TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN TUẤN THÀNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CRYSTIAL VIOLET & LEUCO CRYSTAL VIOLET TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2010 i TÓM TẮT Trong tình hình nay, xuất thủy sản nước ta phải đối mặt với vấn đề khó khăn lớn, vấn đề dịch bệnh dư lượng hóa chất, kháng sinh thủy sản Dư lượng hóa chất, kháng sinh cịn tồn đọng thủy sản có hại sức khỏe người kinh tế nước nhà,trong có Crystal Violet & Leuco Crystal Violet Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) sử dụng để “Xác định hàm lượng Crystial Violet & Leuco Crystal Violet sản phẩm thủy sản” có ưu điểm độ nhạy cao, xử lý mẫu đơn giản, cho kết nhanh chóng đặc biệt đầu tư thiết bị tương đối rẻ tiền Vì vậy, việc “Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet sản phẩm thủy sản phương pháp miễn dịch” thực nhằm mục đích xác định giá trị sử dụng phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal Violet & Leuco Crystal Violet sản phẩm thủy sản phương pháp miễn dịch” mẫu cá tra theo tiêu chí quy định Quyết định 657/2002/EC Liên Minh Châu Âu Đề tài bao gồm phần sau: Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc phương pháp Ruggedness: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình phân tích Xác định giới hạn phát CCbeta Xác định độ lặp lại độ tái lặp Các kết thu trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp đáp ứng yêu cầu phương pháp sàng lọc, định lượng theo Quyết định 657/2002-EC Do đó, phương pháp thích hợp để sử dụng làm phương pháp sàng lọc phòng kiểm nghiệm Tuy nhiên, phương pháp cho kết dương tính cần kiểm tra khẳng định lại phương pháp sắc ký ii LỜI CẢM TẠ Để hồn thành tốt luận văn có kết ngày hôm Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản, q thầy Bộ mơn Dinh Dưỡng Chế Biến Thủy Sản tạo điều kiện giúp em hồn thành tốt luận văn q thầy cô trường Đại học Cần Thơ trang bị kiến thức vô quý giá suốt trình học tập trường Xin gửi lịng biết ơn sâu sắc nhất, chân thành đến chị Huỳnh Thị Ngọc Liên trưởng phịng kiểm hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng (NAFIQAD 6) tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn cách tốt Bên cạnh đó, em chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nơng Lâm Thủy Sản vùng (NAFIQAD 6), anh Hồ, anh chị khác phịng kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng tận tình giúp đỡ em suốt trình thực tập quan Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân ln động viên, giúp đỡ em suốt thời gian thực luận văn Cần Thơ, tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực Nguyễn Tuấn Thành iii MỤC LỤC TÓM TẮT i LỜI CẢM TẠ iii MỤC LỤC .iv DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii Phần GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Thời gian thực hiện: Phần TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu đối tượng thủy sản làm nghiên cứu (cá tra) 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm 2.1.3 Tình hình ni cá Tra ĐBSCL 2.1.4 Tình hình sử dụng hóa chất kháng sinh ao nuôi cá Tra 2.2 Giới thiệu Crystial violet .5 2.2.1 Sơ lược Crystial violet 2.2.2 Các ứng dụng Crystal violet 2.2.3 Tác hại Crystal violet 2.2.4 Tình hình sử dụng Crystal violet 2.2.5 Chất thay Crystal violet .8 2.3 Giới thiệu phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) .8 2.3.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển 2.3.2 ELISA gì? .9 2.3.3 Phân loại 10 2.3.4 Ứng dụng 11 2.3.5 Ưu khuyết điểm .11 2.3.5.1 Ưu điểm 11 2.