HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP Ở TÔM Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ PGS.TS Phan Thị Vân NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ PGS.TS Phan Thị Vân Chân thành cảm ơn Ban Đào tạo sau đại học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú Y Phòng Nghiên cứu Bệnh Thủy sản - Viện Nghiên cứu Nuôi trông Thủy sản I tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn đơn vị tài trợ kinh phí để tơi hồn thiện nghiên cứu Luận văn hoàn thành hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài Thủy sản Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn phê duyệt thuộc chương trình cơng nghệ sinh học Thủy sản tầm nhìn 2020 (Mã số 04/HD-KHCN) Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Đặt vấn đề .1 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi 2.1.1 Trên giới .3 2.1.2 Ở Việt Nam .7 2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược NTTS 10 2.2.1 Trên giới 12 2.2.2 Tại Việt Nam 14 2.3 Một số loại thảo dược lựa chọn nghiên cứu 16 2.3.1 Ké hoa vàng 16 2.3.2 Khổ sâm 17 2.3.3 Nghệ 18 2.3.4 Thồm lồm 19 2.3.5 Thầu dầu 20 2.3.6 Đơn buốt 21 Phần Phương pháp nghiên cứu 23 3.1 Địa điểm nghiên cứu .23 3.2 Vật liệu nghiên cứu 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 iii 3.4.1 Kiểm tra gen độc lực vi khuẩn V parahaemolyticus KC12.020 kỹ thuật sinh học phân tử 24 3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính mẫu dịch chiết thô điều kiện invitro vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm 25 3.4.3 Thử nghiệm hiệu phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm dịch chiết thô điều kiện phịng thí nghiệm 26 3.4.4 Thử nghiệm hiệu phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm dịch chiết thô quy mô thực nghiệm (pilot) .29 3.4.5 Phương pháp xử lý phân tích số liệu 32 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 33 4.1 Xác nhận chủng vi khuẩn gây bệnh ahpnd kỹ thuật sinh học phân tử 33 4.2 Xác định hoạt tính mẫu dịch chiết thơ thảo dược điều kiện invitro vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm .34 4.3 Xác định hoạt tính dịch chiết thơ thảo dược phịng trị bệnh ahpnd tơm điều kiện phịng thí nghiệm 36 4.3.1 Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn 36 4.3.2 Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm 38 4.4 Xác định hoạt tính dịch chiết thơ thồm lồm phịng trị bệnh ahpnd tôm quy mô thực nghiệm (PILOT) 41 4.4.1 Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn 41 4.4.2 Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm 46 Phần Kết luận kiến nghị 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease BVTV Bảo vệ thực vật ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long DMSO Dimethyl sulfoxide HPV Hepatopancreas IMNV Infectious Myoneaosis Virus MHA Mueller Hinton Agar MPV Monoden Baculovirus NB Nutrient Broth NHP Necrotizing Heptopancrcatitis NTTS Nuôi trồng thủy sản TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts TSV Taura Syndrome Virus WSSV White spot syndrome virus YHV Yellow head virus v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại terpenoid dựa theo liên kết mắt xích 12 Bảng 3.1 Danh mục thảo dược chiết xuất dạng thô sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Nồng độ loại chiết phẩm thô khoanh giấy lập kháng sinh đồ 25 Bảng 3.3 Thí nghiệm đánh giá hiệu dịch chiết thô bệnh AHPND tơm điều kiện phịng thí nghiệm 27 Bảng 3.4 Thí nghiệm đánh giá hiệu dịch chiết thô thồm lồm bệnh AHPND tôm quy mô thực nghiệm (pilot) 30 Bảng 4.1 Tác dụng diệt vi khuẩn gây bệnh AHPND dịch chiết thơ .34 Bảng 4.2 Kết thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tơm ăn điều kiện phịng thí nghiệm 36 Bảng 4.3 Kết thí nghiệm bổ sung dịch chiết thơ thảo dược vào mơi trường nước ni tơm điều kiện phịng thí nghiệm 39 Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND q trình thí nghiệm (khi sử dụng dịch chiết thô thân thồm lồm) (%) .40 Bảng 4.5 Kết thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn quy mô thực nghiệm (pilot) 42 Bảng 4.6 Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn ngày liên tục trước công cường độc (%) 43 Bảng 4.7 Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn ngày liên tục, công cường độc ngày thứ tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô ngày (%) 45 Bảng 4.8 Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND công cường độc cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm thời điểm (%) 46 Bảng 4.9 Kết thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm quy mô thực nghiệm (pilot) 46 Bảng 4.10 Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước thời điểm (lần công cường độc, lần cách lần 24h) (%) 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hiện tượng thối hố gan tuỵ cấp tính với mơ gan tụy bị phá hủy .4 Hình 2.2 Trường hợp bình thường với tế bào phân chia Hình 2.3 Trường hợp bất thường thiếu phân chia tế bào Hình 2.4 Trường hợp bình thường có diện tế bào B, F Hình 2.5 Trường hợp bất thường khơng có diện tế bào B, F Hình 2.6 Tế bào có nhân lớn bất thường giai đoạn đầu AHPND Hình 2.7 Nhiễm khuẩn thứ cấp giai đoạn sau .5 Hình 2.8 Tơm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy teo nhỏ Hình 2.9 Tơm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy nhạt màu so với bình thường .7 Hình 2.10 Ké hoa vàng 16 Hình 2.11 Khổ sâm 17 Hình 2.12 Củ nghệ 18 Hình 2.13 Cây thồm lồm 19 Hình 2.14 Thầu dầu 20 Hình 2.15 Cây đơn buốt 21 Hình 4.1 Kết xác định chủng vi khuẩn gây AHPND kỹ thuật PCR 33 Hình 4.2 Chuẩn bị pha dịch chiết thơ lập kháng sinh đồ (A,B), vịng vơ khuẩn dịch chiết thô vi khuẩn gây bệnh AHPND tôm (C,D E) 35 Hình 4.3 Tỷ lệ tôm chết cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thơ M4 M5 (%) 37 Hình 4.4 Mẫu phân tích sau cơng cường độc vi khuẩn gây bệnh AHPND lên tơm thí nghiệm (1,2, mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M4, 4,5 mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M5, thuộc lô đối chứng âm) 38 Hình 4.5 Tỷ lệ tơm chết bổ sung chế phẩm M4 M5 vào nước (%) .39 Hình 4.6 Thử nghiệm hiệu hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh AHPND phịng thí nghiệm ướt 40 Hình 4.7 Tỷ lệ tôm chết bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn ngày liên tục trước công cường độc (%) 43 vii Hình 4.8 Tỷ lệ tơm chết bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn ngày liên tục, công cường độc ngày thứ tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô ngày (%) 44 Hình 4.9 Tỷ lệ tơm chết công cường độc cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm thời điểm (%) 45 Hình 4.10 Tỷ lệ tôm chết bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước thời điểm (lần công cường độc, lần cách lần 24h) (%) 47 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Huyền Tên Luận văn: Nghiên cứu tác dụng số loại thảo dược phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm Ngành: Thú Y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định loại thảo dược có hiệu phịng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi Đối tượng nghiên cứu Tôm nuôi nước lợ, vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp sáu loại thảo dược bao gồm: Thồm lồm, Ké hoa vàng, Nghệ, Khổ sâm, Thầu dầu Đơn buốt Phương pháp nghiên cứu - Kiểm tra gen độc lực vi khuẩn V parahaemolyticus KC12.020 kỹ thuật sinh học phân tử - Thử nghiệm hoạt tính mẫu dịch thơ điều kiện invitro vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm - Thử nghiệm hiệu phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tơm chế phẩm điều kiện phịng thí nghiệm - Thử nghiệm hiệu phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm chế phẩm quy mô thực nghiệm (pilot) Một số kết kết luận Hồn thành đề tài chúng tơi có số kết kết luận sau:  Trong điều kiện invitro - Sản phẩm dịch chiết thơ từ thầu dầu thồm lồm có hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn V parahaemolyticus KC12.020 gây bệnh AHPND tôm nuôi nước lợ - Dịch chiết thô ethanol thu từ thân