luận văn thạc sĩ sinh học :Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit

Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit

Nguyễn Ngọc Sơn

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG

LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

NGUYỄN NGỌC SƠN

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT

VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố

Tác giả

Nguyễn Ngọc Sơn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, KS Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Nguyễn Như Cường (Viện Bảo

vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của

virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng

tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 11

1.1.1 Thế giới 11

1.1.2 Việt Nam 12

1.2 TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL 13

1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 14

1.3.1 Virut vàng lùn lúa (RGSV) 14

1.3.2 Các loại virut khác 16

1.3.2.1 Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) 16

1.3.2.2 Virut tungro hình cầu (RTSV) 17

1.6.6 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 VẬT LIỆU 26

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 27

2.2.1 Hóa chất 27

2.2.2 Thiết bị 27

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.3.1 Thu mẫu thí nghiệm 27

2.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu 28

2.3.3 Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa 28

2.3.4 Phản ứng RT-PCR 29

2.3.5 Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) 29

2.3.6 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 30

2.3.7 Colony-PCR 31

2.3.8 Tách chiết plasmit 32

2.3.9 Cắt gen bằng enzym giới hạn 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 THIẾT KẾ MỒI 34

3.2 TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 34

3.2.1 RT-PCR 34

3.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37

3.2.3 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR 37

3.2.4 Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen 39

3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 40

3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƯƠNG ỨNG TRÊN GENBANK 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 53

DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật),

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid

ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym)

Kb Kilobase

LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre

RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa)

RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease

RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa)

RSV Rice stripe virus

RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc)

RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng)

RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu)

RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa)

TAE Tris - Acetate – EDTA

Hình 1.1 Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi 13

Hình 1.2 RGSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử 15

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV 16

Hình 1.4 RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.5 RTSV và RTBV quan sát dưới kính hiển vi điện tử 18

Hình 1.6 Các giai đoạn phát triển của rầy nâu 19

Hình 2.1 Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ 26

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tương ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank) 42

Hình 3.4 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của

RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trường LB đặc 37 Hình 3.5 Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18 38 Hình 3.6 Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18 38 Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Lúa gạo là nguồn lương thực giàu chất dinh dưỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lượng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khoáng và chất xơ cho con người Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lượng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62] Khoảng 52% diện tích lúa được trồng ở ĐBSCL Khi đánh giá về những thành tựu đạt được trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lương thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam

Tuy nhiên, sản lượng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy

nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong

thời gian gần đây Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm

virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice

Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus-

RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43],

[48], [59] Trong một số trường hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại virut này Trong đó, RGSV thường chiếm tỷ lệ cao nhất Từ năm 2006 đến nay dịch bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn Do ảnh hưởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị giảm sản lượng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12].

Rất nhiều thành tựu đã đạt được trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL như: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp này vẫn chưa cao

Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lượng lúa gạo cho các tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL Đồng thời,

đánh giá độ tương đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung.

Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định

trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”

2 Mục tiêu

Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV)

3 Nội dung nghiên cứu

1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV

2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu được với các trình tự tương ứng trên GenBank để đánh giá độ tương đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1 Thế giới

Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)

đã nổi lên như một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á Nhiều trận dịch rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chưa từng thấy ở nhiều nước như Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan gây tổn thất nặng nề về kinh tế [17] Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất trắng Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa như bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22]

Năm 1966, RGSV lần đầu tiên được phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á [43] Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan, biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tương tự RGSV [20] Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại 03 triệu tấn thóc [40] Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất do tác hại của rầy nâu [50]

Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa như RGSV và RRSV, nên có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng Hai phương pháp truyền thống được sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống cây kháng rầy Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trường, do đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống được nghiên

cứu và áp dụng rộng rãi Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công

vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60

(SP60), 37% số lượng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42% khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50] Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen

kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của rầy nâu Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt

Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu được coi là mối đe dọa thường xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61]

1.1.2 Việt Nam

Bệnh VL&LXL trên lúa được ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An vào năm 1963 Tại miền Bắc, bệnh được ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và 1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8] Bệnh cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền Trung như Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha bị bệnh và không trổ bông được [9]

Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng Tháp với thiệt hại dưới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ khoảng 500 ha [54] Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã được công bố ở ĐBSCL và miền Đông Nam bộ Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Theo báo cáo của các địa phương, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ Thu Đông 2006 và vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng ĐBSCL và Đông Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là 51.768 ha, trong đó có 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1] Cũng trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phước, Đồng Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện nhiều rầy nâu gây hiện tượng “cháy rầy” Qua xét nghiệm bằng phương pháp ELISA dương tính với kháng thể đặc hiệu của RGSV và RRSV đã khẳng định tỉ lệ nhiễm RGSV, RRSV khá cao, đồng thời có sự xuất hiện của RTSV [56] Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy có giảm so với năm trước nhưng vẫn đang ở mức nghiêm trọng Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng Diện tích bị nhiễm bệnh VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha (tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11]

Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với diện tích lớn Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc

Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phước, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh Diện tích nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận [12]

1.2 TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL

Triệu chứng ban đầu chưa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thường Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam Thời gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện tượng kém dinh dưỡng nên nông dân thường bón thêm phân đạm) [8] Lúa nhiễm bệnh trong giai đoạn còn non thường rất lùn, mọc nhiều chồi và có lá thẳng đứng Các lá bệnh thường ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng không cố định [32],[43] Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thường bị sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa có thể vẫn xanh bình thường nếu được cung cấp đủ phân đạm [32] Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm có thể có nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi

“Nguồn: http://www.vaas.org.vn/”

Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tương đương với các bụi khác, chưa khác biệt lắm [64] Càng về sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần như cháy rầy từng chòm Cây lúa bệnh có thể không có bông hoặc có rất ít bông nhưng hạt bị đen và lép Triệu chứng

tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26] Lúa trưởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị vàng, bông bị nâu và hạt lép [43]

1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA

RGSV ký sinh chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp và rầy Nilaparvata spp Vì vậy có thể nói Nilaparvata spp là vectơ duy nhất truyền bệnh này cho lúa [31]

Thất thu năng suất do RGSV thường khó được tính toán chính xác vì thiệt hại do virut thường không thể được tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut lùn xoắn lá (RRSV- cũng được truyền bởi rầy nâu) [40] Trong năm 1974- 1977, có tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa Sự thất thu năng suất do cả hai loài dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa [40]

RGSV không được truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31] Virut cũng không được truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay Virut chỉ được truyền bằng rầy nâu

(Nilaparvata lugens) và một số loài rầy khác (N bakeri, N muiri) [28], [43]

Virut được truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký chủ, nhưng không được truyền qua trứng rầy [36] Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ truyền virut cho đến lúc chết Kể từ năm 1984, RGSV thường ít xuất hiện và gây thiệt hại tại châu Á Mặc dù không được báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV có lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trước năm 1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26] Từ đây ta có thể giả thiết là một trong những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong

những năm vừa qua

Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân tử RdRp [35] Thể virut khó được quan sát thấy trong dịch trích thực vật dưới kính hiển vi điện tử Thể virut sau khi được ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm khi được quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2)

Hình 1.2 RGSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Thanh đen dài 100 nm “Nguồn: DPV”

Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi được quan sát trong nhân và tế bào chất hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp lục [20] Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đường kính 25 nm còn được tìm thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47] Các hạt 25 nm tương tự cũng xuất hiện dưới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu nhiễm virut [43]

RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32] Cả 6 đoạn RNA đều lưỡng tính (ambisense, mã hoá protein theo cả 2 chiều dương và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tương tự nhau Các đoạn mã kết thúc này có khả năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo Đoạn mã theo chiều bổ sung của đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hoá cho một RdRp tương tự như

RdRp của RSV, loài chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và có cùng 37 ± 9% axit amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus

khác, RNA1 của RGSV còn có thêm một ORF ngắn có chiều dương ở gần đầu 5’ Hai protein dự đoán được mã hoá bởi RNA2 chỉ tương tự chút ít với các protein

được mã hoá bởi RNA2 của các Tenuivirus khác Các protein dự đoán được mã hoá

bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein được biết Sự khác biệt giữa

các protein được mã hoá bởi các chuỗi RNA2, 3, 4 5 và 6 cho thấy RGSV rất khác

biệt so với các Tenuivirus khác [51] Các đoạn RNA1, 2, 5, 6 của RGSV theo thứ tự

tương đương với RNA1, 2, 3, 4 của RSV Protein vỏ của RGSV được mã hoá bởi đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21]

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV

Các thanh đen hình sợi chỉ tượng trưng cho các RNA với chiều dài đã được xác định Các mũi tên đen tượng trưng cho các sản phẩm protein Chiều mũi tên là chiều của

quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006”

1.3.2 Các loại virutkhác

1.3.2.1 Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)

