BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT Đề tài khoa học công nghệ cấp trường TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG Ở BỆNH NHÂN NHẬP VIỆN ĐIỀU TRỊ Mã số đề tài : Đồng chủ nhiệm đề tài - ThS BS Lý Khánh Vân - PGS.TS Lê Tiến Dũng Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 MỤC LỤC Thông tin kết nghiên cứu Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu Chương : Tổng quan tài liệu 1.1 Một số khái niệm viêm phổi 1.2 Các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 1.2.1 Các vi khuẩn thường gặp 1.2.2 Các vi khuẩn khơng điển hình 1.3 Các cơng trình nghiên cứu có liên quan 1.3.1 Các cơng trình nghiên cứu nước 1.3.2 Các cơng trình nghiên cứu nước ngồi Chương : Đối tương phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết kế nghiên cứu 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.3 Cỡ mẫu 2.4 Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.5 Tiêu chuẩn loại trừ 2.6 Phương pháp chọn mẫu 2.7 Xử lý số liệu 2.8 Kiểm soát sai lệch 2.9 Vấn đề y đức Chương : Kết 3.1 Tác nhân vi khuẩn gây bệnh tác nhân vi khuẩn phối hợp phát kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.2 Tác nhân vi khuẩn bệnh nhân đơn viêm phổi cộng đồng phát kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.3 Tác nhân vi khuẩn bệnh nhân COPD viêm phổi cộng đồng phát kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.4 Tác nhân vi khuẩn bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng phát kỹ thuật nuôi cấy truyền thống 3.5 Sự phù hợp tác nhân vi khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống kỹ thuật multiplex real-time PCR Chương : Bàn luận 4.1 Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh 4.2 Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp 4.3 Sự phù hợp vi khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống kỹ thuật multiplex real time PCR Kết luận Tài liệu tham khảo Phụ lục : Đánh giá độ tin cậy mẫu đàm theo thang điểm Barlett Phụ lục : Quy trình ni cấy phân lập vi khuẩn gây bệnh Phụ lục : Quy trình kỹ thuật multiplex real time PCR TRANG 6 7 10 12 12 15 17 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 21 23 25 26 29 29 31 31 33 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh phối hợp Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân đơn viêm phổi mắc phải cộng đồng Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân COPD bị viêm phổi mắc phải cộng đồng Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy truyền thống Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn phù hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống kỹ thuật multiplex real-time PCR THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung - Tên đề tài: Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh nhân nhập viện điều trị - Mã số: - Đồng chủ nhiệm đề tài: Ths.BS Lý Khánh Vân PGS.TS Lê Tiến Dũng - Điện thoại: 0918.874.488 - Email: khanhvan1003@yahoo.com - Đơn vị quản lý chuyên môn: BM.Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch Khoa y, Đại học y dược TP.HCM - Thời gian thực hiện: Tháng 05/2016 – 12/2017 Mục tiêu - Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng người lớn nhập viện - Xác định tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng - Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật multiplex real time PCR Nội dung Sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR kỹ thuật đại, có độ tin cậy cao để phát vi khuẩn gây bệnh song song với phương pháp nuôi cấy truyền thống Mẫu bệnh