thồm lồm có hiệu diệt vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND với đường kính vịng vơ khuẩn đạt 19,820,6 mm sử dụng nồng độ 66,7-200 µg/khoanh/20 µl  Ở quy mơ phịng thí nghiệm: - Sản phẩm dịch chiết thơ thầu dầu thồm lồm khơng có hiệu phòng bệnh AHPND qua đường ăn với nồng độ tương ứng 25-30g dịch thô/100kg tôm 35 -40g dịch thơ/100kg tơm ix có kết dương tính với bệnh AHPND kỹ thuật PCR Đặc biệt, kỹ thuật mô bệnh học xác định rõ biến đổi đặc trưng bệnh AHPND tế bào gan có nhân lớn bất thường bong tróc tế bào (Lai et al., 2015) Sở dĩ, thí nghiệm bổ sung thảo dược 25-30 g/m3, tỷ lệ mẫu dương tính AHPND tương ứng 66,7 33,3% thấp so với lô đối chứng dương (100%) ( Bảng 4.4), nguyên nhân dịch chiết thô thảo dược diệt, ức chế vi khuẩn phát triển, mật độ vi khuẩn nước không đạt mức 105-106 cfu/ml Như vậy, với nồng độ dịch chiết thô thồm lồm 30 g/m3 bổ sung vào nước lần có ý nghĩa quan trọng nâng cao tỷ lệ sống tôm điều kiện tôm sống môi trường chứa tác nhân gây bệnh AHPND với mật độ 105-106 cfu/ml, tỷ lệ sống cộng dồn đến 21 ngày thí nghiệm 60%, lơ đối chứng dương tỷ lệ sống 0% ngày thứ (Bảng 4.3) Hơn nữa, ngày cuối thí nghiệm tơm có kết âm tính với vi khuẩn gây bệnh AHPND 4.4 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT THƠ THỒM LỒM TRONG PHỊNG TRỊ BỆNH AHPND TRÊN TƠM Ở QUY MƠ THỰC NGHIỆM (PILOT) 4.4.1 Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn Từ kết nghiên cứu nêu mục 4.3 nêu trên, dịch chiết thô thồm lồm lựa chọn để triển khai tiếp thí nghiệm quy mơ thực nghiệm (pilot) Để khắc phục tình trạng tơm chết khơng ăn thức ăn chứa thảo dược, thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô vào thức ăn cho tôm ăn điều kiện phịng thí nghiệm, cách: Trước cho tôm ăn dịch chiết thô trộn vào thức ăn, tơm nhịn đói cữ trước thức ăn trộn dịch chiết thô bao bọc lần dầu gan mực, thay trước bao dầu gan mực lần Kết trình bày bảng 4.5, bảng 4.6, bảng 4.7, bảng 4.8 hình 4.7, hình 4.8, hình 4.9 41 Bảng 4.5 Kết thí nghiệm bổ sung dịch chiết thơ thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn quy mô thực nghiệm (pilot) Kết Nồng độ dịch Thí nghiệm chiết thơ thồm lồm (g/100kg tơm) Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm Thời gian tơm chết Tỷ lệ tôm chết kết Tỷ lệ tôm sống kết thúc thí nghiệm (%) thúc thí nghiệm (%) 25 30 Ngày thứ 5-ngày thứ 18 Ngày thứ 3-ngày thứ 18 16,0 21,0 84,0 79,0 ĐC (+) ĐC (-) Ngày thứ 7-ngày thứ 18 Ngày thứ 1-ngày thứ 18 100 3,0 97,0 25 30 Ngày thứ 5-ngày thứ 21 Ngày thứ 3-ngày thứ 21 84,0 92,0 16,0 8,0 ĐC (+) ĐC (-) Ngày thứ 7-ngày thứ 21 Ngày thứ 1-ngày thứ 21 100 0 100 25 Ngày thứ 1-ngày thứ 100 30 ĐC (+) ĐC(-) Ngày thứ 1-ngày thứ Ngày thứ 1-ngày thứ Ngày thứ 3-ngày thứ 100 100 5,0 0 95,0 Ghi chú: Thí nghiệm 1: Dịch chiết thơ trộn vào thức ăn cho tôm ăn ngày liên tục sau ni tơm bể thí nghiệm Thí nghiệm 2: Thức ăn chứa dịch chiết thơ cho tôm ăn lần, lần kéo dài ngày lần sau công cường độc vi khuẩn Thí nghiệm 3: Bổ sung thức ăn chứa dịch chiết thô cho tôm ăn thời điểm với cơng cường độc vi khuẩn Ở thí nghiệm 1, dịch chiết thô trộn vào thức ăn cho tôm ăn ngày liên tục sau nuôi tôm bể thí nghiệm Nồng độ dịch chiết thơ phối trộn vào thức ăn 25g/100kg tôm 30g/100kg tơm Kết cho thấy lơ thí nghiệm sử dụng thức ăn chứa dịch chiết thô tôm ăn so với lô đối chứng âm đối chứng dương, ngày thứ thứ có tượng tơm chết tương ứng lơ ăn dịch chiết thô 30g/100kg tôm 25g/100kg tôm, tỷ lệ chết tăng ngày tiếp theo, nhiên thời điểm sau công cường độc vi khuẩn tỷ lệ chết không tăng cao (Hình 4.7) Thời điểm tơm chết phần lớn ghi nhận tơm lột xác, tơm chết có tượng mềm, chết khơng có khả tạo vỏ sau lột xác để tăng trưởng, tỷ lệ chết tích lũy đến kết thúc thí nghiệm 21% (bổ sung 30g/100kg tôm), 16% (bổ sung 25g/100kg tôm) tỷ lệ chết lô sử dụng dịch chiết thơ khơng có ý nghĩa khác biệt (p>0,05), 100% (đối chứng dương) 3% (đối 42 chứng âm) (Bảng 4.5), tỷ lệ chết cộng dồn lô sử dụng dịch chiết thơ có ý nghĩa khác biệt với lơ dối chứng âm đối chứng dương (p