chuẩn * (jug/ml) 12 30 60 150 Quininsulfat 1,2 2,4 12 30 Bình Paracetamol (ng/ml) Chạy sắc ký dung dịch theo điều kiện nêu trên. Kết độ tuyến tính khoảng tuyến tính trình bày bảng minh hoạ hình 9. Bảng 2: Kết khảo sát độ tuyến tính Quinin sulfat Paracetamol Hoạt chất Diện tích pic 576,90 Nồng độ ([Xg/ml) 1,2 12 1131,30 2,4 194,88 30 2794,50 458,26 60 5566,50 12 897,22 150 13882,50 30 2214,10 Diện tích pic Nồng độ (ng/ml) Dung dịch 26 107,09 Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính Hệ số tương khảo sát quan Paracetamol 6-150 ng/ml r = 0,9999 y = 92,4 X + 22,5 Quinin sulfat 1,2 - 30 p.g/ml r = 0,9999 y = 73,16 X + 19,3 Hoạt chất Hình 8: Biểu đồ biểu diễn phụ thuộc diện tich pic Paracetamol vào nồng độ 27 sulfat vào nồng độ ❖ Nhận xét: Kết trình bày (bảng hình , 9) cho thấy khoảng nồng độ chất khảo sát, diện tích pic đáp ứng thu sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ chúng, khoảng phụ thuộc tuyến tính nồng độ chất khảo sát diện tích pic tương ứng rộng với hệ số tương quan tương ứng r =0,9999 (Paracetamol), r=0,9999 (Quinin sulfat) chứng tỏ phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ. Trên sở chọn nồng độ để định lượng thuốc đa thành phần nằm khoảng tuyến tính khảo sát: Paracetamol 30|xg/ml, Quinin sulfat |JLg/ml. 2.3.3. Khảo sát độ xác Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử sau: 28 + Dung dịch thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn, cân xác lượng bột viên tương đương với 1/5 khối lượng trung bình viên. Hoà tan 50 ml hỗn hợp dung môi (ethanol - nước tỷ lệ 1:1). Hút xác ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 20ml, thêm dung môi pha động tới vạch để nồng độ chất khoảng paracetamol 30fxg/ml, quinin sulfat [Ig/ml. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 |um. Chuẩn bị mẫu + Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp paracetamol quinin sulfat có nồng độ tương ứng với dung dịch thử paracetamol 30|xg/ml, quinin sulfat |xg/ml. Chuẩn bị cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động 30 phút, sau tiến hành chạy sắc ký dung dịch thử dung dịch chuẩn chuẩn bị theo chương trình sắc ký nêu. Ghi diện tích pic thu sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn tương ứng. Tính hàm lượng paracetamol quininsulfat có mẫu thử dựa mẫu chuẩn biết hàm lượng theo công thức sau: X(mg/viên) = S t * C * M sc x mT Trong đó: - Sp Sc diện tích pic dung dịch thử chuẩn - c nồng độ chất chuẩnjCjưg/ĩnl) - mT lượng cân mẫu thử (mg) - M khối lượng trung bình viên (mg) 29 I Bảng 3. Sô liệu diện tich pic dung dịch thử chuẩn Dung dịch chuẩn Dung dịch thử Lượng cân (mg) Chuẩn Diện tích pic M= 293,8 mg Paracetamol Quinin Paracetamol sulfat Quinin sulfat 58,8 2855,11 433,90 58,9 2795,14 431,90 Nồng độ 59,4 2829,41 434,68 Og/ml) 57,7 2722,88 433,64 58,1 2763,58 438,89 58,7 2832,59 449,85 30,15 6,13 2808,47 468,57 Diện tích pic (trung bình lần tiêm) Độ lặp lại phương pháp đánh giá sai số tương đối (s %) phép thử song song. Bảng 4: Kết khảo sát độ lặp lại Quinin sulfat Paracetamol STT Hàm lượng Số liệu thống kê (mg/v) Hàm lượng Sô liệu thống kê (mg/v) 153,12 ^=150,60 28,36 ^=28,66 149,60 5=1,66 28,17 £=0,52 if,) =0,68 28,10 150,06 £%=l,lố% 148,79 S%=1,88% n=6 28,88 a=0,05 149,89 152,15 3*>=0.21 11=6 ct=0,05 t„=2,57 29,01 29,45 30 ta=2,57 Nhận xét: Kết trình bày (bảng 4) cho thấy, với chương trình sắc ký chọn, phương pháp định lượng đồng thời paracetamol quinin sulfat có độ lặp lại cao, sai số tương đối nhỏ (sai số tương đối paracetamol 1,16%; khoảng