phẩm đàm bệnh phẩm có chứa đàm khảo sát đại thể vi thể qua nhuộm Gram để đánh giá mức độ tin cậy dựa vào thang điểm Barlett Chọn mẫu bệnh phẩm có mức độ tin cậy (> điểm) để thực nuôi cấy theo phương pháp truyền thống đồng thời tiến hành kỹ thuật multiplex real time PCR Kết phát vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn phối hợp dựa vào số lượng vi khuẩn đếm nhờ kỹ thuật multiplex real time PCR Các số liệu thu thập xử lý phần mềm thống kê y học phép kiểm bình phương Kết mô tả số lượng tỷ lệ % Kết đạt (Khoa học, đào tạo, kinh tế, xã hội, ứng dụng) - Tỷ lệ dương tính kỹ thuật multiplex real time PCR 67,5% kỹ thuật nuôi cấy truyền thống 44,3% (không kể nhóm S viridans) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê - Vi khuẩn phát kỹ thuật multiplex real time PCR có tỷ lệ cao S.pneumoniae (34,3%), K.pneumoniae (11,4%), A.baumannii (10,7%) kỹ thuật ni cấy truyền thống vi khuẩn có tỷ lệ cao K.pneumoniae (12,2%), P.aeruginosa (9,6%), A.baumannii (7,7%) khơng có trường hợp phát S.pneumoniae - Chỉ có 23,7% vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy truyền thống phù hợp với vi khuẩn phat kỹ thuật multiplex real time PCR E.coli có tỷ lệ phù hợp cao 57,1% Các vi khuẩn khác có tỷ lệ phù hợp 50% 5.Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại Kết xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường gặp viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị có thể: - Giúp bác sĩ lâm sàng định hướng sử dụng kháng sinh ban đầu cách hợp lý nhầm nâng cao hiệu điều trị, trường hợp nhiễm vi khuẩn khơng điển hình đồng nhiễm (đa nhiễm) - Tác động bệnh viện việc trang bị sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng nói riêng bệnh nhiễm khuẩn nói chung ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi mắc phải cộng đồng tình trạng viêm phổi xảy ngồi bệnh viện 48 đầu sau nhập viện [34] Viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh phổ biến xảy lứa tuổi bệnh lý thường gặp, chiếm tỷ lệ 12% bệnh hơ hấp nói chung Việt Nam [4] Tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng thường phát vi khuẩn, vi rút vi nấm, tác nhân vi khuẩn chủ yếu Ở Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế năm 2014, viêm phổi mà hầu hết viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh lý có tỷ lệ tử vong hàng đầu với tỷ lệ 1,32 100.000 dân, tương đương với tỷ lệ tử vong chấn thương sọ não [4] Một nguyên nhân gây tử vong cao kết xét nghiệm vi khuẩn kỹ thuật nuôi cấy truyền thống bị hạn chế việc phát tác nhân gây bệnh Như biết, bệnh phẩm chủ yếu để phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng mẫu đàm hay bệnh phẩm có chứa đàm lấy từ bệnh nhân Tuy nhiên xét nghiệm đàm kỹ thuật nuôi cấy để phát vi khuẩn gây bệnh có nhiều thách thức cần phải vượt qua, loại bệnh phẩm thường bị tạp nhiễm phải qua đường hầu họng Do đó, việc nuôi cấy để phát vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn tạp nhiễm thử thách lớn Hơn đa số bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước nên vi khuẩn gây bệnh dù sống dịch lót biểu mơ phế nang mẫu đàm khảo sát vi khuẩn chết Ngồi cịn có ngun nhân chủ quan phòng xét nghiệm làm cho khả phát vi khuẩn gây bệnh qua ni cấy giảm Đó : (i) phịng xét nghiệm vi sinh khơng có mơi trường ni cấy thích hợp để phân lập vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thường gặp lại khó ni cấy; (ii) mẫu bệnh phẩm không cấy để tăng hội nuôi cấy phát vi khuẩn gây bệnh; (iii) thiếu kinh nghiệm việc chọn khuẩn lạc mọc mặt thạch để phân lập