HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG VĂN TỜ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở LỢN TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM NĂM 2015 - 2016 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa đượccơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ i năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Thú y, thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thầy kính mến TS Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình bảo, ln giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo toàn thể anh chị, bạn Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam, đặc biệt anh chị phòng R&D Lab nơi tơi cơng tác tận tình hướng dẫn bảo, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian thực tập Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, bạn tập thể lớp CH24 TYC, người động viên, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu để hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ ii năm 2017 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh Mục Bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình bệnh LMLM giới việt nam 2.1.1 Thông tin chung bệnh lở mồm long móng 2.1.2 Tình hình bệnh LMLM nghiên cứu bệnh LMLM giới .3 2.1.3 Tình hình bệnh LMLM nghiên cứu bệnh LMLM Việt Nam .5 2.2 Đặc điểm sinh học virus LMLM 10 2.2.1 Căn bệnh 10 2.2.2 Sự phân bố chủng virus gây bệnh 12 2.2.3 Dịch tễ học 13 2.2.4 Triệu chứng lợn 15 2.2.5 Bệnh tích 15 2.2.6 Các phương pháp chẩn đoán 15 2.2.7 Phòng bệnh 18 2.2.8 Điều trị 18 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 iii 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 3.1.4 Thời gian nghiên cứu .22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.2.1 Chẩn đoán chủng virus LMLM sinh học phân tử .22 3.2.2 Nghiên cứu đặt tính sinh học chủng virus LMLM type O phân lập miền bắc Việt Nam 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 22 3.3.2 Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm 23 3.3.3 Phương pháp One-step RT-RCR 23 3.3.4 Phương pháp phân lập virus LMLM môi trường tế bào BHK-21 .24 3.4.5 Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào 27 3.4.6 Phương pháp giải trình tự gen 28 3.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 29 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 30 4.1 Kết chẩn đoán chủng virus lmlm sinh học phân tử 30 4.1.1 Kết thu thập mẫu 30 4.1.2 Kết RT- PCR chẩn đốn định tính virus LMLM 31 4.1.3 Kết chẩn đoán định type virus LMLM .31 4.2 Kết phân lập xác định số đặc điểm sinh học virus LMLM Type o phân lập 33 4.2.1 Kết phân lập virus xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 33 4.2.2 Kết RT-PCR kiểm tra mẫu virus LMLM type O phân lập 37 4.2.3 Kết xác định hiệu giá virus LMLM type O 38 4.2.3.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển virus tế bào 38 4.2.3.2 Thích nghi virus LMLM type O phân lập tế bào BHK-21 39 4.3 Kết giải trình tự GEN VP1 41 4.3.1 Kết phân tích trình tự gen VP1 chủng virus LMLM phân lập 43 iv 4.4 Kết xây dựng phát sinh chủng loại 51 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị .54 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 59 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microlit BHK Baby Hamster Kidney DNA Complement Deoxynucleotide Acid CPE Cytopathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FMDV Foot and Mouth Disease Virus LMLM Lở mồm long móng OIE Office International des Epizooties PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleotide Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction SN Serum Neutralizing TBE Tris Borate EDTA TCID50 50% The Tissue Culture Infectious Dose vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi dùng chẩn đoán định type virus Lở 20 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR 23 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 24 Bảng 4.1 Thông tin mẫu bệnh phẩm nghi mắc LMLM 30 Bảng 4.2 Kết chẩn đốn định tính định type virus LMLM 32 Bảng 4.3 Kết gây nhiễm mẫu virus LMLM môi trường tế bào BHK-21 34 Bảng 4.4 Kết chuẩn độ virus LMLM type O (10x TCID50/ml) 38 Bảng 4.5 Hiệu giá chủng virus LMLM type O qua đời cấy chuyển (10x TCID50/ml) 40 Bảng 4.6 Thông tin chủng virus LMLM type O tham chiếu sử dụng nghiên cứu 42 Bảng 4.7 Tỷ lệ tương đồng (%) gen VP1 chủng virus O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 45 Bảng 4.8 Tỷ lệ tương đồng (%) amino acid gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 46 Bảng 4.9 Tỷ lệ tương đồng (%) gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 49 Bảng 4.10 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự amino acid gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 51 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái cấu tạo virus Lở mồm long móng 10 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc hệ gen virus LMLM 12 Hình 4.1 Kết chẩn đốn định tính virus LMLM 15 mẫu bệnh phẩm phản ứng RT-PCR 31 Hình 4.2 Kết định type virus LMLM phản ứng RT-PCR 32 Hình 4.3 Kết theo dõi gây nhiễm chủng LMLM tế bào BHK-21 36 Hình 4.4 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập .37 Hình 4.5 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập với mồi định type A LMLM 37 Hình 4.6 Kết RT-PCR kiểm tra chủng virus LMLM phân lập với mồi định type Asia1 LMLM 38 Hình 4.7 Đường cong sinh trưởng chủng virus LMLM theo thời gian 39 Hình 4.8 Log10 Hiệu giá chủng virus LMLM type O qua đời cấy chuyển 41 Hình 4.9 Mức độ tương đồng nucleotide chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 44 Hình 4.10 Mức độ tương đồng amino acid gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam 45 Hình 4.11 Mức độ tương đồng nucleotide chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 48 Hình 4.12 Mức độ tương đồng amino acid chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam 50 Hình 4.13 Cây phát sinh chủng loại chủng virus LMLM type O phân lập Việt Nam 52 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hồng Văn Tờ Tên luận văn: “Một số đặc tính sinh học virus lở mồm long móng type O phân lập lợn miền bắc Việt Nam năm 2015 - 2016” Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Các chủng virus LMLM type O phân lập nguồn vi sinh vật quan trọng phục vụ nghiên cứu khác nghiên cứu bảo tồn quỹ gen, nghiên cứu sản xuất vắc xin, nghiên cứu tạo kit chẩn đốn… Cung cấp thơng tin hữu ích chủng virus LMLM type O lợn lưu hành Việt Nam làm sở để lựa chọn vắc xin phịng bệnh thích hợp việc định hướng sản xuất vắc xin tương lai Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu thập xử lý mẫu bệnh phẩm; Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm; Phương pháp One-step RT-RCR; Phương pháp phân lập virus LMLM môi trường tế bào BHK-21; Phương pháp xác định hiệu giá virus môi trường tế bào; Phương pháp giải trình tự gen; Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận - Kết chẩn đốn cho thấy có 9/15 mẫu bệnh phẩm thu thập cho kết dương tính với virus LMLM, kết định type cho thấy 9/9 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus Lở mồm long móng type O - Kết phân