tin cậy X ± ta ^ = ,6 ±1,75. Sai số tương đối quinin sulfat 1,88%, khoảng tin cậy 28,66 ±0,54). Với kết cho phép áp dụng chương trình để định lượng chế phẩm có công thức chứa hai thành phần trên. 2.3.4. Khảo sát độ phương pháp HPLC Độ phương pháp xác định phương pháp thêm lượng xác paracetamol quinin sulfat chuẩn vào lượng mẫu thử xác định hàm lượng paracetamol quinin sulfat mục “khảo sát độ lặp lại' cho tổng nồng độ chúng dung dịch thử nằm khoảng tuyến tính khảo sát. Dung dịch chuẩn hỗn hợp: pha hỗn hợp ethanol - nước đồng thể tích (Paracetamol: 0,75 mg/ml, quinin sulfat: 0,15 mg/ml). Cách tiến hành sau: + Mẫu thử: chuẩn bị mẫu Cân xác lượng chế phẩm có chứa khoảng 7,5 mg paracetamol vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn, thêm hỗn hợp ethanol - nước đồng thể tích, lắc kỹ cho tan sau thêm dung môi vừa đủ. Lọc, hút xác 10 ml dịch lọc vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ để nồng độ chất khoảng paracetamol 30|xg/ml, quinin sulfat |xg/ml. lọc qua màng lọc 0,45 |im. Đo HPLC song song với chuẩn. Kết khảo sát trình bày bảng 5: 31 Bảng5: Kết khảo sát độ Hoạt chất Paracetamol Lượng có sẵn mẫu thử (mg) 7,62 7,45 7,5 7,38 98,4 7,71 7,5 7,48 99,7 Lần thực nghiệm Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg%) Tỷ lệ thu hồi (%) 7,5 7,43 99,0 99,0 Trung bình Quinin sulfat 1,45 1,5 1,47 98,0 1,42 1,5 1,48 98,6 ■3 1,47 1,5 1,52 101,3 99,3 Trung bình Nhận xét: Dựa vào hàm lượng paracetamol quininsulfat biết mẫu thử, hàm lượng chất chuẩn vào diện tích pic sắc ký đồ tính hàm lượng chất thu hồi lại. Kết bảng cho thấy khả tìm lại với hai chất dao động từ 99,0% đến 99,3% có nghĩa phương pháp có độ cao, kết định lượng chấp nhận được. 2.3.5. ứng dụng phương pháp để định lượng đồng thời paracetamol quinỉn sulfat viên nén Antigrip F. Trên sở điều kiện sắc ký khảo sát, chọn nồng độ định lượng mẫu chuẩn thử nằm khoảng tuyến tính khảo sát. Sau tiến hành định lượng phương pháp ngoại chuẩn, có nghĩa so sánh diện tích pic mẫu chuẩn mẫu thử thực điều kiện sắc ký, từ tính hàm lượng paracetamol quinin sulfat chế phẩm cần phân tích theo công thức: 32 X(mg/viên) = ST * C x M scxmT Trong đó: - Sp Sc diện tích pic dung dịch thử chuẩn - c nồng độ chất chuẩru^ yig/Tcii) - mT lượng cân mẫu thử (mg) - M khối lượng trung bình viên (mg) Phương pháp tiến hành thực giống phần khảo sát độ lặp lại. Kết thu trình bày bảng . Bảng 6: Kết định lượng đồng thòi hai chất chương trình sắc ký xây dựng Paracetamol STT Hàm lượng Quỉnin sulfat Sô liệu thống kê Hàm lượng (mg/v) 153,28 149,71 (mg/v) ~x=ì50,60 5=1,58 28,41 *=28,68 28,20 5=0,49 v)=0,65 150,32 148,83 149,95 151,52 ,) =0,20 28,15 £%=1,10 6% =1,79% 28,91 n=6 a=0,05 29,05 ta=2,57 n=6 a=0,05 ta=2,57 29,33 khoảng tin cậy: khoảng tin cậy: 150,60 ± 1,67 ~x Sô liệu thống kê ~x± tasx ± Nhận xét: Kết định lượng bảng 28,68 ±0,51 cho thấy sai số tương đối phương pháp nhỏ, độ xác cao. Chế phẩm viên nén Antigrip F đem định lượng 33 chứa Paracetamol 150,60 ± 1,67 (mg/v) với sai số tương đối 1,1%. Quinin sulfat 28,68 ±0,51 (mg/v) với sai số tương đối 1,79%. Kết chấp nhận được. 2.4. SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HPLC THỰC HIỆN TRONG KHOÁ LUẬN VỚI PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG . [12] Bảng 7: Kết so sánh hai phương pháp HPLC đo quang Hoạt chất HPLC UV-VIS So sánh (test F) (test t) *=150,60 ^=149,69 5* =2,76 iS2=1,35 n=6 n=6 ^=28,66 *=29,23 S1=0,27 5s =0,18 n=6 n=6 Paracetamol Quỉnin sulfat Ftn=2,04 < F(5f5;0i05)=5,05 < t(0,05; 10)=2,23 Ftn=1,50 < F(55;(ự)5)=5,05 