ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: NgƯời hƯớng dẫn 1: NgƯời hƯớng dẫn 2: Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn đƯợc hồn thành Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu dƯới hƯớng dẫn TS Nguyễn Thị PhƯơng TS Nguyễn Hữu Tùng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị PhƯơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu) TS Nguyễn Hữu Tùng (Bộ mơn Hóa dƯợc kiểm nghiệm, Khoa Y DƯợc - ĐHQGHN) ngƯời thầy hƯớng dẫn, bảo, góp ý đƯa ý kiến quý báu để em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS PhƯơng Thiện ThƯơng (TrƯởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu) với anh chị,bạn bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu giúp đỡ em, đặc biệt anh Nguyễn Đình Quân - ngƯời theo sát, hƯớng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Y – DƯợc dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em suốt năm theo học trƯờng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƯ sống Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019 Sinh viên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan aflatoxin 1.1.1 Giới thiệu aflatoxin 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Điều kiện sinh aflatoxin 1.1.4 Cơ chế gây bệnh aflatoxin 1.1.5 Độc tính aflatoxin lên thể ngƯời .9 1.1.6 Những nghiên cứu phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin dƯợc liệu 10 1.2 Tổng quan sắc ký lực miễn dịch sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS) 15 1.2.1 Sắc ký lực miễn dịch 15 1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ 16 CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƯợng nghiên cứu 21 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 21 2.2.1 Chất chuẩn .21 2.2.2 Hóa chất 21 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 22 2.3.2 Xây dựng phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin dƯợc liệu 22 2.3.3 Áp dụng phƯơng pháp đánh giá hàm lƯợng aflatoxin mẫu dƯợc liệu giàu tinh bột thị trƯờng Hà Nội 23 2.4 PhƯơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 PhƯơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử .23 2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí .23 2.4.3 Quy trình thẩm định phƯơng pháp 23 2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 23 2.4.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lƯợng (LOQ) 24 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính đƯờng chuẩn 24 2.4.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 25 2.4.4 PhƯơng pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 27 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29 3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 29 3.2.2 Khảo sát pha động 30 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33 3.3.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 33 3.3.2 Khảo sát dung môi làm 34 3.4 Thẩm định phƯơng pháp 35 3.4.1 Độ chọn lọc phƯơng pháp 35 3.4.2 Tính phù hợp hệ thống 36 3.4.3 ĐƯờng chuẩn khoảng tuyến tính 37 3.4.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƯợng (LOQ) 39 3.4.5 Độ lặp lại độ thu hôi 40 3.5 Áp dụng phƯơng pháp đánh giá hàm lƯợng aflatoxin dƯợc liệu 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AFM1 Aflatoxin M1 AFM2 Aflatoxin M2 AOAC CE/MS Tiếng Việt Association of Official Analytical Hiệp hội nhà phân Chemists tích hóa học Capillary Electrophoresis – Mass Điện di mao quản – Spectrometry khối phổ CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV% Coefficient of Variation Hệ số biến thiên Enzyme – Linked Immuno Sorbent Kỹ thuật miễn dịch liên Assay kết với enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa tia điện tử HCC Hepatocellular carcinoma ELISA HPLC Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao chromatography- Fluorescence Detection IARC bào gan High Performance Liquid High performance liquid HPLC-FLD Ung thƯ biểu mô tế International Agency for Research Sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò huỳnh quang Cơ quan nghiên ung on Cancer LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry thƯ quốc tế Sắc ký lỏng khối phổ Liquid Chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ Mass Spectrometry hai lần LOD Limit of detetion Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƯợng MeOH Methanol PBS Phosphate-Buffered Saline R% Recovery RSD Relative Standard Deviation SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extract Chiết pha rắn SPE-IM Solid phase extract-Immuno TLC Thin layer chromatography LC-MS/MS Dung dịch đệm phosphat Độ thu hồi Độ lệch chuẩn tƯơng đối Chiết pha rắn với cột lực miễn dịch Sắc ký lớp mỏng TLPT Trọng lƯợng phân tử TLTK Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Tính chất vài aflatoxin Bảng Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin nước 11 Bảng 2.1 Danh sách mẫu thu mua 21 Bảng 3.1 Thông số MS tối ưu 28 Bảng Một số chương trình gradient khảo sát 30 Bảng 3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 32 Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi khác 34 Bảng Hiệu suất thu hồi aflatoxin với dung môi làm 35 Bảng Ion mẹ ion aflatoxin .35 Bảng Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 37 Bảng Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích píc chất 38 Bảng Kết xác định LOD LOQ phương pháp 40 Bảng 10 Độ lặp lại độ thu hồi aflatoxin mẫu dược liệu 41 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ khối máy khối phổ 18 Hình 1.2 Bộ phân tích tử cực chập ba 19 Hình 3.1 Phổ khối AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 quan sát chế độ ESI-positive 28 Hình Phổ khối ion aflatoxin .29 Hình 3 Sắc ký đồ chương trình gradient 31 Hình Sắc ký đồ chương trình gradient 31 Hình Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp .36 Hình Đường chuẩn độc tố aflatoxin 39 PHỤ LỤC Dung dịch chuẩn AFB1 18 