lập virus môi trường tế bào BHK-21 thu chủng virus LMLM, chủng virus phân lập gây bệnh tích tế bào BHK- 21: Kết gây nhiễm virus môi trường tế bào cho thấy 80-90% tế bào bị phá hủy sau 48h gây nhiễm virus - Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng virus cho thấy chủng virus LMLM phân lập phát triển nhanh sau từ 12 đến 48 giờ, sau 48 gây ix Qua hình 4.10 cho thấy, chủng LMLM O/VN/HD/2016 nghiên cứu sai khác so với chủng virus LMLM type O topotype Cathay lưu hành Việt Nam trước 14 – 29 vị trí, đặc biệt vị trí từ 130 – 160 có nhiều thay đổi vị trí amino acid Kết phân tích tỷ lệ phần trăm (%) tương đồng trình tự amino acid suy diễn (deduced amino acid) gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 nghiên cứu với chủng tham chiếu trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Tỷ lệ tương đồng (%) amino acid gen VP1 chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác Việt Nam STT Tên chủng O/VN/HD/2016 ID O/VIT/1/2008 90.6% ID O/VIT/9/2008 89.2% 96.7% ID O/VIT/1/2006 90.6% 100.0% O/VIT/2/2006 90.6% 100.0% O/VIT/3/2006 90.6% 100.0% O/VIT/1/2005 91.0% 98.1% O/VIT/9/2005 86.3% 93.8% O/VIT/11/2005 89.2% 90.6% 10 O/VIT/12/2005 88.7% 91.0% 11 O/VIT/2/2004 92.0% 93.4% 12 O/VIT/3/2004 91.0% 92.4% 13 O/VIT/13/2002 93.4% 95.3% 14 O/VIT/3/97 91.5% 96.2% 96.7% ID 96.7% 100.0% ID 96.7% 100.0% 100.0% ID 95.7% 98.1% 98.1% 91.5% 93.8% 93.8% 88.2% 90.6% 90.6% 87.7% 91.0% 91.0% 91.5% 93.4% 93.4% 90.6% 92.4% 92.4% 92.9% 95.3% 95.3% 94.8% 96.2% 96.2% 98.1% ID 93.8% 90.6% 91.0% 93.4% 92.4% 95.3% 96.2% 94.3% ID 91.0% 90.6% 93.8% 92.9% 95.7% 96.7% 86.3% ID 85.9% 89.2% 88.2% 91.0% 92.0% 96.2% ID 95.7% 97.1% 93.8% 92.4% 10 11 12 13 94.8% ID 95.7% 98.5% ID 93.4% 96.7% 95.7% ID 92.0% 94.3% 93.4% 96.2% ID Qua bảng 4.8 cho thấy, mức độ tương đồng di truyền trình tự amino acid chủng LMLM type O topotype Cathay phân lập nghiên cứu so với chủng lưu hành VN trước giao động khoảng 86,3 – 93,4% 46 14 4.3.1.2 Kết phân tích trình tự gen VP1 chủng virus LMLM type O, topotype SEA 10 20 30 40 50 60 70 80 | | | | | | | | | | | | | | | | O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 A C CA C T T C GGC GGGT GAA T G .AG A G G .A C G .A C G .A C G .A C G .A C G .A AC G A C G .A C G .A C G CA G C T GA C C C C G T GA C C G C T A C C G T T GA GA A C T A C G G T G G T GA GA CA CA G G T C CA GA G G C G C C C C C C C C C C C C C C C C C C O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 T CA C CA CA CA GA C G T C T C A T T CA T A T T G GA CA GA T T T G T GA A A G T T A C A C CA A A A GA C CA A A T T A A T G T T T T G GA C C T GA T C C T C C C T C C C T C C G T C C C T C C C T C C T C C C T C C C O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 T G CA GA C C C C C T C C C A C A C T C T G G T G G GA G C G C T C C T T C G T A C T G C C A C T C C C C C C C C C O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 A A A CA C GA G G G G GA T C T C A C C T G G G T G C CA A A T G GA G CA C C T GA GA C A G C C T T G GA A A A CA C CA C CA A C C CA A C G G C G T A A A A A G GT T A A G GT T A A C GT T G A A G G GT T A A G GT T A A G GT T A A G GT T A A G GT T A A G GT T A 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | 170 180 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | | | | | T A C T A C T T C G C T GA T T T A GA A G T G G C A G T G T C G T C T T C G T C G T C G T C G T C G T C G T C G 250 260 270 280 290 300 310 320 | | | | | | | | | | | | | | | | 47 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 CCA CAAA GC GC CA C T