HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ KIM CHUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CÒI CỌC Ở LỢN CHỦNG VNUA-PCV2-HN14 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Giáp NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kim Chung i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới người thầy Ts Nguyễn Văn Giáp tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức môn Vi sinh vật – truyền nhiễm giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kim Chung ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Các chữ viết tắt V Danh mục bảng VII Danh mục hình VIII Trích yếu luận văn IX Thesis abstract XI Phần Mở đầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hiểu biết pcv2 bệnh PCV2 gây 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Địa dư bệnh .3 2.1.3 Căn bệnh 2.1.4 Dịch tễ học 2.1.5 Triệu chứng bệnh tích 2.1.6 Chẩn đoán 12 2.1.7 Phòng bệnh 15 2.1.8 Điều trị 16 2.2 Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh PCV2 giới Việt Nam 16 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Thời gian nghiên cứu 20 3.3 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 21 3.5.1 Nhận dạng virus 21 3.5.2 Kiểm tra tính khiết 28 3.5.3 Xác định chuẩn độ chủng giống 33 3.5.4 Kiểm tra tính tính độc 34 iii 3.5.5 Kiểm tra tính gây miễn dịch 36 Phần Kết thảo luận 38 4.1 Kết nhận dạng Virus 38 4.1.1 Nhận dạng phản ứng nested PCR 38 4.1.2 Nhận dạng giải trình tự gen 39 4.1.3 Nhận dạng phản ứng IFA 43 4.2 Kết xác định hiệu giá chủng giống VNUA-PCV2-HN14 44 4.3 Kết kiểm tra chất lượng chủng giống VN-PCV2-HN14 45 4.3.1 Kết kiểm tra khiết 45 4.3.2 Kết kiểm tra tính độc chủng giống 47 4.3.3 Kiểm tra tính sinh miễn dịch 53 Phần Kết luận kiến nghị 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Đề nghị 55 Tài liệu tham khảo 56 iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADN : Deoxyribose Nucleotide Acid ARN : RiboNucleic Acid BVDV : Bovine Viral Diarrhea Virus CDCD : Cesarean- Derived Colostrum- Deprived cDNA : complementary Deoxyribose Nucleic Acid CQ : Chloroquine Diphosphate salt CSFV : Classical Swine Fever Virus Ct : Cycle threshold DEPC : DiEthyl PyroCarbonate DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium DTT : DiThioThreitol ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay FAM : 6-carboxyfluorescein FBS : Fetal Bovine Serum FITC : Fluorescein IsoThioCyanate IFA : ImmunoFluoresecence Assay IFN : Interferon IHC : ImmunoHistoChemistry IPMA : ImmunoPeroxidase Monolayer Assay ISH : in situ Hybridization MHP : Mycoplasma HyoPneumoniae ORF : Open Reading Frame PAdV : Porcine Adenovirus PBS : Phosphate Buffered Saline PCI : Phenol- Chloroform- Isoamyl alcohol PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine CircoVirus PCV1 : Porcine CircoVirus type v PCV2 : Porcine CircoVirus type PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea Virus PK15 : Pig Kidney 15 cells PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome PPV : Porcine ParvoVirus PRCV : Porcine Respiratory Corona Virus PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV : porcine Pseudorabies Virus Rp : Random primer RT : Reverse Transcription RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction S/N : Sample-to-Negative value SIV : Swine Influenza Virus TCID50 : Tissue Culture 50% Infectious Dose TE : Tris-EDTA TGEV : Transmissible GastroEnteritis Virus vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi dùng phát có mặt PCV2 21 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR phát có mặt PCV2 24 Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi dùng nhân đặc hiệu gen PCV2 25 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu gen PCV2 26 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đặc hiệu gen PCV2 26 Bảng 3.6 Trình tự mồi dùng để xác định tạp nhiễm virus mycoplasma 30 Bảng 3.7 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 32 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR chẩn đoán PCV2 33 Bảng 4.1 Mức tương đồng trình tự nucleotide phân tích phương pháp BLAST 41 Bảng 4.2 Kết xác định hiệu giá giống virus VNUA-PCV2-HN14 44 Bảng 4.3 Kết kiểm tra tạp khuẩn nấm chủng giống virus VNUAPCV2-HN14 45 vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Sơ đồ vị trí mồi sản phẩm phản ứng nested PCR 23 Hình 3.2 Sơ đồ vị trí cặp mồi nhân đặc hiệu gen PCV2 25 Hình 4.1 Kết nested PCR phát PCV2 38 Hình 4.2 Kết giải trình tự gen giống virus VNUA-PCV2-HN14 39 Hình 4.3 Trình tự genome giống virus VNUA-PCV2-HN14 40 Hình 4.4 Cây phát sinh chủng loại PCV2 42 Hình 4.5 Kết IFA phát PCV2 giống VNUA-PCV2-HN14 43 Hình 4.6 Mơi trường kiểm tra vơ trùng 45 Hình 4.7 Chai ni cấy virus với dịch ni cấy 46 Hình 4.8 Kết kiểm tra khiết chủng giống VNUA-PCV2-HN14 46 Hình 4.9 Tăng trọng lợn sau gây nhiễm virus VNUA-PCV2-HN14 47 Hình 4.10 Biến đổi bệnh lý đại thể hạch lympho 48 Hình 4.11 Biến đổi bệnh lý đại thể hạch lympho màng treo ruột 49 Hình 4.12 Biến đổi bệnh lý đại thể phổi 50 Hình 4.13 Biến đổi bệnh lý đại thể niêm mạc đường tiêu hóa 51 Hình 4.14 Lịng phế quản phế nang phổi sáng, khơng có tượng thâm nhiễm tế bào viêm 52 Hình 4.15 Quan sát thấy tượng thối hóa nang lympho miền vỏ 52 Hình 4.16 Kết PCR phát PCV2 mẫu phân sau tiêm vacxin 53 Hình 4.17 Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau gây miễn dịch chủng virus VNUA-PCV2-HN14 54 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Kim Chung Tên Luận văn: Nghiên cứu đặc tính sinh học virus gây hội chứng cịi cọc lợn chủng VNUA-PCV2-HN14 Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn chủng PCV2 có đặc tính kháng nguyên ổn định để sản xuất vacxin; Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu nhận dạng virus chủng giống VNUA-PCV2-HN14 + Nhận dạng phản ứng nested PCR + Nhận dạng giải trình tự gen + Nhận dạng phản ứng IFA - Xác định hiệu giá virus chủng giống VNUA-PCV2-HN14 - Kiểm tra chất lượng chủng giống VNUA- PCV2-HN14 - Kiểm tra độ khiết chủng giống VNUA-PCV2-HN14 - Kiểm tra tính độc chủng giống VNUA-PCV2-HN14 + Đánh giá gián tiếp thơng qua tiêu tăng trọng lợn thí nghiệm + Kết mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm chủng giống VNUA-PCV2-HN14 - Kiểm tra tính sinh miễn dịch Nguyên liệu - Chủng giống VNUA-PCV2-HN14 nhóm nghiên cứu đề tài khoa học cấp Nhà nước mã số KC.04.22/11-15 (bộ môn VSV-TN, khoa Thú y, Học viện NNVN cung cấp) - Các loại sinh phẩm, hóa chất - Trang thiết bị phịng thí nghiệm - Lợn thí nghiệm Phương pháp - Nhận dạng phản ứng nested-PCR - Nhận dạng giải trình tự gen ix Kết trình bày hình 4.8 cho thấy, 09 