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích (định lượng, có tính sàng lọc cho hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng) 11 2.4.1 Giải thích thuật ngữ 11 2.4.2 Các thông số đánh giá .12 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 3.1 Địa điểm thực để tài .14 3.2 Phạm vi nghiên cứu .14 3.3 Vật liệu 14 3.3.1 Mẫu thí nghiệm 14 3.3.2 Hóa chất sử dụng 14 3.3.3 Thiết bị - dụng cụ .15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Nguyên tắc phương pháp 16 iv 3.4.2 Tính đặc hiệu kit thử sử dụng .17 3.4.3 Phương pháp phân tích mẫu 17 3.4.4 Chuẩn bị hóa chất chất chuẩn 18 3.4.5 Chuẩn bị mẫu 19 3.4.6 Tiến hành phát tổng CV/LCV kĩ thuật miễn dịch dùng enzyme liên kết 20 3.4.7 Đọc kết 21 3.5 Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng phương pháp .21 3.5.1 Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc phương pháp .21 3.5.2 Ruggedness (Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình phân tích): 21 3.5.3 Xác định giới hạn phát CCβ 22 3.5.4 Xác định độ lặp lại độ tái lặp 22 3.6 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 22 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .26 4.1 Độ đặc hiệu : 26 4.2 Khảo sát độ tuyến tính đường chuẩn, khoảng làm việc kit thử 26 4.3 Ruggedness: (Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình phân tích): 28 4.4 Xác định giới hạn phát CCβ 28 4.4.1 Khảo sát độ nhiễu của mẫu cá tra, xác định CCα CCβ 28 4.4.2 Thẩm tra sai số β: 29 4.5 Xác định độ lặp lại độ tái lặp 30 4.6 Tổng hợp kết xác nhận giá trị sử dụng phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet Leuco Crystal violet sản phẩm thủy sản phương pháp miễn dịch” 32 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 PHỤ LỤC 35 PHỤ LỤC 2: Hình ảnh số thiết bị dùng trình thực đề tài 36 PHỤ LỤC 37 v DANH SÁCH BẢNG Bảng.4.1: Bảng hệ số hồi quy tuyến tính đuờng chuẩn 27 Bảng 4.2 : Kết khảo sát ảnh hưởng pH dung dịch đệm trích C 28 Bảng 4.3 : Kết khảo sát độ nhiễu của mẫu cá tra, xác định CCα CCβ 29 Bảng 4.4: Kết khảo sát giá trị CCbeta thực tế 30 Bảng 4.5: Kết khảo sát giá trị độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn nội phòng (SDW/L) 31 Bảng 4.6: Tổng hợp kết 32 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1:Biểu đồ diễn biến diện tích sản lượng cá tra vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-7T/2008 quy hoạch đến năm 2020 (nguồn Dương Công Chinh, Đồng An Thụy,2009-TT Nghiên cứu Môi trường & XLN-Viện Khoa học Thủy lợi miền Nam) .4 Hình 2.2 Công thức cấu tạo CV Hình 2.3: Cơng thức cấu tạo LCV .6 Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn với nồng độ thêm vào µg/kg 27 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CV: Crystal Violet LCV: Leuco Crystal Violet MG: Malachit Green LMG: Leuco Malachit Green ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ACN: acetonitril DCM: dichloromethane viii Phần GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đất nước Việt Nam có lợi có bờ biển dài với nhiều cửa sông, đảo lớn nhỏ, nhiều eo biển, hồ, đầm lầy, kênh gạch Hơn nữa, Việt Nam nằm khu vực sinh thái nhiệt đới có diện tích mặt nước lớn nên nguồn lợi thuỷ sản phong phú đa dạng Ngành thuỷ sản nước ta nói chung xuất thuỷ sản nói riêng đạt nhiều thành tựu đáng kể, trở thành ngành xuất chủ lực đất nước Trong đó, mặt hàng cá tra, cá ba sa chiếm tỷ trọng lớn tổng lượng hàng thủy sản xuất Tuy nhiên, việc tăng trưởng cách nhanh chóng vùng ni trồng thủy sản không theo quy hoạch quy định thực hành nuôi tốt (GAP) việc nuôi mật độ cao để gia tăng sản lượng dẫn đến môi trường nước bị ô nhiễm, dịch bệnh xảy Khi đó, vấn đề thuốc hố chất để phòng trị bệnh trở nên cần thiết quan trọng Bên cạnh thuận lợi trị phòng chống dịch bệnh, dư lượng hóa chất, kháng sinh cịn tồn lưu sản phẩm thuỷ sản có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng Hiện xuất thuỷ sản nước ta gặp nhiều khó khăn rào cản kinh tế từ thị trường nhập Châu Âu (EU), Mỹ, Bắc Mỹ, Úc… vấn đề dịch bệnh tồn lưu dư luợng hóa chất - kháng sinh thuỷ sản sản phẩm thuỷ sản…Sự kiện số lớn container sản phẩm thuỷ sản xuất từ Việt Nam bị từ chối thị trường Châu Âu, Mỹ, Canada, thời gian qua phát có dư lượng hóa chất, kháng sinh gây ảnh hưởng không nhỏ cho ngành xuất thủy sản đời sống người dân lao động nước ta Crystial violet (CV) Leuco crystal violet (LCV) hai hóa chất nhiều loại hóa chất, kháng sinh bị nước nhập Liên minh Châu Âu Canada phát có sản phẩm cá tra/cá