O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 GCAA GTA CGCT A T A A A A A A A T A O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 ACTT C C C C C C C C C C C C O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 CCCAC GGCCT G G G G G G G G G TACT C C C C C C C C C C C C CGGCT T GCA C T T T T T T T T T T GCCT T A CA C GGCA C CA CA C C GT GT T CT GGCTA CCGT T T A CAA C G GGA A C T 410 420 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | | | | | GA G GG T G G G G G G G G G T CAC T C C C C C C C C C C GA C CAA C G T GA GA GG C GA T T CT C CA GGT GC T T GGCT A C A GA A G G C G G C GA GA C C G C T G G G G G G G G G GC C T 490 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | | | CCT T CAA C T T A A A A A A A A A A A A T GGT GCCA T CAAA GC CA C C C GGGT T T T GA C A GA G C T A A A A A A A A A CCT G G G G G G G G G G G G GTA C C GCA T T GAA GA G GG C C GA GA CA T A C T G T TG T G T G T G T G T G T G T G T G 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | | CT T T T T GGCC GT C C A C C C G GA T CA A G C T A GA CA CA AA CA GAA AA T T T T T G T GT GGCACCT GT GAA GCA A T G G G A G A G A G A G A G A G A G A G A G CTT C C C C C C C C C GG Hình 4.11 Mức độ tương đồng nucleotide chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam Qua hình 4.11 thấy chủng virus LMLM type O, topotype SEA phân lập nghiên cứu có vị trí sai khác Khi so sánh chủng với chủng tham chiếu khác Việt Nam năm 2014 có – 13 vị trí sai khác, năm 2010 có 34 – 38 vị trí sai khác, năm 2009 có 34 – 37 vị trí sai khác 48 Bảng 4.9 Tỷ lệ tương đồng (%) gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam STT Tên chủng 1 O/VN/BG1/2016 ID O/VN/BN/2016 99.8% ID O/VN/BG2/2016 100.0% O/VN/HN3/2014 98.4% O/VN/HN5/2014 98.1% O/VN/HN6/2014 98.5% O/VN/SL02/2010 94.5% O/VN/LC03/2010 94.3% O/VN/TQ06/2010 94.0% 10 O/VN/DB04/2010 94.0% 11 O/VN/YB105/2009 94.5% 12 O/VN/HB138/2009 94.3% 13 O/VN/HG128/2009 94.5% 14 O/VN/QN133/2009 94.5% 15 O/VN/QN132/2009 94.2% 99.8% ID 98.2% 97.9% 98.4% 94.6% 94.5% 94.2% 94.2% 94.6% 94.5% 94.6% 94.6% 94.3% 98.4% ID 98.1% 98.5% 94.5% 94.3% 94.0% 94.0% 94.5% 94.3% 94.5% 94.5% 94.2% 99.3% ID 99.8% 95.1% 94.9% 94.6% 94.6% 95.1% 94.9% 95.1% 95.1% 94.8% 99.5% ID 95.1% 94.9% 94.6% 94.6% 95.1% 94.9% 95.1% 95.1% 94.8% 95.3% ID 95.1% 94.8% 94.8% 95.3% 95.1% 95.3% 95.3% 94.9% 99.2% ID 98.9% 99.2% 99.6% 99.5% 99.6% 99.6% 99.3% 98.7% ID 98.7% 99.5% 99.3% 99.2% 99.5% 99.2% 98.4% ID 99.2% 99.0% 98.9% 99.2% 98.9% 10 11 12 13 14 15 99.2% ID 99.0% 99.8% ID 99.2% 99.6% 99.5% ID 99.2% 100.0% 99.8% 99.6% ID 98.9% 99.6% 99.5% 99.3% 99.6% ID Qua bảng 4.9 cho thấy mức độ tương đồng di truyền trình tự gen VP1 chủng nghiên cứu giao động khoảng 99,8 – 100%, mức độ tương đồng di truyền trình tự gen VP1 chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu lưu hành năm 2014 giao động trọng khoảng 97,9 – 98,5% Mức độ tương đồng di truyền chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu lưu hành giai đoạn 2009 – 2010 giao động khoảng 94,0 – 94,6% 49 10 20 30 40 50 60 70 80 | | | | | | | | | | | | | | | | O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 TT SA G E SA D P VT A T V ENYGG ET QVQRR HHT DV S RS T T T T T TD .T T T O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 KH E GD L TWV P NGA O/VN/BG1/2016 O/VN/BN/2016 O/VN/BG2/2016 O/VN/HN3/2014 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN6/2014 O/VN/SL02/2010 O/VN/LC03/2010 O/VN/TQ06/2010 O/VN/DB04/2010 O/VN/YB105/2009 O/VN/HB138/2009 O/VN/HG128/2009 O/VN/QN133/2009 O/VN/QN132/2009 T F I LDR F VKVT P KDQ Q .Q .Q QG