vi khuẩn gây bệnh (iv) khơng đánh giá độ tin cậy mẫu đàm để loại bỏ mẫu bệnh phẩm đàm mà nhầy nhớt vùng hầu họng Ngồi kỹ thuật ni cấy truyền thống không đếm số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh phối hợp Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, nhiều cơng trình nghiên cứu giới công bố phổ tác nhân vi khuẩn thật gây nhiễm khuẩn hô hấp Theo công bố cơng trình nghiên cứu giới, phổ tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng đứng đầu Streptococcus pneumoniae , Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa; vi khuẩn đường ruột vi khuẩn khơng điển Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae phát tỷ lệ có thấp [28] Trái lại nước ta, cơng trình nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị vi khuẩn đứng đầu (khơng kể nhóm Streptococcus viridans vi khuẩn thường trú) Pseudomonas spp, Klebsiella spp vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, H influenza chiếm tỷ lệ thấp[5], [6], [7], [8] Đó cơng trình nghiên cứu nước ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống để phân lập vi khuẩn gây bệnh cơng trình nghiên cứu giới sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh Kỹ thuật multiplex real time PCR kỹ thuật đại, có độ nhạy cao độ đặc hiệu khơng khác kỹ thuật ni cấy phân lập vi khuẩn [12], [22], [24], [28], [33] Khi không xác định tác nhân vi khuẩn thật gây bệnh dẫn đến sử dụng kháng sinh không hợp lý, gây lãng phí đưa đến xuất dòng vi khuẩn kháng thuốc [15] Ở nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu thức cơng bố đầy đủ tác nhân vi khuẩn thật gây viêm phổi mắc phải cộng đồng người lớn, có số cơng trình riêng lẻ thực bệnh viện với thời gian nghiên cứu ngắn, mẫu nghiên cứu hạn chế Chính vậy, để phát tác nhân vi khuẩn thật gây viêm nhiễm hô hấp người lớn viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị, tiến hành thực đề tài “ Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh nhân nhập viện điều trị “ với phương pháp phát tác nhân vi khuẩn thật gây bệnh kỹ thuật multiplex real-time PCR song song với kỹ thuật nuôi cấy truyền thống MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU (1) Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng người lớn nhập viện (2) Xác định tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng (3) Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật multiplex real time PCR CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số khái niệm viêm phổi 1.1.1 Viêm phổi Viêm phổi hay viêm hơ hấp tình trạng viêm nhiễm xảy toàn cấu trúc gồm phế nang, ống túi phế nang, tiểu phế quản tận tổ chức mô kẽ Tác nhân gây viêm phổi vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng, nấm trực khuẩn lao [1] Viêm phổi bệnh lý thường gặp, theo thống kê, bệnh viêm phổi chiếm 12% bệnh viêm hơ hấp nói chung Việt Nam [4] 1.1.2 Viêm phổi mắc phải cộng đồng Viêm phổi mắc phải cộng đồng tình trạng viêm phổi mắc phải xảy cộng đồng dân cư bệnh viện, khác với viêm phổi bệnh viện viêm phổi xảy nhiễm tác nhân vi khuẩn bệnh viện ( nhiễm khuẩn bệnh viện) Viêm phổi mắc phải cộng đồng xảy phổ biến không dễ dàng báo cáo xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh; phần lớn thông tin tần suất mắc bệnh dựa thống kê ước đốn thơ Theo thống kê Bộ y tế năm 2014, viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh lý có tỷ lệ tử vong hàng đầu với tỷ lệ 1,32% 100.000 dân, tương đương với tử vong chấn thương sọ não [4] Ở nước ta hàng năm có khoảng 4/5 triệu trường hợp viêm phổi mắc phải cộng đồng, phần lớn theo dõi điều trị ngoại trú có khoảng 20% phải nhập viện điều trị với phân nửa số điều trị nội trú có biểu nặng, đặc biệt tỷ lệ nhiễm khuẩn tình trạng bệnh nặng ngày tăng cao người già trẻ nhỏ [10], [18] 1.2 Các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 1.2.1 Các vi khuẩn thường gặp 1.2.1.