tTN=2,10 < t(0>05; 10)=2,23 Nhận xét: - Độ xác hai phương pháp (test F) : Kết cho thấy hai phương sai khác ý nghĩa thống kê. Có nghĩa hai phương pháp có độ xác ngang với xác suất p=0,95. - Kết định lượng (test t): Kết định lượng hai phương pháp hai thành phần paracetamol quinin sulfat khác ý nghĩa thống kê với xác xuất p=0,95. ĐẢNH GIÁ ƯU. NHƯƠC ĐIỂM CỦA HAI PHƯƠNG PHÁP: ❖ Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến: + Ưu điểm: 34 - Kỹ thuật đơn giản, thao tác dễ dàng. - Dung môi sẵn có . - Kết định lượng tin cậy. + Nhược điểm: - Không định lượng đồng thời thành phần hỗn hợp, phải qua trình tách chiết phức tạp tốn nhiều thời gian, dung môi, hoá chất. - Dễ xảy sai số trình chiết tách, cần có tay nghề ổn định. - Định tính thành phần không đặc hiệu. ❖ Phương pháp HPLC + Ưu điểm: - Tiến hành nhanh. - Kết định lượng xác. - Định lượng đồng thời thành phần hỗn hợp mà không qua giai đoạn chiết tách. - Tránh sai số hệ thống máy móc chuẩn hoá được. + Nhược điểm: - Hiện trang thiết bị HPLC giá thành cao. - Các dung môi dùng HPLC thường dùng loại tinh khiết sắc ký giá thành cao. LƯA CHON PHƯƠNG PHÁP Các kết thu qua xử lý thống kê cho thấy hai phương pháp cho kết định lượng nằm giới hạn cho phép, độ lặp lại độ cao với sai số tương đối phương pháp UV- VIS 0,81% paracetamol 1,49% quinin sulfat. Sai số tương đci phương pháp HPLC 1,16% paracetamol 1,88% quinin sulfat. tỷ lệ hoạt chất tìm thấy từ 99,0% đến 99,3%- Độ xác hàm lượng trung bình thành phần hoạt chất hỗn hợp tương đối gần nhau, sai 35 số ý nghĩa thống kê. hai phương pháp cho kết tin cậy có sai số phạm vi cho phép. Tuy nhiên, qua thực nghiệm cho thấy định lượng đồng thời hoạt chát phương pháp HPLC giúp người thực tiết kiệm thời gian tránh sai sót trình làm qua giai đoạn chiết tách, đồng thời thao tác đơn giản hơn. Tuy giá thành trang thiết bị cho HPLC cao, với thực tế xí nghiệp phấn đấu đạt tiêu chuẩn GMP việc trang bị máy HPLC không vấn đề khó khăn. Chính vậy, thấy rằng: Để định lượng hỗn hợp paracetamol quinin sulfat chế phẩm nên sử dụng phương pháp HPLC. 2.5. BÀN LUẬN Phương pháp HPLC phương pháp phân tích đại, bước đưa vào phòng kiểm nghiệm trung tâm kiểm nghiệm. Ưu điểm chung phương pháp có ổn định, độ chọn lọc cao tiến hành đơn giản, nhanh định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất không cần tách trước đo. Kết thực nghiệm với việc sử lý thống kê cho thấy phương pháp định lượng chấp nhận được. Trên sắc ký đồ, pic có độ phân giải rõ ràng. Hệ số tương quan tuyến tính r=0.9999 với klhoảng khảo sát rộng cho phép áp dụng với nhiều chế phẩm tương tự có tỷ lệ thành phần khác nhau. Độ lặp lại với sai số tương đối paracetamol 1,16%; quinin sulfat đến 1,88% độ từ 99,0% đến 99,3%- Phương pháp xử lý mẫu đơn giản phân tách tốt chất hỗn hợp, dễ thực thời gian ngắn. Tuy diện tích pic hoạt chất thu có độ chênh lệch lớn hàm lượng hoạt chất có tỷ lệ khác có độ hấp thụ tử ngoại khác nhau. Nhưng pic cách xa chứng tỏ ảnh hưởng lẫn định lượng. Kết thực nghiệm chứng tỏ chương trình xây dựng 36 có độ tin cậy cao, độ lặp lại độ tốt, kỹ thuật tiến hành đơn giản, nhanh chóng dễ thực hiện. 37 Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. Kết luận Trong trình làm luận văn rút số kết luận sau: Vận dụng kiến thức học để tiến hành nghiên cứu đề tài, nâng cao kỹ thực hành khả tra cứu tài liệu. ❖ Nắm lý thuyết phương pháp HPLC, phương pháp phân tích đại có nhiều ứng dụng kiểm nghiệm thuốc. ❖ Xây dựng chương trình định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần paracetamol quinin sulfat phương pháp HPLC. Kết cho thấy phương pháp có độ tuyến tính, độ xác độ cao. ❖ Đánh giá, so sánh phương pháp HPLC với phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến. 3.2. Đề xuất Với kết khảo sát đạt được, cho phương pháp HPLC ứng dụng kiểm nghiệm để định tính định lượng thuốc có thành phần trung tâm kiểm nghiệm, phòng kiểm nghiệm đơn vị sản xuất có điều kiện trang bị máy sắc ký lỏng hiệu cao. Có thể tiếp tục khảo sát hoàn chỉnh phương pháp để đưa vào Dược điển Việt Nam lần xuất tới. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học Hà Nội, trang 1, 245, PL-84, PL-85. 2. CTD - VTYT Tiền Giang "Tiêu chuẩn sở viên nén bao đường ANTIGRIP F". 3. Trần Đức Hậu (1998), Hoá dược tập II, Đại học dược Hà Nội, trang 302. 4. Bùi Thị Hoà, Nguyễn Thị Hoàng Liên, Trịnh Văn Quỳ (2002), "Định lượng Paracetamol, oxomemazin hydroclorid, guaifenesin, natri benzoat thuốc trị ho phương pháp HPLC", Thông báo Kiểm nghiệm tháng 01, trang 7-10. 5. Phạm Gia Huệ - Trần Tử An (1998), Hoá phân tích, Đại học Dược Hà Nội, tập 2, (chương V, chương VI). 6. Trần Việt Hùng, Thái Phan quỳnh Như (1997), "Định lượng đồng thời thành phần Quinin sulfat, Sulfadoxin, Pyrimethamin hỗn hợp thuốc sốt rét phương pháp HPLC", Thông báo kiểm nghiệm tháng 2, trang 5-7. 7. Hoàng Tích Huyền - Đào Văn Phan - Nguyễn Trọng Thông (1999), Dược lý học, Đại học Y Hà Nội, NXBY học Hà Nội, trang 184, 293. 8. Phạm Luận (1989), Giáo trình sỏ lý thuyết sắc ký lỏng cao áp -HPLC. 9. Thái Phan Quỳnh Như (2001), ứng dụng phương pháp chia tách kiểm nghiệm thuốc, Viện Kiểm nghiệm-Bộ y tế. 10.Đỗ Thị Oanh (2001), Góp phẩn nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol caffeine thuốc đa thành phần, khoá luận tốt nghiệp dược sĩ khoá 996-2001. 11.Thái Duy Thìn (1992), Giáo trình thực tập hoá dược, trang 58. 39 ^ 12.Thái Duy Thìn - Nguyễn Văn Thục (1998), Hoá dược tập /, Đại học Dược Hà Nội, trang 90. 13.Trần thị Thuý (2003), Định lượng paracetamol quinin sulfat viên nén Antigrip F phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại, khoá luận tốt nghiệp dược sĩ khoá 1998 - 2003. ÌA.British Pharmacopoeia (1998), volum I, trang 994, 1129-1130. 15.Pharmacopoeia o f The people’s Republic o f China (1997), Volume II, trang 444-445. \6.The United States Pharmacopoeia 24 (2000), trang 17-22, 1458-1460. 40 [...]... dụng phương pháp để định lượng đồng thời paracetamol và quinỉn sulfat trong viên nén Antigrip F Trên cơ sở các điều kiện sắc ký đã khảo sát, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và thử nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Sau đó tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, có nghĩa là so sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử được thực hiện trên cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng. .. của phương pháp HPLC Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm một lượng chính xác paracetamol và quinin sulfat chuẩn vào một lượng mẫu thử đã được xác định hàm lượng paracetamol và quinin sulfat ở mục “khảo sát độ lặp lại' sao cho tổng nồng độ của chúng trong các dung dịch thử nằm trong khoảng tuyến tính đã được khảo sát Dung dịch chuẩn hỗn hợp: pha trong hỗn hợp ethanol - nước đồng. .. xác định đồng thời paracetamol và quinisulfat: Tiến hành đo phổ hấp thụ tử ngoại của hai chất này, dựa trên nguyên tắc chọn bước sóng phát hiện ưu tiên cực đại hấp thụ của chất có hàm lượng nhỏ hoặc có độ hấp thụ riêng nhỏ Đồng thời kết hợp với quá trình thực nghiệm để lựa chọn bước sóng thích hợp Để định lượng đồng thời hai thành phần là paracetamol và quinin sulfat trong viên nén Antigrip F bằng phương. .. 