mẫu đối chứng dương chuẩn cho vạch đặc hiệu với kích thước thiết kế, giếng đối chứng âm không xuất vạch đặc hiệu, chứng tỏ phản ứng PCR hoạt động khơng có tượng tạp chéo Ở giếng chạy điện di sản phẩm PCR chủng giống VNUA-PCV2-HN14 không xuất vạch đặc hiệu với 09 loại virus mycoplasma xét nghiệm Như vậy, kết kiểm tra độ khiết cho thấy chủng giống VNUAPCV2-HN14 không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm không tạp nhiễm virus CSFV, PRRSV, PEDV, TGEV, PCV1, PPV, PRV, PAdV Mycoplasma hyopneumoniae 4.3.2 Kết kiểm tra tính độc chủng VNUA-PCV2-HN14 Kết PCR kiểm tra tượng virus huyết cho thấy lợn gây miễn dịch chủng giống VNUA-PCV2-HN14 dương tính PCV2 sau gây nhiễm ngày Tính độc chủng giống VNUA-PCV2-HN14 đánh giá gián tiếp thông qua tiêu tăng trọng lợn thí nghiệm Biểu đồ diễn biến tăng trọng lợn sau tiêm virus trình bày hình 4.9 Hình 4.9 Tăng trọng lợn sau gây nhiễm virus VNUA-PCV2-HN14 47 Kết phân tích phương sai sai khác tăng trọng lợn gây nhiễm chủng giống VNUA-PCV2-HN14 (T10, T11) lợn đối chứng (T9) tuần thứ sau gây nhiễm virus khơng có ý nghĩa thống kê (Fthực nghiệm = 1,65 < Flý thuyết = 3,47) Từ tuần thứ tới tuần thứ sau gây nhiễm virus, sai khác tăng trọng lợn đối chứng lợn thí nghiệm có ý nghĩa thống kê (p= 0,005) Như vậy, kết luận chủng giống VNUA-PCV2-HN14 có tính độc, làm giảm khả tăng trọng lợn điều kiện thí nghiệm Kết mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm chủng giống VNUA-PCV2-HN14 bao gồm: Hình 4.10 Biến đổi bệnh lý đại thể hạch lympho (Hạch hàm giới hạn đường nét đứt; Mũi tên dịch rỉ viêm mặt cắt hạch bẹn nông) 48 Hạch lympho: Kết mổ khám kiểm tra biến đổi đại thể hạch lympho lợn gây nhiễm PCV2 trình bày hình 4.10 4.11 Kết thể hình 4.10 cho thấy, hạch hàm (T9.2, T10.2 T11.2), hạch bẹn nông (T9.1, T10.1 T11.1) khơng có biểu tăng kích thước Ở tồn số lợn gây nhiễm PCV2, khơng phát hiện tượng xung huyết, xuất huyết hạch kể Tuy nhiên, quan sát tượng mặt cách hạch ướt có nhiều dịch rỉ viêm (hình 4.10 T10.1, T10.2) Biến đổi bệnh lý hạch lympho màng treo ruột trình bày hình 4.11 cho thấy: hạch lympho màng treo ruột non (T9.1, T10.1 T11.1) hạch lympho màng treo kết tràng (T9.2, T10.2 T11.2) có màu vàng nhạt, khơng có tượng xung huyết xuất huyết hạch Các hạch khơng có thay đổi kích thước Hình 4.11.Biến đổi bệnh lý đại thể hạch lympho màng treo ruột 49 Kết mổ khám kiểm tra biến đổi đại thể phổi cho thấy: (1) Về màu sắc: toàn thùy phổi, mặt lưng mặt bụng phổi có màu hồng nhạt Hình 4.12 Biến đổi bệnh lý đại thể phổi (2) Về đàn tính phổi: cạo nhẹ sống dao lên bề mặt phổi thấy phổi bị xẹp bề mặt phổi trạng thái láng bóng Khi dùng tay nắn thùy phổi không phát thấy vùng phổi có tượng sưng cứng Cắt miếng phổi nhỏ hạt đậu xanh thùy phổi khác nhau, thả vào nước thấy bề mặt 50 (3) Về mặt cắt phổi: dùng dao cắt ngang phổi quan sát màu mặt cắt đồng nhất, có màu hồng nhạt Biến đổi bệnh lý hệ tiêu hóa: Kết mổ khám kiểm tra biến đổi đại thể đường tiêu hóa trình bày hình 4.13 Hình 4.13 Biến đổi bệnh lý đại thể niêm mạc đường tiêu hóa Mổ khám kiểm tra biến đổi bệnh lý đường tiêu hóa khơng quan sát bất thường niêm mạc ruột non, manh tràng kết tràng Biến đổi bệnh lý vi thể lợn gây nhiễm chủng giống VNUAPCV2-HN14 minh họa hình 4.14 – 4.15 51 Hình 4.14 Lịng phế quản phế nang phổi sáng, khơng