Bệnh lùn xoắn lá lúa được miêu tả đầu tiên năm 1977 [48] Bệnh xuất hiện

chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp và được gây ra bởi virut có tên khoa học là

Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58]

RRSV xuất hiện tại nhiều nước trồng lúa châu Á như Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc [60], và Việt Nam RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng kể Virut không được truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20] Virut không được truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ

mạnh với cây lúa bệnh [60] Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh

duy nhất được biết [18], [48]

Thể virut của RRSV có dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm, và một phức hợp nucleoprotein Vỏ virut không có màng bao và mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành các gai (Hình 1.4) Vỏ virut có 12 gai dạng “B” dài 8 – 10 nm, rộng 23- 26 nm ở phần chân đế và 14- 17 nm ở phần trên [36] Thể virut có rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và thường liên kết với nhau tạo thành các sợi dài Virut không được phát hiện ở các mô khác [48] Khi bị nhiễm virut, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá [26] RRSV có 10 đoạn RNA sợi đôi khác nhau [59]

Hình 1.4 RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn http://www.iah.bbsrc.ac.uk”.; (B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen

dài 50 nm “Nguồn: DPV”

1.3.2.2 Virut tungro hình cầu (RTSV)

Virut tungro hình cầu có tên khoa học là Rice tungro spherical virus (RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27] RTSV phân bố trên các loài lúa Oryza spp ở hầu hết các nước trồng lúa tại vùng Nam và Đông Nam Á RTSV

còn có thể phân bố ở những quốc gia khác nhưng không được phát hiện bởi vì virut này thường không gây ra triệu chứng bệnh Sự phân bố của RTSV có lẽ liên quan lớn đến sự phân bố của côn trùng truyền bệnh [59]

RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14] Đây là bệnh hại lúa gây thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ước tính hàng năm tại vùng Đông Nam Á lên đến hơn 1,5 tỉ USD [24] RTSV không được truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh Virut không được truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh RTSV có tác dụng như là một loài giúp đỡ cho RTBV trong việc truyền bằng côn trùng [42] RTSV được truyền dưới dạng bán bền bởi một số loài rầy xanh Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy

xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N impicticeps) [47], [59]

Hình 1.5 RTSV và RTBV quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Xem trong dung dịch uranyl acetate “Nguồn: Hull R., 1996”

RTSV có thể virut hình cầu, đường kính 30 nm (Hình 1.5), chứa một phân tử RNA sợi đơn có chiều dương và dài khoảng 12 kb [37], và ba protein cấu tạo vỏ virut là CP1 (kích thước 22.900 kDa), CP2 (22.300 kDa) và CP3 (33.000 kDa) [23],[46], [49], [52], [53]

Giống như RTSV, RTBV không được truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh Virut không được truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành

với cây lúa bị bệnh Virut chỉ được truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi

có sự giúp đỡ của RTSV RTBV chỉ được truyền khi rầy xanh hút RTSV trước hoặc cùng thời gian [16]

RTBV có thể virut dạng hình nhộng, chứa 01 DNA sợi đôi và có dạng vòng Sợi DNA đôi này có một điểm đứt ở các vị trí nhất định trên mỗi sợi đơn [15], [13] Bộ gen của RTBV được dịch sang một RNA dài hơn chiều dài của bộ gen ban đầu và RNA này được dịch ngược sang DNA để tái tạo lại bộ gen của virut RNA này còn được dùng để dịch mã protein của các ORF 1, 2, 3 Ngoài ra, RNA này còn được cắt nhỏ để dịch mã và tạo ra ORF 4 [27]

1.4 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL

ngoài của bẹ lá (Hình 1.10.A)

- Rầy non rất linh hoạt, mới nở có màu xám trắng, tuổi 2-3 trở lên có màu

nâu vàng, trong điều kiện mật độ cao có màu nâu sẫm (Hình 1.10.B)

- Con trưởng thành có màu nâu tối, con đực nhỏ hơn con cái Có 2 dạng rầy

trưởng thành: loại cánh ngắn (Hình 1.10.C) và loại cánh dài (Hình 1.10.D)

Hình 1.6 Các giai đoạn phát triển của rầy nâu

A Trứng rầy; B Rầy con (ấu trùng);

C Rầy nâu trưởng thành cánh ngắn; D Rầy nâu trưởng thành cánh dài “Nguồn: http://www.vaas.org.vn/”

1.4.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại

Vòng đời của sâu gai từ 25- 30 ngày và thay đổi theo mùa + Thời gian trứng: 5- 14 ngày

