Bài viết nghiên cứu về chiết xuất hoạt chất piperin bằng bằng dung môI ethenol từ hạt hồ tiêu (Piper nigri L.). Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xây dựng được quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu tối ưu bằng dung môi ethanol.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT PIPERIN BẰNG DUNG MÔI ETHANOL TỪ HẠT HỒ TIÊU (PIPER NIGRI L.)
Phạm Thị Mai Hiên*; Nguyễn Minh Chính*; Đỗ Văn Bình*
Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Hương
TÓM TẮT
Quy trình chiết xuất piperin trong hồ tiêu bằng dung môi ethanol đã được khảo sát và xây dựng Điều kiện chiết xuất tối ưu bằng dung môi ethanol: phương pháp chiết siêu âm, kÝch th-íc tiểu phân 0,35 mm, cồn ethylic 96 0 , tỷ lệ cồn ethylic - dược liệu (3:1), nhiệt độ 40 0 , chiết 3 lần, mỗi lần chiết
1 giờ Hiệu suất chiết piperin của quy trình là 96,6%
* Từ khóa: Hồ tiêu; Piperin; Chiết xuất
PROCESS OF EXTRACTION OF PIPERINE BY ETHANOL
FROM PIPER NIGRI L
Summary
Ultrasound method for extraction of piperine from pepper was established Conditions of ultrasound extraction: particle size at 0.35 mm, using ethanol 96% as the extraction solvent
reached 96.6%
* Key words: Piper nigri L.; Piperine; Extraction
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hồ tiêu (Piper nigri L.) được trồng rộng
rãi trong những năm gần đây, sản phẩm
hồ tiêu không những đáp ứng nhu cầu thị
trường trong nước mà còn được xuất
khẩu đi nhiều nước trên thế giới [1, 4] Từ
2002, Việt Nam đã vươn lên trở thành
nước dẫn đầu, và đến nay vẫn chiếm một
nửa khối lượng hồ tiêu xuất khẩu trên
toàn thế giới [4] Hồ tiêu hạt được sử
dụng làm gia vị trong ngành thực phẩm
Hoạt chất piperin chiết xuất từ hạt hồ tiêu
được sử dụng phổ biến trong ngành dược phẩm với nhiều hoạt tính sinh học tốt [1, 5] Đã có một số công trình nghiên cứu công bố về quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu [3] Tuy nhiên, các quy trình này sử dụng dung môi không an toàn, gây độc đối với cơ thể Do đó, cần
có nghiên cứu về chiết xuất hoạt chất này bằng dung môi an toàn, rẻ tiền để đạt hiệu quả cao và dung môi ethanol được lựa chọn cho nghiên cứu này
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): §µo V¨n §«n (daovandon@gmail.com)
Ngày nhận bài: 14/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 19/01/2014
Ngày bài báo được đăng: 11/02/2014
Trang 2NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Nguyên vật liệu
* Nguyên liệu:
Hạt tiêu đen (Piper nigri L.) được thu mua
tại Hà Đông và lưu mẫu tại Khoa Dược liệu,
Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược,
Học viện Quân y
* Hoá chất:
- Hoá chất: chuẩn piperin (98,1%) của
Sigma-aldrich MeOH, ACN đạt tiêu chuẩn
HPLC EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân
tích
* Dụng cụ - thiết bị:
- Hệ thống HPLC WATERS 2695D,
detector PDA, 4 kênh dung môi
- Máy cất quay chân không Tokyo
Rikakikai model N-100 (Nhật)
- Thiết bị siêu âm gia nhiệt memmert
GmbH+ Co KG D- 91126 Schwabach FRG
(Đức)
- Bình chiết và các dụng cụ thủy tinh
khác
Tiến hành thí nghiệm tại Trung tâm Đào
