BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Đức Tuấn Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ………… ) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ Nguyễn Đức Tuấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan metronidazol 1.2 Tổng quan spiramycin I 1.3 Xử lý mẫu huyết tương 1.4 So sánh hướng dẫn thẩm định quy trình định lượng thuốc dịch sinh học US-FDA EMA 1.5 Một số cơng trình định lượng metronidazol spiramycin I huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Chuẩn bị mẫu 15 2.2.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 16 2.2.3 Khảo sát chuẩn nội 16 2.2.4 Khảo sát điều kiện sắc ký 16 2.2.5 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương 17 2.2.6 Thẩm định quy trình 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 23 3.2 Khảo sát chuẩn nội 24 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 25 3.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương 33 3.5 Xác định khoảng nồng độ định lượng metronidazol spiramycin I huyết tương người 35 3.6 Thẩm định quy trình 35 3.7 Dự thảo quy trình 43 3.8 Bàn luận 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt ACN Acetonitrile AUC Area under cover (Diện tích đường cong) APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học áp suất khí quyển) AS Analytical Substance (Chất phân tích) CE Collision cell (Buồng va chạm) FAB Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) Cmax Nồng độ đỉnh CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) ECD Electron capture detection (Đầu dò cộng kết điện tử) ESI Electrospray Ionization (Ion hóa cách phun điện) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm) FI Field Ionization (ion hóa trường) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu) HQC High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IS Internal standard (Chuẩn nội) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc tế Hóa học túy ứng dụng) LC Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) i Báo cáo tổng kết đề tài LC-MS/MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ/Khối phổ) LLE Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng) LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MQC Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM) MeOH Methanol MF Matrix effect (Ảnh hưởng mẫu) MET Metronidazole ROX Roxithromycin PPT Protein precipitation (Tủa protein) CV Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) SRM Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM) SPY I Spiramycin I TB Trung bình TIN Tinidazole Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh t1/2 Thời gian bán thải ULOQ Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) ii Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thông số dược động học thuốc đối chứng thuốc thử Bảng 1.2 Các thông số dược động học spiramycin Bảng 1.3 So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 EMA 2015 Bảng 1.4 Một số cơng trình định lượng metronidazol spiramycin huyết tương người Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu chuẩn nội sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Nồng độ lý thuyết dung dịch chuẩn dung dịch kiểm tra (QC) Bảng 3.1 Tóm tắt thông tin khảo sát nội chuẩn Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ thu hồi với dung môi tủa protein mức nồng độ MQC Bảng 3.3 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương Bảng 3.4 Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) Bảng 3.5 Kết xác định giới hạn định lượng MET SPY I Bảng 3.6 Tương quan nồng độ MET huyết tương tỷ số diện tích pic MET/IS Bảng 3.7 Tương quan nồng độ SPY I huyết tương tỷ số diện tích pic SPY/IS Bảng 3.8 Hiệu suất chiết MET, SPY I ROX (n = 6) Bảng 3.9 Kết thẩm định độ độ xác phương pháp Bảng 3.10 Độ ổn định MET SPY I (n = 6) Bảng 3.11 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu phân tích MET SPY I Bảng 3.12 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu tồn dư MET, SPYI ROX Bảng 3.13 Kết đánh giá độ pha loãng MET, SPY I huyết tương iii 10 14 14 15 25 35 35 36 37 38 38 39 39 40 41 41 42 Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học metronidazol Hình 1.2 Cấu trúc hóa học spiramycin Hình 3.1 Phổ khối SPY I (A), MET (B), ROX (C) TIN (D) Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1% MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x mm; µm), nhiệt độ cột 40oC, thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động (A đến C) pha động (D) Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động (A), (B), (C) (D), (E) (F) Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động có pH 2,5 (A), pH (B), pH 7,5 (C) pH 8,0 (D) Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch MQC với cột sắc ký khác (nhiệt độ cột 40oC) (A) Cột Nucleosil C18 (150 x 4,6 mm; µm) (B) Cột Nucleosil C8 (150 x 4,6 mm; µm) (C) Cột Gemini NX-C18 (100 x 3,0 mm; µm) (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; µm) (E) Cột Zorbax C18 (250 x 4,6 mm; µm) Hệ pha động ACN - amoni format mM pH 7,4 (80:20) Thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác (A) 30oC, (B) 35oC, (C) 40oC Hệ pha động amoni format mM pH 7,4 - ACN (20:80) Thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch MQC với tốc độ dòng khác (A) 0,3 ml/phút, (B) 0,4 ml/phút, (C) 0,5 ml/phút Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch MET, SPY I ROX nồng độ MQC Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch MQC với dung môi tủa protein khác (A) tủa ACN, (B) tủa MeOH Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch MQC với dung môi tủa protein khác (A) tủa ACN dung dịch NaOH 0,01 N; (B) (C) tủa ACN dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa ACN dung dịch NaOH N; (E) tủa ACN dung dịch acid formic 1%; (F) tủa MeOH dung dịch acid