có tượng thâm nhiễm tế bào viêm Hình 4.15 Quan sát thấy tượng thối hóa nang lympho miền vỏ Như vậy, điều kiện thí nghiệm này, chủng giống VNUA-PCV2HN14 làm giảm khả tăng trọng lợn gây biến đổi bệnh lý đại thể/ vi thể hạch lympho lợn 52 4.3.3 Kết kiểm tra tính sinh miễn dịch Trong nội dung này, dùng chủng virus VNUA-PCV2-HN14 bất hoạt để gây miễn dịch cho lợn âm tính PCV2 âm tính với kháng thể kháng PCV2 Tiến hành theo dõi biểu lâm sàng lợn sau gây miễn dịch không phát thấy dấu hiệu bất thường lợn thí nghiệm vị trí tiêm phản ứng tồn thân Bên cạnh việc theo dõi tình trạng lợn sau tiêm vacxin, tiến hành lấy mẫu phân để xét nghiệm thải virus có (hình 4.11) Hình 4.16 Kết PCR phát PCV2 mẫu phân sau tiêm vacxin Kết PCR phát có mặt PCV2 mẫu phân (thời điểm ngày sau gây miễn dịch) cho kết âm tính (hình 4.16) PCR cho kết âm tính với PCV2 mẫu phân (thời điểm 07 ngày sau gây miễn dịch).Kết chứng tỏ virus dùng gây miễn dịch bất hoạt hồn tồn khơng có lưu hành virus lơ lợn thí nghiệm Theo dõi thân nhiệt lợn thí nghiệm sau gây miễn dịch chủng giống VNUA-PCV2-HN14 cho thấy thân nhiệt lợn dao động khoảng 37,9 oC đến 39,3 oC nằm phạm vi sinh lý bình thường Kết nghiên cứu tượng chuyển dương tính huyết học lợn thí nghiệm sau gây miễn dịch trình bày hình 4.17 53 0.9 0.8 0.7 0.6 S/N 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 D0 D7 D14 D21 P1 D28 P2 D35 D42 D49 D56 Ngày Đ.c Hình 4.17 Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau gây miễn dịch chủng virus VNUA-PCV2-HN14 Kết trình bày hình 4.17 cho thấy, ngày D7 D14 sau gây miễn dịch, 03 lợn thí nghiệm âm tính huyết học với kháng thể kháng PCV2 (giá trị S/N > 0,4) Trong trình theo dõi (D0 – D56), lợn đối chứng âm tính với kháng thể kháng PCV2 Ở 02 lợn gây miễn dịch chủng giống VNUA-PCV2-HN14, chuyển dương tính huyết học diễn vịng 14 đến 21 ngày sau tiêm (vùng màu xám, hình 4.12) Độ dài đáp ứng miễn dịch dịch thể xác định tối thiểu đến ngày 56 sau tiêm kháng nguyên Kết trình bày hình 4.12 chứng tỏ giống virus VNUA-PCV2-HN14 có khả kích thích động vật sản sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 54 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Với kết trình bày trên, rút số kết luận sau: (1) Chủng giống VNUA-PCV2-HN14 lựa chọn làm giống vacxin Porcine circovirus type 2, thuộc nhóm tái tổ hợp genotype PCV2b Chủng giống VNUA-PCV2-HN14 có khả nhân lên môi trường tế bào PK15 (2) Hiệu giá chủng giống VNUA-PCV2-HN14 xác định 105,00 TCID50/0,1 ml (3) Kết kiểm tra độ khiết cho thấy chủng giống VNUA- PCV2-HN14 không tạp nhiễm vi khuẩn, vi nấm không tạp nhiễm virus CSFV, PRRSV, PEDV, TGEV, PCV1, PPV, PRV, PAdV Mycoplasma hyopneumoniae - Khi kiểm tra lợn, chủng giống VNUA-PCV2-HN14 có tính độc, làm giảm khả tăng trọng gây biến đổi bệnh lý đại thể/ vi thể hạch lympho lợntrong điều kiện thí nghiệm - Tiến hành gây nhiễm cho lợn, giống virus VNUA-PCV2-HN14 có khả kích thích động vật sản sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu ổn định chủng giống VNUA-PCV2-HN14 sau bảo quản; - Nghiên cứu sử dụng chủng giống VNUA-PCV2-HN14 để sản xuất vacxin phòng bệnh 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Văn Giáp (2013) Phân lập xác định đặc tính sinh học Porcine circovirus type (PCV2) đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển 11: tr 304-309 Nguyễn Thị Thu Hồng Phan Hoàng Dũng cs (2006) Bước đầu khảo sát tình hình nhiễm PCV2 đàn heo ni số tỉnh thành phía Nam Khoa học Kỹ thuật Thú gy XIII Tr 67-69 TCVN (2010) TCVN 8408:2010 Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - Quy trình phân tích rủi ro nhập 1: 29 Trần Thị Dân Nguyễn Tất Toàn cs (2010) Biến đổi tiêu huyết học bệnh tích heo ni thịt tiêm chủng vacxin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm viêm da-thận circovirus typ Khoa học Kỹ thuật Thú y 17: Tiếng Anh: Andraud, M., B Grasland, B Durand, R Cariolet, A Jestin, F Madec, J S Pierre and N Rose (2009) "Modelling the time-dependent transmission rate for porcine circovirus type (PCV2) in pigs using data from serial transmission experiment." J R Soc Interface 6: pp 39-50 Chae, C (2012a) "Commercial porcine circovirus type vaccines: efficacy and clinical application." Vet J 194: pp 151-157 Chae, C (2012b) "Porcine circovirus type and its associated diseases in Korea." Virus Research 164: pp 107-113 Chae, J S., and K S Choi, (2010) "Genetic diversity of porcine circovirus type from pigs in Republic of Korea." Res Vet Sci 88: pp 333-338 Cheung, A K., K M Lager, O I Kohutyuk, A L Vincent, S C Henry, R B Baker, R R Rowland and A G Dunham (2007) "Detection of two porcine circovirus type genotypic groups in United States swine herds." Arch Virol 152: pp 1035-1044 10 Cheung, A K and S R Bolin (2002) "Kinetics of porcine circovirus type replication." Arch Virol 147: pp 43-58 11 Chiarelli-Neto, O., K Yotoko, P Vidigal, F Silva, L Castro, J Fietto, A Silva and M Almeida (2009) "Classification and putative origins of Brazilian porcine circovirus inferred through phylogenetic and phylogeographical approaches." Virus Research 140:pp 57-63 56 12 Cook, A J (2001) "A case study: control study of post-weaning multi-systemic wasting syndrome (PMWS) and porcine dermatitis nepropathy syndrome (PDNS)." The Pig Journal 40: pp 53-60 13 Cortey, M., E Pileri, M Sibila, J Pujols, M Balasch, J Plana and J Segales (2011) "Genotypic shift of porcine circovirus type from PCV-2a to PCV-2b in Spain from 1985 to 2008." Vet J 187: pp 363-368 14 Darwich, L., J Segales and E Mateu (2004) "Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome caused by Porcine circovirus 2: An immune riddle." Arch Virol 149: pp 857-874 15 Dewey, C E., W T Johnston, L Gould and T L Whiting (2006) "Postweaning mortality in Manitoba swine." Can J Vet Res 70: pp 161-167 16 Dupont, K., E O Nielsen, P Baekbo and L E Larsen (2008) "Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time." Vet Microbiol 128: pp 56-64 17 Fenaux, M., P G Halbur, M Gill, T E Toth and X.-J Meng (2000) "Genetic characterization of type porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2." Journal of Clinical Microbiology 38: pp 2494-2503 18 Ferreira, D., B Sansot and A Laval (2001) Attempt to use serotherapy to control mortality in PMWS Proc ssDNA viruses of plants, birds, pigs, primates 19 Gagnon, C A., N Music, G Fontaine, D Tremblay and J Harel (2010) "Emergence of a new type of porcine circovirus in swine (PCV): a type and type PCV recombinant." Vet Microbiol 144: pp 18-23 20 Gillespie, J., T Opriessnig, X J Meng, K Pelzer and V Buechner-Maxwell (2009) "Porcine circovirus type and porcine circovirus-associated disease." J Vet Intern Med 23: pp 1151-1163 21 Guo, L J., Y H Lu, Y W Wei, L P Huang and C M Liu (2010) "Porcine circovirus type (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China." Virol J 7: pp 273 22 Hamel, A L., L L Lin and G P Nayar (1998) "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs." J Virol 77: pp 5262-5267 23 Hundesa, A., C Maluquer de Motes, S Bofill-Mas, N Albinana-Gimenez and R Girones (2006) "Identification of human and animal adenoviruses and 57 polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment." Appl Environ Microbiol 72: pp 7886-7893 24 Jaganathan, S., O Toung, P Yee, T Yew, C Yoon and L Keong (2011) "Genetic characterization of Porcine circovirus found in Malaysia." Virology Journal 8: pp 437 25 Jantafong, T., A Boonsoongnern, P Poolperm, K Urairong, C Lekcharoensuk and P Lekcharoensuk (2011) "Genetic characterization of porcine circovirus type in piglets from PMWS-affected and -negative farms in Thailand." Virol J 8: 88 26 Kamau, N., J Park, J Park, B Hyun, D Yang, J Song and H Shin (2010) "Susceptibility of mice to porcine epidemic diarrhea virus." Journal of Animal and Veterinary Advances 9: pp 3114-3116 27 Kim, H B., K S Lyoo and H S Joo (2009) "Efficacy of different disinfectants in vitro against porcine circovirus type 2." Vet Rec, 164: pp 599-600 28 Kim, J and C Chae (2003) "Multiplex nested PCR compared with in situ hybridization for the differentiation of porcine circoviruses and porcine parvovirus from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome." Can J Vet Res 67: pp 133-137 29 Kim, S Y., D S Song and B K Park (2001) "Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR." J Vet Diagn Invest 13: pp 516-520 30 Kurtz, S., L Grau-Roma, M Cortey, M Fort, F Rodriguez, M Sibila and J Segales (2014) "Pigs naturally exposed to porcine circovirus type (PCV2) generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins." Vet Res., 45: pp 29 31 Lam, T H a C M D (2006) Detection of porcine circovirus from lesions of postweaning-pig with wasting disease at some farms in Ho Chi Minh city and some adjacent provinces Proceedings of international workshop on Biotechnology in agriculture, Ho Chi Minh city, Vietnam 32 Lopez-Soria, S., J Segales, N Rose, M J Vinas, P Blanchard, F Madec, A Jestin, J Casal and M Domingo (2005) "An exploratory study on risk factors for postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in Spain." Prev Vet Med 69: pp 97-107 33 Martin, H., M F Le Potier and P Maris (2008) "Virucidal efficacy of nine commercial disinfectants against porcine circovirus type 2." Vet J 177: 388-393 58 34 McKeown, N E., T Opriessnig, P Thomas, D K Guenette, F Elvinger, M Fenaux, P G Halbur and X J Meng (2005) "Effects of porcine circovirus type (PCV2) maternal antibodies on experimental infection of piglets with PCV2." Clin Diagn Lab Immunol 12: pp 1347-1351 35 McWilliam H., W L., M Uludag, S Squizzato, Y M Park, N Buso, A P Cowley and R Lopez (2013) "Analysis tool web services from the EMBLEBI." Nucleic Acids Research 41: pp 597-600 36 Muhling, J., W S Raye, J R Buddle and G E Wilcox (2006) "Genetic characterisation of Australian strains of porcine circovirus types and 2." Aust Vet J 84: pp 421-425 