tạo - Nghiên cứu Dược, Học viện Quân y
2 Phương pháp nghiên cứu
* Xây dựng quy trình chiết xuất:
- Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết
xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt và chiết
siêu âm gia nhiệt
+ Chiết siêu âm: chiết 50 g bột hồ tiêu
với 150 ml ethanol 960 ở nhiệt độ 400C
Sau 1 giờ, gạn lấy dịch chiết Chiết tiếp
tục bã dược liệu với ethanol 2 lần nữa
(150 ml x 2 lần)
+ Chiết Shoxlet: chiết 50 g bột hồ tiêu với 200 ml ethanol 960 Sau 6 giờ, gạn lấy dịch chiết
+ Chiết ngấm kiệt: cho 50 g bột hồ tiêu vào bình ngầm kiệt, thêm ethanol 960 cho đến ngập dược liệu 2 - 3 cm Sau 24 giờ, rút từ từ dịch chiết, đồng thời bổ sung dung môi vào bình ngấm kiệt Tiến hành chiết tới khi thu được 300 ml dịch chiết
- Khảo sát các yếu tố: kích thước tiểu phân, nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/ dược liệu; số lần chiết xuất; nhiệt độ và thời gian chiết xuất
- Dịch chiết ethanol được cô chân không
ở nhiệt độ 400C tới cắn
- Chỉ tiêu đánh giá: lượng piperin chiết được (hàm lượng piperin trong cắn ethanol
x khối lượng cắn)/lượng piperin có trong mẫu nguyên liệu
* Định lượng piperin bằng HPLC:
- Theo dược điển Trung Quốc (2010) [2]
- Xử lý mẫu hồ tiêu: cân chính xác 0,25 g bột hồ tiêu (bột khô mịn) cho vào bình cầu 100 ml, thêm 80 ml EtOH, chiết siêu âm 30 phút, thêm EtOH vừa đủ tới vạch, trộn đều Lọc qua màng lọc 0,45
µm trước khi phân tích HPLC
- Xử lý mẫu sản phẩm chiết xuất piperin: cân chính xác 50 mg mẫu cho vào bình định mức 50 ml, thêm MeOH vừa đủ tới vạch, trộn đều Lấy chính xác 2 ml dung dịch này, pha loãng với MeOH thành
25 ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích HPLC
- Điều kiện HPLC: cột sắc ký: Gemini
C18 (4,6 x 250 mm; 5 µm); detector UV:
343 nm; pha động: MeOH-nước (77:23, v/v); tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl
Trang 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Kết quả định lượng piperin trong
nguyên liệu hồ tiêu
Đánh giá hàm lượng piperin trong mẫu
nghiên cứu (hồ tiêu) bằng HPLC theo
phương pháp của dược điển Trung Quốc
Tiến hành phân tích 5 mẫu Kết quả cho
thấy: hàm lượng piperin trong mẫu nghiên
cứu là 3,41 ± 0,05% (n = 5) Đây là cơ sở
để tính hiệu suất chiết của quy trình
2 Kết quả lựa chọn phương pháp
chiết
Tiến hành khảo sát các phương pháp
chiết xuất: chiết siêu âm, chiết Shoxlet,
chiết ngấm kiệt như đã mô tả ở phần
phương pháp Lượng mẫu chiết 50 g bột
hồ tiêu khô
Bảng 1: Kết quả chiết xuất piperin theo
các phương pháp chiết khác nhau (n = 5)
PHƯƠNG
PHÁP CHIẾT
SẢN
PHẨM
THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ
Siêu âm (1) 3,28 ±
0,25
50,5 ± 3,8
96,6
± 1,4
p 1-2 > 0,1
p 1-3 < 0,05 Shoxlet (2) 3,09 ±
0,18
53,6 ± 3,6
96,8
± 1,4 Ngấm kiệt (3) 2,81 ±
0,30
48,9 ± 4,9
79,8
± 1,0 Phương pháp ngấm kiệt cho hiệu suất
chiết 79,8%, thấp hơn nhiều so với phương
pháp chiết siêu âm và chiết Shoxlet
(p < 0,05) Trong khi đó, tạp chất tương
tự như phương pháp chiết siêu âm
Do đó, phương pháp này không được lựa
chọn cho nghiên cứu tiếp theo
Phương pháp chiết siêu âm và phương