Q .Q .Q .Q .Q I N V L D LM Q T P S HT P P P P P P P P P L V GA L L R T A T Y Y F A D L E VA V 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | P ETA A A A A A A A A L E NT T N P T A YHKA G .G .G.A G .G .G .G .G .G P LTR LA L P YTA P H R V LA T V Y N G N C K YA E G S P G P F G P G P G P G P G P G P G P G P L T N VR G D L Q V LA Q KA A R T P LP 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | S F N F GA Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y .Y I KA T R V T E L L Y RM K R A ET YC P R M P L LA V H P D QA R H K Q K F S S S I VA P V K Q SW Hình 4.12 Mức độ tương đồng amino acid chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam Qua hình 4.12 cho thấy sai khác chủng virus nghiên cứu với chủng LMLM type O topotype SEA tham chiếu lưu hành Việt Nam thời gian trước – 10 vị trí 50 Bảng 4.10 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự amino acid gen VP1 chủng virus LMLM type O topotype SEA nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác Việt Nam STT Tên chủng 10 11 12 13 14 15 O/VN/BG1/2016 ID O/VN/BN/2016 99.5% ID O/VN/BG2/2016 100.0% 99.5% ID O/VN/HN3/2014 98.5% 98.1% 98.5% ID O/VN/HN5/2014 98.1% 97.6% 98.1% 98.5% ID O/VN/HN6/2014 99.0% 98.5% 99.0% 99.5% 99.0% ID O/VN/SL02/2010 96.2% 96.7% 96.2% 95.7% 95.7% 96.2% ID O/VN/LC03/2010 95.3% 95.7% 95.3% 94.8% 94.8% 95.3% 99.0% ID O/VN/TQ06/2010 96.2% 96.7% 96.2% 95.7% 95.7% 96.2% 99.0% 98.1% ID 10 O/VN/DB04/2010 95.7% 96.2% 95.7% 95.3% 95.3% 95.7% 99.5% 98.5% 98.5% ID 11 O/VN/YB105/2009 96.2% 96.7% 96.2% 95.7% 95.7% 96.2% 100.0% 99.0% 99.0% 99.5% ID 12 O/VN/HB138/2009 95.7% 96.2% 95.7% 95.3% 95.7% 95.7% 99.5% 98.5% 98.5% 99.0% 99.5% ID 13 O/VN/HG128/2009 96.2% 96.7% 96.2% 95.7% 95.7% 96.2% 100.0% 99.0% 99.0% 99.5% 100.0% 99.5% ID 14 O/VN/QN133/2009 96.2% 96.7% 96.2% 95.7% 95.7% 96.2% 100.0% 99.0% 99.0% 99.5% 100.0% 99.5% 100.0% ID 15 O/VN/QN132/2009 95.7% 96.2% 95.7% 95.3% 95.3% 95.7% 99.5% 98.5% 98.5% 99.0% 99.5% 99.0% 99.5% 99.5% ID Mức độ tương đồng di truyền trình tự aa chủng nghiên cứu giao động khoảng 99,5 – 100% Mức độ tương đồng trình tự di truyền chủng nghiên cứu chủng tham chiếu khác giao động khoảng 95,3 – 96,7% 4.4 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI Qua việc so sánh mức độ tương đồng nucleotide axit amin chủng virus LMLM type O phân lập nghiên cứu với chủng tham chiếu, tiến hành xây dựng sinh học phân tử để xác định nguồn gốc phát sinh virus LMLM type O Kết nghiên cứu trình bày hình 4.13 51 O/HKN/16/96 AJ294923 93 TauYuanTW97 AF154271 93 O/VIT/3/97 AJ294930 99 O/VIT/13/2002 DQ165025 92 O/VIT/2/2004 DQ165033 89 99 Cathay O/VIT/3/2004 DQ165034 100 O/VN/HD/2016 GD/China/86 AJ131468 ISA/1/62 AJ303500 ISA/9/74 AJ303502 100 78 ISA/1/74 AJ303501 100 JAV/5/72 AJ303509 O2Bres cia/1947 M55287 97 Germany/Kaufbeuren/1966 X00871 GHA/5/93 AJ303488 100 ALG/1/99 AJ303481 68 KEN/83/79 AJ303511 100 ISA1 ISA/8/83 AJ303503 KEN/2/95 (K10/95) AJ303514 ISA2 Euro-SA WA EA TAW /2/99 BOV AJ539137 96 O/MAY/2/2000 AJ318846 99 O/LAO/3/2003 VP1 DQ164908 64 O/LAO/17/2003 DQ164912 10 100 O/LAO/20/2003 EU667449 ME-SA VIT/9/2014 100 VIT/11/2014 O/VIT/431/2013 99 O/VIT/429/2013 79 Urdzhaz/12/2011 JQ765582 100 Kurchum/08/2011 JQ765581 O/CA M/2/98 AJ294909 O/MAY/1/2002 DQ164923 10 88 100 O/LAO/4/98 DQ164906 TAI/4/99 AJ303536 O/MAY/3/2001 DQ164920 64 O/MAY/5/2001 DQ164921 o/VN/BG1/2016 77 O/VN/BG2/2016 98 85 O/VN/BN/2016 99 O/VN/HN5/2014 O/VN/HN3/2014 95 O/VN/HN6/2014 97 SEA O/VN/QB88/2009 GU582115 65 100 O/VN/SL02/2010 HQ260714 O/VN/SL01/2010 HQ260713 O/VN/DB04/2010 VP1 