37 Neumann, E J., S S Dobbinson, E B Welch and R S Morris (2007) "Descriptive summary of an outbreak of porcine post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS ) in New Zealand." N Z Vet J 55: pp 346-352 38 O'Dea, M A., M J Kabay, J Carr, G E Wilcox and R B Richards (2011) "Porcine circovirus-associated disease in weaner pigs in Western Australia." Aust Vet J 89: pp 122-130 39 O'Neill, K., M Hemann, L Gimenez-Lirola, P Halbur and T Opriessnig (2012) "Vaccination of sows reduces the prevalence of PCV-2 viraemia in their piglets under field conditions." The Veterinary record: pp 425-427 40 Olvera, A., M Cortey and J Segales (2007) "Molecular evolution of porcine circovirus type genomes: phylogeny and clonality." Virology 357: pp 175-185 41 Opriessnig, T., A R Patterson, D M Madson, N Pal and P G Halbur (2009a) "Comparison of efficacy of commercial one dose and two dose PCV2 vaccines using a mixed PRRSV-PCV2-SIV clinical infection model 2-3-months post vaccination." Vaccine 27: pp 1002-1007 42 Opriessnig, T., A R Patterson, X J Meng and P G Halbur (2009b) "Porcine circovirus type in muscle and bone marrow is infectious and transmissible to naive pigs by oral consumption." Vet Microbiol 133: pp 54-64 43 Opriessnig, T., X J Meng and P G Halbur (2007) "Porcine circovirus type associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies." J Vet Diagn Invest 19: pp 591-615 44 Patterson, A R and T Opriessnig (2010) "Epidemiology and horizontal transmission of porcine circovirus type (PCV2)." Anim Health Res Rev 11: pp 217-234 59 45 Ramos, N., S Mirazo, G Castro and J Arbiza (2015) "First identification of Porcine Circovirus Type 2b mutant in pigs from Uruguay." Infect Genet Evol 33: 320-323 46 Rose, N., E Eveno, B Grasland, A C Nignol, A Oger, A Jestin and F Madec (2009) "Individual risk factors for Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in pigs: a hierarchical Bayesian survival analysis." Prev Vet Med 90: 168-179 47 Rose, N., T Opriessnig, B Grasland and A Jestin (2012) "Epidemiology and transmission of porcine circovirus type (PCV2)." Virus Research 164: 78-89 48 Royer, R L., P Nawagitgul, P G Halbur and P S Paul (2001) "Susceptibility of porcine circovirus type to commercial and laboratory disinfectants Journal of swine health and production." VL J 9: 281-284 49 Segales, J (2012) "Porcine circovirus type (PCV2) infections: clinical signs, pathology and laboratory diagnosis." Virus Research 164: 10-19 50 Segales, J., A Olvera, L Grau-Roma, C Charreyre, H Nauwynck, L Larsen, K Dupont, K McCullough, J Ellis, S Krakowka, A Mankertz, M Fredholm, C Fossum, S Timmusk, N Stockhofe-Zurwieden, V Beattie, D Armstrong, B Grassland, P Baekbo and G Allan (2008) "PCV-2 genotype definition and nomenclature." Vet Rec, 162: 867-868 51 Segales, J., A Urniza, A Alegre, T Bru, E Crisci, M Nofrarias, S LopezSoria, M Balasch, M Sibila, Z Xu, H J Chu, L Fraile and J Plana-Duran (2009) "A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type (PCV2) improves clinical, pathological and virological outcomes in postweaning multisystemic wasting syndrome affected farms." Vaccine 27: 7313-7321 52 Seo, H W., C Park, K Han and C Chae (2014) "Effect of porcine circovirus type (PCV2) vaccination on PCV2-viremic