pháp chiết Shoxlet có hiệu suất chiết rất
cao (> 96%), gần như chiết được hết hoạt
chất piperin ra khỏi mẫu hồ tiêu Hiệu
suất chiết của 2 phương pháp không khác biệt (p > 0,1) Phương pháp chiết Shoxlet cần tạp chất ít hơn so với chiết siêu âm Tuy nhiên, phương pháp chiết Shoxlet cần thời gian dài, chỉ có thể triển khai ở quy mô phòng thí nghiệm, khó có khả năng triển khai ở quy mô công nghiệp Trong khi phương pháp chiết siêu âm có thời gian chiết ngắn, dễ dàng triển khai ở quy mô công nghiệp Do vậy, phương pháp này được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu
3 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chiết
- Kích thước tiểu phân:
Nghiền hồ tiêu khô thành bột ở kích cỡ khác nhau và chiết siêu âm theo quy trình
đã khảo sát ở trên Xác định khối lượng cắn và hàm lượng piperin trong sản phẩm thô chiết được
Bảng 2: Ảnh hưởng của kích thước
tiểu phân tới hiệu suất chiết (n = 5) KÍCH
THƯỚC TIỂU PHÂN
SẢN PHẨM THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ
0,8 mm (1)
2,58 ± 0,14
53,4 ± 2,5
80,6 ± 1,2
p 1-2 < 0,05
p 2-3 > 0,1
0,35 mm (2)
3,28 ± 0,25
50,5 ± 3,8
96,6 ± 1,4 0,18 mm
(3)
3,88 ± 0,09
42,8 ± 1,5
97,3 ± 1,6 Khi sử dụng phương pháp chiết siêu
âm để chiết xuất piperin từ hồ tiêu, nếu kích thước tiểu phân 0,8 mm, chỉ chiết được 80,6% piperin có trong hồ tiêu, không chiết hết được hoạt chất Khi giảm kích thước xuống 0,35 mm, có thể chiết xuất được gần như hoàn toàn piperin có trong mẫu với hiệu suất chiết 96,6% Khi giảm kích thước tiểu phân xuống 0,18
Trang 4kích thước tiểu phân 0,35 mm (p > 0,1)
Mặt khác, tạp chất lại nhiều hơn Do đó,
kích thước tiểu phân 0,35 là thích hợp để
chiết xuất piperin trong hồ tiêu
- Tỷ lệ dược liệu/dung môi:
Cân 50 g dược liệu được chiết xuất
siêu âm bằng dung môi EtOH với tỷ lệ
khác nhau Chiết 3 lần, gộp dịch chiết,
bốc hơi tạo cắn và định lượng piperin
Bảng 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu
- dung môi tới hiệu suất chiết (n = 5)
TỶ LỆ DƯỢC
LIỆU/DUNG
MÔI
SẢN
PHẨM
THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ
1:2 (1) 3,07 ±
0,26
50,9 ± 3,8
91,3 ± 1,9
p 2-1 < 0,05
p 2-3 > 0,1 1:3 (2) 3,28 ±
0,25
50,5 ± 3,8
96,6 ± 1,4 1:4 (2) 3,32 ±
0,23
50,3 ± 3,2
97,6 ± 1,1
Tỷ lệ dược liệu/dung môi (1:2) cho hiệu
suất chiết thấp nhất (91,3%) Khi tỷ lệ dung
môi tăng, hiệu suất chiết cũng tăng lên Ở
tỷ lệ dược liệu/dung môi (1:3), hiệu suất
chiết 96,6%, tương tự như hiệu suất chiết
ở tỷ lệ dược liệu/dung môi (1:4) (p > 0,1)
Độ tinh khiết của sản phẩm chiết xuất
được ở cả 3 tỷ lệ dung môi/ dược liệu
không khác biệt (p > 0,1) Như vậy, tỷ lệ
dược liệu/dung môi (1:3) là thích hợp nhất
cho chiết xuất piperin
- Nhiệt độ chiết xuất:
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới
hiệu suất chiết ở nhiệt độ khác nhau
Bảng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới
hiệu suất chiết (n = 5)
NHIỆT
ĐỘ
SẢN PHẨM THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ
300C (1) 2,71 ±
0,15
53,6 ± 2,3 85,1 ± 1,7
p 2-1 < 0,05
p 2-3 < 0,05
p 2-4 < 0,05
400C (2) 3,28 ±
0,25
50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4