formic 1% Hệ pha động amoni format mM pH 7,4 ACN (20:80) Nhiệt độ cột 40oC Thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu huyết tương tự tạo chứa MET, ROX SPY I Hình 3.14 Cơng thức cấu tạo spiramycin I gồm có phân tử đường iv 24 25 26 27 28 30 31 32 33 33 34 36 36 49 Báo cáo tổng kết đề tài ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện dạng thuốc phối hợp metronidazol spiramycin với liều cố định sử dụng phổ biến nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn miệng cấp tính, mạn tính dự phòng nhiễm khuẩn chỗ sau phẫu thuật nha khoa Việt Nam Ngoài việc sử dụng thuốc kháng viêm giảm đau điều trị nhiễm trùng miệng, kháng sinh có vai trị quan trọng việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng miệng nướu răng, lợi…Các vi khuẩn gây bệnh vùng miệng đa dạng, thường bao gồm hai loại kỵ khí hiếu khí nên phối hợp kháng sinh để điều trị cần thiết Việc phối hợp metronidazol spiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệp đồng ức chế số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lần metronidazol giảm MIC 10 lần spiramycin [1], giảm tác dụng không mong muốn Spiramycin kháng sinh thuộc nhóm macrolid phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần spiramycin I, II III, hàm lượng spiramycin I 85%, spiramycin II spiramycin III không 5% 10% [2],[3] Spiramycin I có hoạt tính sinh học cao số ba đồng phân [4] Vì vậy, spiramycin I thường chọn chất đại diện để định lượng spiramycin [3],[5],[6] Trên giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượng metronidazol dịch sinh học [3],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14] spiramycin I [3],[5],[6],[15] Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I mẫu huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS có cơng trình cơng bố thời điểm [3] Trong nước, chưa có cơng trình cơng bố phương pháp định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I huyết tương người Báo cáo tổng kết đề tài Thị trường Việt Nam lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol spiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, sản xuất nước với giá thành rẻ so với thuốc ngoại nhập hàm lượng Tuy nhiên, chế phẩm chưa đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất nước, thuốc generic cần chứng minh tính hiệu an toàn điều trị qua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc Xuất phát từ lý trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC – MS/MS)” thực với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I huyết tương người kỹ thuật LC – MS/MS - Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I huyết tương người kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn USFDA EMA Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan metronidazol (MET) 1.1.1 Danh pháp, cấu trúc - Cấu trúc hóa học: Hình 1.1 Cấu trúc hóa học metronidazol - Danh pháp IUPAC: (Metronidazol 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1yl)-ethanol [16] - Công thức phân tử: C6H9N3O3 [16] - Khối lượng phân tử: 171,2 g/mol [16] 1.1.2 Tính chất lý hóa - Metronidazol bột kết tinh màu trắng vàng gần trắng, dễ hút ẩm [16] - Tính chất: khó tan nước, aceton, ethanol 96% methylen clorid [16] - pKa = 2,5 [12] - Điểm chảy: 159 - 162oC [17] 1.1.3 Cơ chế tác dụng dược động học 1.1.3.1 Cơ chế tác dụng Metronidazol dẫn chất 5-nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng động vật nguyên sinh amip, Giardia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis vi khuẩn kỵ khí Trong ký sinh trùng, nhóm 5nitro thuốc bị khử thành chất trung gian độc với tế bào Các chất liên kết với cấu trúc xoắn phân tử DNA làm vỡ sợi cuối làm tế bào chết Nồng độ trung bình có hiệu metronidazol µg/ml Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục 6: Sắc ký đồ liệu thô khảo sát hiệu suất chiết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-10 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-11 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục 7: Sắc ký đồ liệu thô thẩm định độ xác độ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-12 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-13 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-14 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục 8: Sắc ký đồ liệu thô khảo sát độ ổn định mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-15 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-16 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-17 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-18 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-19 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-20 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-21 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục 9: Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-22 Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục Phụ lục 10: Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài Phụ lục 11: Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng độ pha loãng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-24 Phụ lục ... 0.0 150000 1 :Spiramycin II TIC(+) 2:Tinidazol TIC(+) 3:Roxithromycin TIC(+) 4 :Spiramycin TIC(+) 5 :Metronidazol TIC(+) 6 :Spiramycin III TIC(+) 7 :Spiramycin II TIC(+) 1 :Spiramycin II 443.30>174.10(+)... 1 :Spiramycin II TIC(+) 2:Tinidazol TIC(+) 3:Roxithromycin TIC(+) 4 :Spiramycin TIC(+) 5 :Metronidazol TIC(+) 6 :Spiramycin III TIC(+) 7 :Spiramycin II TIC(+) 1 :Spiramycin II 443.30>174.10(+) CE: -21.0 2:Tinidazol... SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯ? ?I NGƯ? ?I BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KH? ?I PHỔ (LC – MS/ MS)” thực v? ?i mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng th? ?i metronidazol spiramycin I huyết tương người