piglets after experimental PCV2 challenge." Vet Res., 45: 13 53 Stark, K D., J Nicolet and J Frey (1998) "Detection of Mycoplasma hyopneumoniae by air sampling with a nested PCR assay." Appl Environ Microbiol 64: 543-548 54 Takahagi, Y., Y Nishiyama, S Toki, T Yonekita, F Morimatsu and H Murakami (2008) "Genotypic change of Porcine circovirus Type on Japanese pig farms as revealed by restriction fragment length polymorphism analysis." Journal of Veterinary Medical Science 70: 603-606 60 55 Vidigal, P M., C L Mafra, F M Silva, J L Fietto, A Silva Junior and M R Almeida (2012) "Tripping over emerging pathogens around the world: a phylogeographical approach for determining the epidemiology of Porcine circovirus-2 (PCV-2), considering global trading." Virus Research 163: 320-327 56 Wang, F., X Guo, X Ge, Z Wang, Y Chen, Z Cha and H Yang (2009) "Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type " Virus Research 145: 151-156 57 Wellenberg, G J., N Stockhofe-Zurwieden, M F de Jong, W J Boersma and A R Elbers (2004) "Excessive porcine circovirus type antibody titres may trigger the development of porcine dermatitis and nephropathy syndrome: a case-control study." Vet Microbiol 99: 203-214 58 Woodbine, K A., G F Medley, J Slevin, A L Kilbride, E J Novell, M J Turner, M J Keeling and L E Green (2007) "Spatiotemporal patterns and risks of herd breakdowns in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome." Vet Rec, 160: 751-762 59 Xiao, C T., P G Halbur and T Opriessnig (2015) "Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d." J Gen Virol 96: 1830-1841 60 Xu, X G., G D Chen, Y Huang, L Ding, Z C Li, C D Chang, C Y Wang, D W Tong and H J Liu (2012) "Development of multiplex PCR for simultaneous detection of six swine DNA and RNA viruses." J Virol Methods 183: 69-74 61 Yang, J S., D S Song, S Y Kim, K S Lyoo and B K Park (2003) "Detection of porcine circovirus type in feces of pigs with or without enteric disease by polymerase chain reaction." J Vet Diagn Invest 15: 369-373 62 Yang, K., W Li, H Niu, W Yan, X Liu, Y Wang, S Cheng, X Ku and Q He (2012) "Efficacy of single dose of an inactivated porcine circovirus type (PCV2) whole-virus vaccine with oil adjuvant in piglets." Acta Vet Scand 54: 67 63 Yilmaz, A and E Kaleta (2004) "Disinfectant tests at 20 and 10 degrees C to determine the virucidal activity against circoviruses." Deutsche tierarztliche Wochenschrift 111: 248-251 64 Zhou, J Y., Q X Chen, H G Ye, T C Shen and S B Shang (2006) "Serological investigation and genomic characterization of PCV2 isalates from different geographic regions of Zhejiang province in China." Veterinary Research Communications 30: 205-220 61 ... văn: Nghiên cứu đặc tính sinh học virus gây hội chứng còi cọc lợn chủng VNUA- PCV2- HN14 Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn chủng. .. lựa chọn chủng virus phù hợp đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thực cần thiết Chúng thực đề tài ? ?nghiên cứu đặc tính sinh học virus gây hội chứng cịi cọc lợn chủng VNUA- PCV2- HN14? ?? Nghiên cứu thực... hiệu giá virus chủng giống VNUA- PCV2- HN14 - Kiểm tra chất lượng chủng giống VNUA- PCV2- HN14 - Kiểm tra độ khiết chủng giống VNUA- PCV2- HN14 - Kiểm tra tính độc chủng giống VNUA- PCV2- HN14 + Đánh