HQ260716 O/VN/HG128/2009 GU582119 O/VN/LC03/2010 HQ260715 O/VN/QN133/2009 GU582121 O/VN/YB105/2009 GU582116 O/VN/HB138/2009 GU582122 O/VN/QN132/2009 GU582120 O/VN/YB106/2009 GU582117 O/VN/TQ06/2010 HQ260717 A/LAO/36/2003 EU667455 0.05 Hình 4.13 Cây phát sinh chủng loại chủng virus LMLM type O phân lập Việt Nam 52 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Kết chẩn đoán cho thấy có 9/15 mẫu bệnh phẩm thu thập cho kết dương tính với virus LMLM, kết định type cho thấy 9/9 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus Lở mồm long móng type O - Đã phân lập thành công chủng virus LMLM type O - Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng virus cho thấy chủng virus LMLM phân lập phát triển nhanh sau 12 đến 48 gây nhiễm, Từ 48 virus phát triển pha cân có xu hướng xuống sau 72 gây nhiễm - Kết giải trình tự gen VP1 cho thấy chủng virus LMLM type O nghiên cứu thuộc topotype khác Cathay SEA - Kết phân tích so sánh trình tự nucleotide amino acid chủng virus LMLM type O topotype Cathay phân lập nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác lưu hành Việt Nam trước cho thấy: + Mức độ tương đồng trình tự nucleotide giao động khoảng 81,8 – 86,6% + Mức độ tương đồng trình tự amino acid giao động khoảng 86,3 – 93,4% - Tương tự, kết phân tích so sánh trình tự nucleotide amino acid chủng virus LMLM type O topotype SEA phân lập nghiên cứu với chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác lưu hành Việt Nam trước cho thấy: + Mức độ tương đồng trình tự nucleotide chủng nghiên cứu với chủng lưu hành năm 2014 giao động trọng khoảng 97,9 – 98,5%; so với chủng lưu hành giai đoạn 2009 – 2010 giao động khoảng 94,0 – 94,6% + Mức độ tương đồng trình tự amino acid giao động khoảng 95,3 – 96,7% 53 5.2 KIẾN NGHỊ Do virus LMLM có tính biến chủng cao nên cần có nghiên cứu liên tục đặc điểm sinh học sinh học phân tử chủng virus LMLM lưu hành ngồi thực địa, từ lựa chọn chủng virus LMLM thích hợp dùng làm vắc xin phịng bệnh LMLM, nhằm giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi cho ngành chăn nuôi Việt Nam 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2010) Báo cáo kết thực tháng 12 năm 2010 ngành Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, ngày 24 tháng 12 năm 2010 http://www.mard.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/Attachments/36/Baocao_12%20_2010 _fc.pdf Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2013) Công điện khẩn việc triển khai biện pháp phòng chống dịch Lở mồm long móng gia súc Bộ Nơng nghiệp phát triển nông thôn, Số: 16/CĐ-BNN-TY, ngày 01 tháng 11 năm 2013 http://thuvienphapluat.vn/van-ban/The-thao-Y-te/Cong-dien-16-CD-BNN-TYnam-2013-trien-khai-chong-dich-lo-mom-long-mong-gia-suc-212164.aspx Cục Thú y (2011) Báo cáo tổng kết hội nghị tổng kết cơng tác phịng chống dịch lở mồm long móng, ngày 24/6/2011 http://www.mard.gov.vn Cục Thú y (2013) Hội nghị tổng kết công tác năm 2013 triển khai kế hoạch năm 2014- Cục Thú y ngày 20/12/2013 http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=280# Cục Thú y (2014) Hội nghị tổng kết công tác năm 2013 triển khai kế hoạch năm 2014- Cục Thú y, ngày 20/12/2013 http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=280# Donalsson A.I (2000) Bệnh lý học dịch tễ học bệnh lở mồm long móng (tài liệu Lê Minh Hà dịch), Tạp chí KHKT Thú y, số 7, tr 43-47 Đào Trọng Đạt (2000) Góp phần vào việc đấu tranh phịng chống bệnh Lở mồm long móng Tạp chí KHKT thú y số (tập VII) Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Bá Hiên, Lê Văn Lãnh Đỗ Ngọc