basa vượt mức giới hạn cho phép Theo quy định thị trường EU, Mỹ Bắc Mỹ hai hoạt chất khơng phép có sản phẩm thủy sản Hai hoạt chất nằm Danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dung sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 15/2009/TT-BNN , ngày 17 tháng năm 2009 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Tuy nhiên, Crystial violet & Leuco crystal violet lạm dụng sở sản xuất giống nuôi thủy sản (đặc biệt sở sản xuất giống cá tra) Vấn đề đặt phải xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet sản phẩm thủy sản ni, đặc biệt kiểm sốt nguồn nguyên liệu nhà máy chế biến thủy sản cách nhanh chóng hiệu Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng enzym liên kết (ELISA) sử dụng để Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet sản phẩm thủy sản có ưu điểm độ nhạy cao, xử lý mẫu đơn giản, cho kết nhanh chóng đặc biệt đầu tư thiết bị tương đối rẻ tiền Trên sở đó, đề tài “Xác định hàm lượng Crystial violet & Leuco crystal violet sản phẩm thủy sản phương pháp miễn dịch” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Xác định giá trị sử dụng phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet Leuco Crystal violet sản phẩm thủy sản phương pháp miễn dịch” mẫu cá tra theo tiêu chí quy định Quyết định 657/2002/EC Liên Minh Châu Âu 1.3 Nội dung đề tài Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp “Xác định hàm lượng Crystal violet Leuco Crystal violet phương pháp miễn dịch” mẫu cá Tra kit thử hãng Bioo Scientific 1.4 Thời gian thực hiện: Từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010 Nồng độ CV/LCV mẫu xác định theo phương pháp nội suy Đường chuẩn xây dựng từ giá trị mật độ quang trung bình (OD) dung dịch chuẩn Giá trị mật độ quang trung bình (OD) hai giếng A1 and A2 giá trị giá trị mật độ quang (OD) mẫu chuẩn Các giá trị (OD) trung bình chuẩn mẫu (trung bình hai giếng lặp lại) chia cho giá trị (OD) chuẩn zero nhân 100 Chuẩn zero có giá trị 100% (độ hấp thụ cực đại) giá trị OD lại ước số phần trăm giá trị hấp thụ cực đại: O.D chuẩn (hoặc mẫu) x 100= % độ hấp thụ cực đại O.D.chuẩn zero Đường chuẩn: Các giá trị độ hấp thụ gắn tương ứng với trục Y logarithmic nồng độ chuẩn ứng với trục X biểu diễn đồ thị Đường chuẩn phải tuyến tính khoảng 0,05 Đường chuẩn: Các giá trị độ hấp thụ gắn tương ứng với trục Y logarithmic nồng độ chuẩn ứng với trục X biểu diễn đồ thị Đường chuẩn phải tuyến tính khoảng 0,05 ÷ 4,5 ng/ml S2 2.5 S3 OD S4 1.5 S5 S6 0.5 0.01 0.1 10 Nồng độ (ppb) Hình 3.1: Đường chuẩn Nồng độ tổng CV/LCV tính từ đồ thị nhân cho hệ số pha loãng mẫu chuyển đổi sang đơn vị ng/g mẫu mô Xác định giá trị CCα 23 Phân tích 20 mẫu trắng/matrix, tính độ nhiễu mẫu trắng (S/N) Ba lần giá trị S/N CCα Giá trị CCα xác định theo công thức: CCα = x SD + Xtb (1) Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn Xtb: Nồng độ trung bình Xác định giá trị CCβ Giá trị CCβ xác định theo công thức: CCβ = CCα + 1,64*SDW/L (2) Trong đó: SDW/L độ lệch chuẩn nội phịng xác định theo cơng thức: n SD W /L = ∑ [(n − 1) × SD i i =1 ri ] (3) n ∑ (n − 1) i i =1 Trong đó: ni: số lần phân tích lặp lại nồng độ thứ i SDri: độ lệch chuẩn nồng độ thứ i, Độ lệch chuẩn (SD): n SD = ∑ (x − x i =1 i tb (n − 1) (4) Trong đó: xi: nồng độ mẫu phân tích lần thứ i xtb : nồng độ trung bình lần phân tích n: số lần phân tích Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD = SD x100 xtb Trong đó: 24 (5) SD: độ lệch chuẩn xtb : nồng độ trung bình lần phân tích Độ thu hồi phương pháp %R = y x100 x Trong đó: y nồng độ mẫu phân tích x nồng độ mẫu ban đầu 25 (6) Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Độ đặc hiệu : Tính đặc hiệu kit thử sử dụng dựa tỉ lệ phản ứng chéo (do nhà sản xuất kit thử cung cấp qua tài liệu hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất kit thử CV/LCV, Bioo Scientific – 2010) Phản ứng chéo với: Crystal violet : 100% Leuco Crystal violet (sau oxy hoá) : 100% Malachit Green : 82% Leuco Malachit Green :