98,6 ■3 Quinin sulfat 1,47 1,5 1,52 101,3 99,3 Trung bình Nhận xét: Dựa vào hàm lượng paracetamol và quininsulfat đã biết trong mẫu thử, hàm lượng của các chất chuẩn và căn cứ vào diện tích pic trên sắc ký đồ sẽ tính được hàm lượng các chất thu hồi lại Kết quả ở bảng 5 cho thấy khả năng tìm lại được với cả hai chất dao động từ 99,0% đến 99,3% có nghĩa là phương pháp có độ đúng cao, kết quả định lượng. .. mẫu thử (mg) - M là khối lượng trung bình viên (mg) ❖ Đánh giá phương pháp đã xây dựng và so sánh với phương pháp UVVIS - So sánh về kết quả định lượng của hai phương pháp - So sánh độ chính xác của hai phương pháp - So sánh hai giá trị trung bình - Đánh giá ưu, nhược điểm của hai phương pháp 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp dùng trong khoá luận là phương pháp HPLC - Bằng thực nghiệm tìm các... khoảng paracetamol 30fxg/ml, quinin sulfat 6 [Ig/ml Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 |um Chuẩn bị 6 mẫu như vậy + Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị một dung dịch chuẩn hỗn hợp paracetamol và quinin sulfat có nồng độ tương ứng với dung dịch thử paracetamol 30|xg/ml, quinin sulfat 6 |xg/ml Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong 30 phút, sau đó tiến hành chạy sắc ký từng dung dịch thử và dung... trình bày ở (bảng 3 và 4) cho thấy, với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat có độ lặp lại cao, sai số tương đối nhỏ (sai số tương đối của paracetamol là 1,16%; khoảng tin cậy X ± ta ^ = 1 5 0 ,6 0 ±1,75 Sai số tương đối của quinin sulfat là 1,88%, khoảng tin cậy 28,66 ±0,54) Với kết quả này cho phép áp dụng chương trình để định lượng các chế phẩm... quá 2,3 phút và của quinin sulfat là 4,9 phút thu được sắc ký đồ tách khá tốt 2.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ các chất: paracetamol và quininsulfat Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ các chất cần định lượng với diện tích pic trên các chất chuẩn paracetamol và quininsulfat Pha một dãy dung dịch chuẩn của hỗn hợp 2 thành phần 25 paracetamol. .. tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, có nghĩa là so sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử được thực hiện trên cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng paracetamol và quinin sulfat trong chế phẩm cần phân tích theo công thức: X(mg /viên) = Trong đó: _ — M x scX m T - Sp và Sc là diện tích pic của các dung dịch thử và chuẩn - c là nồng độ chất chuẩn£ >£>/ m t ) - mT là lượng cân... nén Antigrip F bằng phương pháp HPLC, chúng tôi tiến hành: •c i V + Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký 17 + Khảo sát độ tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ paracetamol và quinin sulfat với diện tích pic trên sắc ký đồ + Khảo sát độ chính xác của phương pháp + Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và thử nằm trong khoảng tuyến tính đã . bằng phương pháp HPLC với mục đích: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Đánh giá, so sánh với phương pháp quang. NỘI ỉỊc ĩỊí ỳ ĩj? ĩjí NGUYỄN THỊ HƯỚNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL VÀ QUININ SULFAT TRONG VIÊN NÉN ANTIGRIP F BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ. dụng phương pháp để định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat trong viên nén Antigrip F 32 2.4. SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG 34 2.5. BÀN LUẬN 36 Phần 3: KÊT LUẬN VÀ