50 0 C (3) 3,40 ±
0,17
47,4 ± 3,6 94,1 ± 1,0
600C (4) 3,50 ±
0,17
44,3 ± 1,7 91,0 ± 1,8 Khi tăng nhiệt độ chiết lên 30 - 600C, hiệu suất chiết thay đổi trong khoảng từ 85,1 - > 96,6% Ở 400C, hiệu suất chiết cao nhất (96,6%) Khi tăng tới nhiệt độ
600C, hiệu suất chiết giảm còn 91,0%;
do ở nhiệt độ này, một phần piperin bị phân hủy Do vậy, nhiệt độ chiết thích hợp là 400C
- Số lần chiết xuất:
Tiến hành chiết xuất dược liệu với số lần chiết khác nhau: 1 lần, 2 lần, 3 lần và
4 lần
Bảng 5: Ảnh hưởng của số lần chiết
tới hiệu suất chiết (n = 5)
SỐ LẦN CHIẾT
SẢN PHẨM THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ
1 lần (1) 2,24 ±
0,12
50,7 ± 2,1
66,5 ± 1,4
p 3-1 < 0,05
p 3-2 < 0,05
p 3-4 > 0,1
2 lần (2) 3,10 ±
0,27
50,7 ± 4,3
91,6 ± 1,7
3 lần (3) 3,28 ±
0,25
50,5 ± 3,8
96,6 ± 1,4
4 lần (4) 3,30 ±
0,08
50,0 ± 0,9
96,8 ± 1,4 Khi tăng số lần chiết xuất piperin từ
1 lần lên 4 lần, hiệu suất chiết tăng theo tương ứng 72 - 96% Hiệu suất chiết 4 lần
là 96,8% so với chiết 3 lần là 96,6%; khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,1)
Trang 5Do đó, chiết xuất 3 lần là phù hợp, vì tăng
lần chiết cũng không tăng được hoạt chất
- Thời gian chiết:
Tiến hành khảo sát thời gian mỗi lần
chiết siêu âm: 0,5 giờ, 1 giờ và 1,5 giờ
Đánh giá hiệu suất chiết với thời gian
khác nhau
Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian chiết
tới hiệu suất chiết (n = 5)
THỜI
GIAN
CHIẾT
SẢN
PHẨM
THÔ (g)
HÀM LƯỢNG PIPERIN (%)
HIỆU SUẤT (%)
THỐNG
KÊ 0,5 giờ
(1)
2,47 ±
0,21
50,0 ± 3,8
72,1 ± 1,2
p 2-1 < 0,05
p 2-3 > 0,1
1 giờ (2) 3,28 ±
0,25
50,5 ± 3,8
96,6 ± 1,4
2 giờ (3) 3,29 ±
0,22
50,9 ± 3,3
97,8 ± 0,9 Chiết siêu âm 0,5 giờ có hiệu suất
chiết thấp nhất Khi tăng thời gian lên
1 giờ, hiệu suất chiết cao hơn hẳn so với
0,5 giờ (p < 0,05) Thời gian chiết 1,5 giờ
cho hiệu suất tương tự 1 giờ (p > 0,1)
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được quy trình chiết xuất
piperin từ hồ tiêu tối ưu bằng dung môi
ethanol gồm: phương pháp chiết siêu âm,
tiểu phân 0,35 mm, cồn ethylic 960, tỷ lệ
cồn/dược liệu (3:1), nhiệt độ 400, chiết 3
lần, mỗi lần chiết 1 giờ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Viện Dược liệu Cây thuốc và động vật làm
thuốc Việt Nam NXB Khoa học và Kỹ thuật 2006
2 Dược điển Trung quốc 2010
3 Nguyễn Thị Chiên Ly Nghiên cứu chiết
tách và xác định thành phần hóa học trong hạt tiêu đen (Piper nigrum L.) ở huyện Đ¾k Đoa, tỉnh Gia Lai Khóa luận Tốt nghiệp Đại học, Đại học Đà Nẵng 2012
hồ tiêu và giải pháp tăng kim ngạch xuất khẩu
hồ tiêu Việt Nam Khóa luận Tốt nghiệp Đại học
Đại học Ngoại thương 2010
5 Bhradwaj R.K, Glaeser H, Becquemont
L, Klotz U, Gupta S.K, Fromm M.F Piperine,
a mayjor constituent of black pepper, inhibits human P-glycoprotein and CYP3A4 J Pharmacol Exp Ther 2002, 302 (2), pp.645-665
6 Reimmel Kwame Adosraku, James Oppong Kyekyeku, Isaac Yaw Attah Characterization and
HPLC quantification of piperine isolated from
pipper guineense (Fam Piperaceae) International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
2013, 5 (1), pp.252-256