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) [3], 25] E coli loại vi khuẩn thường trú người vật, ruột già Ngồi cịn gặp vi khuẩn thiên nhiên đất, nước, khơng khí Về khả gây bệnh, E coli thường gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương, vết mổ Dựa vào tính chất gây bệnh, trực khuẩn E coli phân thành loại : - EPEC ( Entero-pathogenic E.coli ) - ETEC ( Entero-toxigenic E coli) - EIEC ( Entero-invasive E coli) - EAEC ( Entero-adherent E coli) - EHEC ( Entero-hemorrhagic E coli) 1.2.1.2 Klebsiella pneumoniae ( K pneumoniae ) [3], 25] K pneumoniae thuộc họ vi khuẩn đường ruột, Edwin Klebs người Đức tìm Về khả gây bệnh, K pneumoniae gây nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết Đây vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn bệnh viện, bệnh nhân nằm viện lâu dài, đặc biệt gây nhiễm khuẩn đường hô hấp bệnh nhân thở máy, bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân lớn tuổi trẻ nhỏ 1.2.1.3 Pseudomonas aeruginosa ( P aeruginosa ) [3], 25] P aeruginosa trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tuyệt đối, thường sống thiên nhiên, đất, nước, nơi ẩm ướt, kể bệnh viện Ở người, vi khuẩn sống vùng da ẩm, số sống cộng sinh đường tiêu hóa người ( P aeruginosa phân lập với tỷ lệ khoảng 1/10 phân người bình thường ) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Theo kết trình bày bảng 4, vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy truyền thống (khơng kể nhóm S.viridans vi khuẩn thường trú hầu họng) có tỷ lệ cao K.pneumoniae (12,2%), P.aeruginosa (9,6%), A.baumannii (7,7%), E.coli (5,5%) Các vi khuẩn nhóm Staphylococci chiếm tỷ lệ thấp Khơng có trường hợp phát vi khuẩn khơng điển hình Mặc dù cách tính tỷ lệ loại vi khuẩn cơng trình nghiên cứu nước tác giả có khác nhau, tính tỷ lệ vi khuẩn phát tổng số trường hợp nghiên cứu, tỷ lệ vi khuẩn tổng số vi khuẩn phát được, tỷ lệ vi khuẩn số vi khuẩn Gram âm số vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên kết nghiên cứu phương pháp nuôi cấy truyền thống hầu hết tác giả nước cho thấy vi khuẩn K.pneumoniae, P.aeruginosa, A.baumannii chiếm tỷ lệ cao vi khuẩn S.pneumoniae, S.aureus, H.influenza [10],[14],[18],[19] [5],[6],[7],[9] Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy truyền thống cho kết tương tự (Bảng 4) Trái lại, kết ghi nhận tác nhân vi khuẩn phát kỹ thuật multiplex real time PCR cơng trình nghiên cứu nước ngồi cho thấy vi khuẩn S.pneumoniae, S.aureus, K.pneumoniae, H.influenza chiếm tỷ lệ cao vi khuẩn đường ruột P.aeruginosa, đồng thời cịn phát vi khuẩn khơng điển hình như: M.pneumoniae, C.pneumoniae, L.pneumophila với tỷ lệ ngày tăng [26],[27],[29],[31] [32],[34],[36] Nghiên cứu kỹ thuật multiplex real time PCR cho kết tương tự (Bảng 1) Phân tích tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh phát kỹ thuật real time PCR bệnh nhân CAP bệnh nhân CAP/COPD (bảng 1) cho thấy vi khuẩn S.pneumoniae, H.influenza, A.baumannii chiếm tỷ lệ cao hai nhóm bệnh nhân bệnh nhân CAP K.pneumoniae chiếm tỷ lệ cao (14,5% so với 7,9%) Ngược lại bệnh nhân CAP/COPD vi khuẩn P.aeruginosa chiếm tỷ lệ cao (7,1% so với 5,5%) Phân tích tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh (từ nhóm S.viridans) phát phương pháp ni cấy truyền thống bệnh nhân CAP bệnh nhân CA/COPD Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh (bảng 4) cho thấy vi khuẩn K.pneumoniae, P.aeruginosa, A.baumannii, E.coli chiếm tỷ lệ cao hai nhóm bệnh nhân Tuy nhiên có khác tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh hai nhóm bệnh nhân CAP CAP/COPD Đó bệnh nhân CAP, vi khuẩn K.pneumoniae chiếm tỷ lệ cao (15,8% so với 7,8%) bệnh nhân CAP/COPD vi khuẩn P.aeruginosa chiếm tỷ lệ cao (11,9% so với 7,6%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) 4.2 Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp phát kỹ thuật multiplex real time PCR nhờ thực đếm số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn phối hợp, phương pháp nuôi cấy truyền thống không xác định vi khuẩn phối hợp không đếm số lượng vi khuẩn Trong vi khuẩn phối hợp xác định vi khuẩn S.pneumoniae chiếm tỷ lệ cao 10,7%, K.pneumoniae với tỷ lệ 5,9%, H.influenza 4,8% Phân tích vi khuẩn phối hợp nhóm bệnh nhân nhóm bệnh nhân CAP vi khuẩn S.pneumoniae chiếm với tỷ lệ 6,2% nhóm bệnh nhân CAP/COPD S.pneumoniae nhiếm ưu với tỷ lệ 15,9% Sự khác biệt tỷ lệ vi khuẩn phối hợp S.pneumoniae nhóm bệnh nhân CAP CAP/COPD có ý nghĩa thống kế Trái lại bệnh nhân CAP, vi khuẩn K.pneumoniae chiếm tỷ lệ 6,9% nhóm bệnh nhân CAP/COPD, K.pneumoniae chiếm 4,8% Sự khác biệt tỷ lệ K.pneumoniae nhóm bệnh nhân CAP nhóm bệnh nhân CAP/COPD khơng có ý nghĩa thống kê 4.3 Sự phù hợp vi khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống kỹ thuật multiplex real time PCR Theo kết trình bày bảng cho thấy có 23,7% vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy truyền thống phù hợp với vi khuẩn phát kỹ thuật multiplex real time PCR Phân tích cho thấy vi khuẩn E.coli chiếm tỷ lệ phù hợp cao 57,1%, ngoại trừ trường hợp vi khuẩn H.influenza Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh M.catarrahlis với số lượng phát ít, vi khuẩn khác thường gặp viêm phổi mắc phải cộng đồng K.pneumoniae, P.aeruginosa, A.baumannii có tỷ lệ phù hợp không đến 50% Đặc biệt vi khuẩn S.pneumoniae vi khuẩn ghi nhận tác nhân chiếm tỷ lệ cao viêm phổi mắc phải cộng đồng kết nuôi cấy phương pháp truyền thống khơng có phù hợp với kỹ thuật multiplex real time PCR khơng có trường hợp phát Đây loại vi khuẩn khó phát phương pháp ni cấy truyền thống nhiều lý do: (1) Bệnh phẩm đàm loại bệnh phẩm thường bị tạp nhiễm phải qua đường hầu họng; (2) Vi khuẩn dễ chết trình vận chuyển bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước đó; (3) Phịng xét nghiệm khơng có đủ mơi trường ni cấy thích hợp, mẫu bệnh phẩm khơng cấy ngay; (4) kỹ thuật viên xét nghiệm chưa có đủ kinh nghiệm để chọn khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh Và lý ghi nhận diện nhóm vi khuẩn S.viridans nuôi cấy mà S.pneumoniae Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh KẾT LUẬN (1) Tỷ lệ dương tính kỹ thuật multiplex real time PCR 67,5% phương pháp nuôi cấy truyền thống 44,3% Sự khác biệt tỷ lệ dương tính kỹ thuật multiplex real time PCR phương pháp nuôi cấy truyền thống có ý nghĩa thống kê (P25 bạch cầu + điểm + điểm - Nhầy mủ - Số lượng tế bào vẩy/quang trường x 100  10-25 tế bào - điểm  > 25 tế bào - điểm Thang điểm để đánh giá cộng tất điểm ghi nhận từ mẫu đàm quan sát ghi nhận  ≤ điểm : không tin cậy để nuôi cấy  1-2 điểm : tin cậy vừa  ≥ điểm : đáng tin cậy Trong nghiên cứu chọn mẫu đàm đánh giá đáng tin cậy để tiến hành nuôi cấy làm kháng sinh đồ (≥ điểm)  Sau đánh giá mẫu đàm, chuyển sang vật kính