+ Thời gian rầy non: 12- 32 ngày

+ Thời gian rầy trưởng thành: 3- 20 ngày

A

B

Rầy cái trưởng thành có thể đẻ 150- 250 trứng và có tính hướng sáng mạnh Con trưởng thành và rầy non đều hút nhựa cây từ dảnh và lá lúa Rầy nâu xâm nhập vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ Rầy nâu phát sinh với mật độ cao và gây hại nặng vào giai đoạn trước lúc lúa trỗ bông, ngậm sữa và bắt đầu chín [65] Nếu chỉ đơn thuần rầy gây hại không là môi giới truyền bệnh thì đánh giá mức gây hại của rầy nâu là không lớn nhưng cách phòng trừ loại rầy này lại tương đối khó Rầy nâu có phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có khả năng hình thành các nòi sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trường đủ lớn Rầy có khả năng di cư đám đông rất xa và kháng thuốc cao Rầy nâu còn có tác hại chủ yếu là truyền lan các loại virut [10] Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi truyền các loại virut là RGSV và RRSV Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu ấm nóng, độ ẩm cao, mưa nắng xen kẽ Ở Miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các vụ lúa, còn ở phía Bắc cháy rầy thường xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng 9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54]

Tỉ lệ rầy nâu N lugens có thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên

ruộng lúa, và biến động từ 5- 60 % [22], [28], [29] Tỷ lệ rầy truyền bệnh có thể được tăng lên bằng cách chọn lọc và nhân mật số các cá thể rầy có khả năng truyền

virut, nhưng lại giảm đi khi không còn áp lực chọn lọc [28] Với rầy nâu N lugens,

tỉ lệ truyền bệnh không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn [28] Tuy nhiên, rầy non có khả năng truyền bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virut ngắn hơn rầy trưởng thành [22]

1.5 PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL

Bệnh VL&LXL cho đến nay chưa có thuốc đặc trị Vì vậy, biện pháp an toàn và hữu hiệu nhất vẫn là phòng bệnh thông qua việc ngăn chặn, tiêu diệt rầy nâu (môi giới truyền bệnh trực tiếp) Sự phát triển và lây truyền bệnh virut tùy thuộc vào số lượng cây mang nguồn bệnh, số lượng và sự hoạt động của côn trùng truyền bệnh, sự mẫn cảm của giống lúa với virut, với côn trùng truyền bệnh và thời tiết Nhiều biện pháp phòng trừ bệnh VL&LXL đã được tiến hành như canh tác lúa theo tinh thần 3G, 3T, trong đó không bón thừa N, giảm mật độ xạ cấy, giảm sử dụng thuốc hóa học, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, phun thuốc diệt trừ rầy [5] Thuốc hóa học có thể làm giảm mật số rầy nhưng vẫn không thể giải quyết được bệnh vàng lùn lúa, vì sự truyền bệnh có thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong khoảng thời gian rất ngắn [2],[5].

Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng ruộng, và đã cho kết quả khả quan Chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy các loại nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đưa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phương pháp này có thể diệt trừ rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người [55] Hiện nay, phương pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: về mặt qui mô (mỗi lần áp dụng chỉ trên diện tích vài chục ha đất), về công nghệ chế biến, mưa sau khi phun sẽ làm trôi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mưa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu diệt ngay sau khi phun thuốc) [6]

Nhiều kết luận cho rằng không một biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ rầy nâu một cách hoàn hảo Vấn đề chỉ có thể giải quyết bằng cách thực hiện một chương trình phòng trừ tổng hợp, trong đó giống kháng, biện pháp sinh học, biện pháp canh tác và dùng thuốc hóa học phải được kết hợp với nhau một cách hợp lý [9], [44] Vì vậy, đòi hỏi phải có những nghiên cứu chi tiết về các chủng virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh VL&LXL trên qui mô rộng lớn

1.6 MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT

1.6.1 Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử

Trong sinh học phân tử, có nhiều loại enzym quan trọng, trong đó phải kể đến những loại sau:

Enzym phiên mã ngược có vai trò quyết định trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử Eucaryot Enzym này do các retrovirut sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào vật chủ Enzym phiên mã ngược tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung (cDNA- complementary DNA) từ RNA khuôn theo chiều 5’-3’, khi có mặt của mồi Các ứng dụng chủ yếu là: Thiết lập ngân hàng cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit nucleic bằng phương pháp sử dụng các dideoxynucleotit

DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay

RNA (RNA ligase) Enzym này được tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng

nối hai trình tự DNA có đầu so le T4 DNA ligase có nguồn gốc từ phage T4 xâm

nhiễm E.coli Enzym này có cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhưng

đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T4 DNA ligase được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật tạo dòng

Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’ phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase) Một DNA polymerase đặc biệt là enzym phiên mã ngược (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của một phân tử DNA có sẵn Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối dài tạo mạch bổ sung

Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả năng này, người ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotit Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trưng Các trình tự này thường bao gồm 4-8 nucleotit (thường là 4 hoặc 6) Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotit của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotit khác Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo cùng chiều 5’-3’ Như vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch

1.6.2 Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng phiên mã ngược (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên được đoạn gen quan tâm từ RNA [3] Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:

- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ RNA Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA được sử dụng là khác nhau Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có intron thì người ta thường tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s Nếu là sinh vật nhân sơ hoặc virrut người ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân Khi mồi gắn bổ sung với sợi RNA khuôn, enzym phiên mã ngược sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các

nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu được lượng cDNA tương ứng với lượng RNA khuôn ban đầu Để tăng hiệu quả của qua trình tổng hợp, lượng mồi được cho vào lớn hơn rất nhiều lượng RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng được đưa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase

Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi ngược) Nguyên tắc của kỹ thuật PCR được trình bày ở mục 1.6.3

1.6.3 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) được Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985 Đây là kỹ thuật in vitro tương đối đơn giản, cho phép nhân một số lượng không giới hạn nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bước được lặp lại nhiều lần:

1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng

cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95o

C trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút

2> Lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho

phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40o

C – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút

3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo

dài từ đoạn mồi Hai phân tử DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban đầu Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút Để tránh hiện tượng bắt cặp không đặc thù, phản ứng thường được thực hiện ở 72o

C

Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ như Taq-

polymerase được tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn được

phân lập từ suối nước nóng Hiện nay, enzym này chủ yếu được tổng hợp theo con đường tái tổ hợp Sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có N*2n

sợi DNA được tạo ra Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ, có khoảng 30 triệu bản được tạo ra từ một sợi khuôn ban đầu

1.6.4 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp” Tuy nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể biến nạp được một cách dễ dàng

Để có thể biến nạp ở E.coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến

(competent) Để đạt được điều này, trước khi biến nạp, người ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2 lạnh Việc biến nạp các tế bào khả biến được thực hiện bằng cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm như vậy DNA sẽ chui vào tế bào Sau khi biến nạp, vi khuẩn được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút Sau đó, các tế bào được đưa lên môi trường chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp Trong quá trình biến nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến được biến nạp Mặc dù có nhược điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109

các tế bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đưa 1µg DNA vào thí nghiệm Trong thực tế, với 1µg DNA người ta tạo ra được 106

đến 107 tế bào biến nạp

1.6.5 Kỹ thuật tách dòng gen

Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bước khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm Đầu tiên, DNA ngoại lai được nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp Vectơ sử dụng

là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli Sau đó, vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào

tế bào chủ và tế bào chủ được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để nhân vi

khuẩn lên nhiều lần Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli Cuối cùng qua các bước

tách chiết DNA, người ta sẽ thu được một lượng lớn plasmit tái tổ hợp

Các nhân tố như vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhưng tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua 4 bước: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng

- Xử lý DNA cần tạo dòng

Trước hết DNA cần tạo dòng được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó được làm sạch để thu được phân đoạn DNA có kích thước như mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR Bước này nhằm tạo điều kiện cho bước chọn dòng được thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thước không mong muốn

- Tạo vectơ tái tổ hợp

Vectơ tái tổ hợp được tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vectơ tách dòng Thông thường, sau khi chạy PCR với enzym Taq-polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen được nhân lên Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã được mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dòng đa điểm cắt) Hiện nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có điểm cắt này, như pBT, pCR®

2.1- TOPO, pGEM®-T

Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dưới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ được gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vòng

- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ

Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau Bước này nhằm sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao

- Chọn dòng

Chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phương pháp kháng sinh (kanamycin, ampicillin, ) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không được biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo

phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhưng

không có đoạn gen nào được gắn vào

1.6.6 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR)

Nguyên tắc kỹ thuật colony- PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA được thay bằng DNA plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao 940C đến 950

C, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp Plasmit tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

- Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL được thu từ các tỉnh đại diện có tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình đến cao ở khu vực Nam Trung Bộ, mỗi tỉnh thu mẫu từ 2- 3 địa điểm khác nhau (Hình 2.1)

5

4