Thúy (2011) Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y NXB Nơng Nghiệp Kiều Mạnh Hùng (2012) Nghiên cứu chế tạo kit RT-PCR để chuẩn đốn virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện lưu hành Việt Nam 10 Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013) Bệnh Lở mồm long móng, Bệnh truyền nhiễm động vật biện pháp khống chế NXB Nông Nghiệp tr 114-122 11 Nguyễn Như Thanh (1974) Thực tập vi sinh vật Thú Y tr 193-197 55 12 Nguyễn Tiến Dũng (2000) Bệnh lở mồm long móng Tạp chí khoa học thú y Số tr 22-23 13 Tô Long Thành, Nguyễn Thị Nguyệt, Lê Văn Phan Trương Văn Dung (2005) Phân lập virus LMLM từ ổ dịch tỉnh Quảng Trị Tạp chí KHKT Thú y (11) tr 15-21 14 Phan Đình Đỗ Trần Văn Thịnh ( 1958) Những Bệnh thường có Việt Nam Bệnh truyền nhiễm gia súc NXB Nông thôn, Hà Nội 15 Tô Long Thành (2000a) Những tiến sản xuất vacxin chống bệnh LMLM, Tạp chí khoa học thú y VII (3) tr 22-27 16 Tô Long Thành (2000b) Cơ sở để phân loại virus Lở mồm long móng Tạp chí khoa học thú y VII (3), tr 17-21 17 Văn Ðăng Kỳ Nguyễn Văn Thơng (2011) Một số kết phịng chống bệnh lở mồm long móng giới Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y (7) tr 83-88 Tiếng Anh: 18 Alexandersen S., Zhang, Z., Donaldson, A and Garland A (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease Journal of comparative pathology Vol 1(129) pp 1-36 19 Belsham GJ (2005) Translation and replication of FMDV RNA, in Foot-andMouth Disease VirusSpringer pp 43-70 20 Brown C (2001) Update foot and mouth disease in swine Journal of swine heath and production pp 239-242 21 Carrillo C., ER Tulman, G Delhon, Z Lu, A Carreno, A Vagnozzi, GF Kutish and DL Rock (2005) Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus Journal of Virology Vol 79(10) pp 6487-6504 22 Cavanagh D, DV Sangar, DJ Rowlands and F Brown (1977) Immunogenic and cell attachment sites of FMDV: further evidence for their location in a single capsid polypeptide, Journal of General Virology Vol 35(1) pp 149-158 23 Cristina Escarmís, Miguel Toja, Miguel Medina and Esteban Domingo (1992) Modifications of the 5'untranslated region of foot-and-mouth disease virus after prolonged persistence in cell culture, Virus research Vol 26(2) pp 113-125 24 Doel TR (2003) FMD vaccines Virus research Vol 91(1) pp 81-99 25 Forss S, K Strebel, E Beck and H Schaller (1984) Nucleotide sequence and genome organization of foot-and-mouth disease virus Nucleic Acids Research Vol 12(16) pp 6587-6601 56 26 Gleeson LJ (2002) A review of the status of foot and mouth disease in South-East Asia and approaches to control and eradication Revue scientifique et techniqueOffice international des épizooties Vol 21(3) pp 465-472 27 Grubman MJ (1980) The 5′ end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp, Archives of virology Vol 63(34) pp 311-315 28 Harris TJR and F Brown (1976) The location of the poly (C) tract in the RNA of foot-and-mouth disease virus Journal of General Virology Vol 33(3) pp 493-501 29 Knowles Z., Gilbourne,D.,Borie, A and Neville, A (2001) Developing the refective sports coach: A study exploring the processes of reflection within a higher education coaching programe Reflective Practice Vol (2) pp 185 – 207 30 Knowles Nick J, Alan R Samuel, Paul R Davies, Rebecca J Midgley and JeanFranỗois Valarcher (2005) Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O, Emerg Infect Dis Vol 11(12) pp 1887-1893 31 Le Van Phan, Nguyen Tung, Lee Kwang-Nyeong, Ko Young-Joon, Lee HyangSim, Nguyen Van Cam, Mai Thuy Duong, Do Thi Hoa, Kim