dầu (x100), quan sát vùng nhầy nhớt quanh tế bào bạch cầu để ghi nhận diện vi khuẩn theo bảng : Tính chất Nghi vi khuẩn đích Cầu khuẩn Gram (+) xếp thành chùm Staphylococci Cầu khuẩn Gram (+) xếp chuỗi Streptococci Trực khuẩn Gram (-) nhỏ Haemophilus Cầu khuẩn Gram (+) xếp đôi Pneumococci Cầu khuẩn Gram (-) xếp đôi M catarrhalis Trực khuẩn Gram (-) lớn Trực khuẩn Gram (-) dễ mọc Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC QUY TRÌNH NI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN GÂY BỆNH[23] Tất mẫu đàm sau đánh giá tin cậy tiến hành ni cấy Các mẫu khơng tin cậy không tiến hành nuôi cấy mà yêu cầu lâm sàng lấy mẫu lại Riêng mẫu tin cậy vừa, yêu cầu lấy mẫu lại hay tiến hành nuôi cấy phải cố lấy mầm cấy vùng đàm mủ, tránh lấy nhớt hay nước bọt để nuôi cấy Mỗi mẫu đàm phải tiến hành nuôi cấy chiều môi trường phân lập đủ khả để cấy vi khuẩn gây bệnh dù khó mọc Trình bày môi trường phân lập sử dụng để cấy đàm bệnh phẩm có đàm:  Phân lập cầu khuẩn Gram (+) Thạch máu cừu (BA) phân lập không chọn lọc (cả vi khuẩn Gram (+) lẫn vi khuẩn Gram (-) mọc được), hay thạch máu có Nalidixic acid (BANg) để phân lập chọn lọc cầu khuẩn Gram (+) Hoặc thêm thạch máu có gentamycin (BAGe) để phân lập chọn lọc S pneumoniae  Phân lập H influenzae M catarrhlis Thạch nâu máu ngựa (CAXV) phân lập không chọn lọc H influenzae M catarrhalis Hoặc dùng thạch nâu máu ngựa sung Bacitracin (CAHI) để phân lập chọn lọc vi khuẩn  Phân lập vi khuẩn đường ruột không đường ruột Thạch Mac Conkey (MC) dùng phân lập chọn lọc trực khuẩn đường ruột hay không đường ruột Hoặc dùng hộp thạch phân lập khác có mục đích Có số trực khuẩn không đường ruột không mọc MC, trường hợp này, vi khuẩn phân lập từ thạch máu Các hộp thạch máu hay thạch nâu ủ tủ ấm 35-37oC giữ bình nến hay tủ CO2 Thạch MC hay loại tương đương khơng cần ủ CO2 Sau ủ qua đêm, quan sát hộp thạch phân lập để tìm khuẩn lạc gây bệnh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC KỸ THUẬT MULTUPLEX REAL TIME PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH TRONG MẪU ĐÀM HOẶC BỆNH PHẨM CÓ CHỨA ĐÀM[22] Kỹ thuật multiplex real time PCR vừa phát hiện, vừa định lượng DNA mẫu xét nghiệm  Biểu đồ khuếch đại real time PCR Trong kỹ thuật real time PCR, người làm xét nghiệm quan sát trình nhân DNA ống phản ứng qua biểu đồ khuếch đại ( amplification graph ) Biểu đồ có trục tung cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích, trục hồnh chu kỳ nhiệt Mỗi chu kỳ khuếch đại gồm giai đoạn : (1) Giai đoạn ủ : số lượng DNA đích nhân thành chưa đủ để chất phát quang nhận ánh sáng kích thích, ánh sáng huỳnh quang phát khơng đủ cường độ để máy ghi nhận (2) Gia đoạn lũy thừa : cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt số lượng DNA đích tăng gấp đơi sau chu kỳ (3) Giai đoạn bình nguyên : mức tăng cường độ huỳnh quang ống phản ứng chậm dần đạt đến bình nguyên, phản ứng cạn dần dNTP enzyme Taq polymerase nên DNA đích khơng cịn tăng số lượng theo cấp số nhân Sau hoàn tất chu kỳ nhiệt thấy thông số quan trọng kèm với chu kỳ ngưỡng ct ( Threshold cycle ) Thiết bị real time PCR ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu gọi chu kỳ Lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang gọi đường ( base line ) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diễn khuếch đại Hình Một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống nhận ánh sang kích thích sau chu kỳ nhiệt[22]  Kỹ thuật real time sử dụng Tagman probe làm chất phát huỳnh quang Thành phần cho phản ứng