56 37 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 52 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 10 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 10 51 97 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 41 74 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 12500 10000 7500 5000 2500 5314 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 2,5 ppb 19 68 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 7000 6000 5000 4000 3000 2000 256 1000 130 173 89 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 4000 10 99 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 89 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 0,5 ppb 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 3000 2500 2000 1500 1000 20 12 500 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 0,1 ppb Dung dịch chuẩn AFB2 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 125000 100000 75000 50000 91 74 25000 12 10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 10 ppb 70000 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 60000 50000 40000 30000 50 60 20000 10000 0.0 70 22 13 66 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 12 3.5 5.0 Nồng độ ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 30000 25000 20000 15000 26 13 10000 5000 0.0 38 52 29 0 0.5 1.0 1.5 316 290 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 2.5 ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 15000 12500 10000 7500 5000 14 65 2500 165 207 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 15 11 3.5 4.0 4.5 5.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 57 71 2000 1000 80 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Nồng độ 0,5 ppb Dung dịch chuẩn AFG1 125000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 100000 75000 18 51 61 50000 25000 17 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 10 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 94 39 30000 20000 10000 59 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 55000 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 50000 45000 40000 35000 30000 41 74 25000 20000 14 53 15000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 10000 Nồng độ 2,5 5000 27500 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 25000 22500 20000 17500 15000 19 99 12500 10000 73 13 16 13 7500 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5000 2500 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 12500 10000 7500 5000 10 25 2500 94 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ 0.5 ppb 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 7000 6000 5000 4000 3000 2000 21 81 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Nồng độ 0.1 ppb Dung dịch chuẩn AFG2 3.5 4.0 4.5 5.0 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 40000 35000 30000 25000 66 04 20000 15000 10000 5000 28 0.0 0.5 23 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 26 4.0 25 4.5 5.0 Nồng độ 10 ppb 60000 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 50000 40000 30000 20000 52 06 10000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Nồng độ ppb 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 25000 22500 20000 17500 15000 12500 10000 22 59 7500 5000 2500 25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Nồng độ 2.5 ppb 3.5 4.0 4.5 30 5.0 3630 36 Nồng độ ppb Nồng độ 0.5 ppb SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ Mẫu phát Mẫu YD4 3:AFG1 329.15>243.10(+) CE: -27.0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 48 90 1000 500 17 24 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AFG1 3.5 4.0 4.5 254 199 5.0 4:AFG2 331.15>313.00(+) CE: -25.0 600 500 400 300 200 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 AFG2 3000 1:AFB1 313.20>241.05(+) CE: -39.0 2500 2000 56 39 1500 1000 500 67 167 100 67 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 3.5 4.0 4.5 5.0 AFB1 1750 2:AFB2 315.20>286.95(+) CE: -25.0 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AFB2 Mẫu không phát Mẫu BL1 4.5 5.0 200 1:AFB1 TIC(+) 175 150 125 100 75 50 25 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 250 2:AFB2 TIC(+) 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0.0 1500 3:AFG1 TIC(+) 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 2750 4:AFG2 TIC(+) 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Mẫu TT1 1:AFB1 TIC(+) 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 500 2:AFB2 TIC(+) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 4:AFG2 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 Mẫu CC1 0.5 1:AFB1 TIC(+) 700 600 500 400 300 200 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 2:AFB2 TIC(+) 300 250 200 150 100 50 0.0 3:AFG1 TIC(+) 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4.0 4.5 5.0 12500 4:AFG2 TIC(+) 10000 7500 5000 2500 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Mẫu HS1 2250 1:AFB1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 600 2:AFB2 TIC(+) 500 400 300 200 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2250 3:AFG1 TIC(+) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 4:AFG2 TIC(+) 11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0.0 0.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC- MS/ MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: NgƯời hƯớng... phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin dƯợc liệu với hiệu suất thu hồi cao phƯơng pháp đơn giản, nhƯ tiết kiệm thời gian hơn, đề xuất đề tài ? ?Xây dựng phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin dƯợc liệu LCMS /MS? ??,... LCMS /MS? ??, áp dụng để xác định hàm lƯợng aflatoxin số dƯợc liệu với mục tiêu: - Xây dựng thẩm định phƯơng pháp định lƯợng đồng thời độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) dƯợc liệu phƯơng pháp LC- MS/ MS