Su-Mi and Cho InSoo (2010) Molecular characterization of serotype A foot-and-mouth disease viruses circulating in Vietnam in 2009 Veterinary microbiology Vol 144(1) pp 58-66 32 Martínez-Salas Encarnacíon, Juan Ortín, Esteban Domingo (1985) Sequence of the viral replicase gene from foot-and-mouth disease virus C 1-Santa Pau (CS8), Gene, Vol 35(1).pp 55-61 33 Pfaff E, HJ Thiel, E Beck, K Strohmaier and H Schaller (1988) Analysis of neutralizing epitopes on foot-and-mouth disease virus, Journal of Virology Vol 62(6) pp 2033-2040 34 Pattnaik, B., Schumann, K.R, Beckham, T.R., Linchongsubongkoch, W., Ferris, N.P., Roeder, P.L., Paton and D.J (1987) Multiple origins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia outbreak, 2003-2007 Emerging Infect 35 Peter W Mason, Marvin J Grubman and Barry Baxt (2003) Molecular basis of pathogenesis of FMDV, Virus research Vol 91(1) pp 9-32 36 Saunders K, AM King, D McCahon, JW Newman, WR Slade and S Forss (1985) Recombination and oligonucleotide analysis of guanidine-resistant foot-andmouth disease virus mutants Journal of Virology Vol 56(3).pp 921-929 57 37 Sobrino F., Margarita Sáiz, Miguel A Jiménez-Clavero, Jose I Núđez, María F Rosas, Eric Baranowski and Victoria Ley (2001) Foot-and-mouth disease virus: a long known virus, but a current threat, Veterinary research Vol 32(1).pp 1-30 38 Sobrino F and Esteban Domingo (2001) Foot and mouth disease in Europe Eurropean Molecular Biology Organization 39 Tung Nguyen, Kwang-Nyeong Lee, Young-Joon Ko, Hyang-Sim Lee, Van Cam 40 Nguyen, Thuy Duong Mai, Thi Hoa Do, Su-Mi Kim, In-Soo Cho and Jong-Hyeon Park (2010) Molecular characterization of serotype A foot-and-mouth disease viruses circulating in Vietnam in 2009 Veterinary microbiology Vol 144(1) pp 58-66 41 V P Le, T Nguyen, J H Park, S M Kim, Y J Ko, H S Lee, V C Nguyen, T D Mai, T H Do, I S Cho and K N Lee (2010) Heterogeneity and genetic variations of serotypes O and Asia foot-and-mouth disease viruses isolated in Vietnam Vet Microbiol Vol 145(3-4).pp 220-9 42 Van Nam Hoang (2009) 15th Meeting of the OIE Sub-Commission for Foot and Mouth Disease in South-East Asia Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia, 9-13 March 2009 43 Valarcher J.F., Knowles N.J., Zakharov, V., Scherbakov, A., Zhang, Z., Shang, Y.J., Liu, Z.X., Liu, X.T., Sanyal, A., Hemadri, D., Tosh, C., Rasool, T.J., 37 Jean- Valarcher, Nick J Knowles, Valery Zakharov, Alexey Scherbakov, Zhidong Zhang, You-Jun Shang, Zai-Xin Liu, Xiang-Tao Liu, Aniket Sanyal and Divakar Hemadri (2009) Multiple origins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia outbreaks, 2003–2007 Emerging infectious diseases Vol 15(7) pp 1046 44 Vincent R Racaniello (2001) Picornaviridae: the viruses and their replication, Fields 58 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CỦA ĐỀ TÀI 59 ... học virus lở mồm long móng type O phân lập lợn miền bắc Việt Nam năm 2015 - 2016? ?? Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đ? ?o t? ?o: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Các chủng virus. .. hiệu Việt Nam Xuất phát từ thực tế này, thực đề tài: ? ?Một số đặc tính sinh học virus lở mồm long móng type O phân lập lợn miền bắc Việt Nam năm 2015 - 2016? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Các chủng virus. .. Tên chủng virus O/ VN/BN /2016 O/ VN/BG1 /2016 O/ VN/HD /2016 O/ VN/BG2 /2016 4.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS LMLM TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC 4.2.1 Kết phân lập virus xác