real time PCR gồm : cặp mồi, Tag polymerase có hoạt tính 5’-3’ exnuclease, dNTP, PCR buffer, MgCl2, chất phát quang DNA đích Chìa khóa kỹ thuật phương pháp real time PCR chất huỳnh quang thêm vào real time PCR mix - Chất phát huỳnh quang ( chất nhuộm ) : chèn vào sợi đôi DNA phát huỳnh quang Chất phát huỳnh quang thường dùng Ethidium bromide - Probe đặc hiệu có gắn chất huỳnh quang ( Tagman probe ) Probe đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa nguyên tắc có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ống phản ứng có bắt cặp probe lên trình tự đặc hiệu sản phẩm khuếch đại Khi có bắt cặp có phát huỳnh quang từ ống phản ứng nhờ nhận nguồn sáng kích thích Có nhiều loại probe, sau chế hoạt động Tagman probe real time PCR Hình Tóm tắc chế phát huỳnh quang Taqman probe real-time PCR[22]  Quy trình kỹ thuật multiplex real time PCR Kỹ thuật multiplex real time PCR nhằm phát tác nhân vi sinh gây bệnh mẫu đàm hay bệnh phẩm có chứa đàm thực phịng thí nghiệm cơng ty Nam Khoa Biotek Kỹ thuật tóm tắt sau : (1) Trước hết mẫu làm thể tích dung dịch đàm PBS có chứa NALC (N-Acetyl L-Cysteine) (2) Sau mẫu tách chiết nucleic acid máy tách chiết tự động KingFisher FLEX hãng Thermo với thuốc thử NKRNADNAprep-MAGBEAD Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh cơng ty Nam Khoa Biote Bộ thuốc thử thẩm định cách so sánh với phương pháp BOOM tách chiết nucleic acid, phương pháp sử đụng Trizol-LS tách chiết RNA phương pháp tách chiết nucleic acid dùng hệ thống kín MagnaPure Roche[33] (3) Các tách chiết nucleic acid từ mẫu đàm đưa vào thực real-time PCR sử dụng mồi taqman probe đặc hiệu để phát định lượng tác nhân vi khuẩn bao gồm: (i) vi khuẩn cộng đồng S pneumoniae, H influenzae, H influenzae type b, M catarrhalis, Streptococci nhóm A, Streptococci nhóm B, S suis; (ii) vi khuẩn khơng điển hình M pneumoniae, C pneumoniae L pneumophila; (iii) vi khuẩn bệnh viện S aureus kháng hay nhạy methicillin, S epidermidis kháng hay nhạy methicillin, S aureus có độc tố Pantom-Valentine Leukocydine, E faecalis, E faecium, E coli, K pneumoniae, P aeruginosa, A baumannii Kỹ thuật multiplex real time PCR nêu công ty Nam Khoa Biotek chế tạo thẩm định qua nhiều nghiên cứu công bố trước đây[8],[12],[16], [22] Kết phát định lượng tác nhân vi khuẩn gây bệnh trả lời qua số đơn vị phát (detection unit) đơn vị phát tương đương copies tác nhân vi khuẩn dựa theo nghiên cứu lưu hồ sơ nghiên cứu phát triển công ty Nam Khoa Biotek Tác nhân vi sinh xác định tác nhân gây bệnh kết real-time PCR cho số định lượng ≥20.000 DU (tức ≥100.000 copies) Riêng tác nhân vi khuẩn không điển hình khơng có tiêu chuẩn nên nghiên cứu cho tác nhân gây bệnh số định lượng ≥1.000 DU (tức ≥5.000 copies) Tác nhân gây bệnh cho tác nhân gây bệnh có số lượng cao cịn tác nhân có số lượng thấp cho tác nhân gây bệnh phối hợp ... tình trạng vi? ?m phổi mắc phải xảy cộng đồng dân cư bệnh vi? ??n, khác với vi? ?m phổi bệnh vi? ??n vi? ?m phổi xảy nhiễm tác nhân vi khuẩn bệnh vi? ??n ( nhiễm khuẩn bệnh vi? ??n) Vi? ?m phổi mắc phải cộng đồng xảy... vi khuẩn thật gây vi? ?m nhiễm hô hấp người lớn vi? ?m phổi mắc phải cộng đồng nhập vi? ??n điều trị, tiến hành thực đề tài “ Tác nhân vi khuẩn gây vi? ?m phổi mắc phải cộng đồng bệnh nhân nhập vi? ??n điều. .. tác nhân vi khuẩn gây bệnh phối hợp Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân đơn vi? ?m phổi mắc phải cộng đồng Bảng : Số tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân COPD bị vi? ?m phổi mắc phải cộng đồng