BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ KIM THUYỀN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ 15 LOÀI HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ KIM THUYỀN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ 15 LOÀI HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT SINH HỌC CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã số: Quyết định giao đề tài: Công nghệ Thực phẩm 60540101 Số 309/QĐ-ĐHNT ngày 26/3/2015 Quyết định thành lập hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn nội dung thực luận văn kết nghiên cứu thân, không chép kết nghiên cứu người khác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn có gian dối Khánh Hòa, Ngày 21 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Võ Thị Kim Thuyền iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn nhận nhiều giúp đỡ tận tình quý Thầy Cô, bạn bè người thân Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu, phòng ban chức năng, quý Thầy Cô giáo giảng dạy, giúp đỡ trình học tập Trường Quý Thầy Cô Trung tâm Thí nghiệm Thực hành tạo điều kiện tốt cho trình thực Luận văn Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Huỳnh Nguyễn Duy Bảo hướng dẫn tận tình chu đáo suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành báo cáo Luận văn Cuối xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Khánh Hòa, ngày 21 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Võ Thị Kim Thuyền iv MỤC LỤC Lời cam đoan iii Lời cảm ơn iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng .ix Danh mục hình .x Trích yếu luận văn xiii Mở đầu Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hải miên 1.1.1 Đặc điểm sinh học hải miên 1.1.2 Hình thức sinh sản hải miên 1.1.3 Môi trường sống h miên 1.1.4 Ứng dụng hải miên 1.1.5 Tình hình nghiên cứu hải miên giới Việt Nam 1.2 Một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có hải miên 1.2.1 Nhóm hợp chất phenol 1.2.2 Nhóm hợp chất sterol .8 1.2.3 Nhóm hợp chất flavonoid .9 1.2.4 Nhóm hợp chất saponin 1.2.5 Nhóm hợp chất polypeptide 1.2.6 Nhóm hợp chất glycoside 10 1.3 Phương pháp chiết tách hợp chất 10 1.3.1 Cơ sở lý thuyết phương pháp chiết 10 1.3.2 Một số phương pháp hỗ trợ chiết tách hợp chất có hoạt tính sinh học 11 1.4 Quá trình oxy hóa chất chống oxy hóa 13 1.4.1 Quá trình oxy hóa 13 1.4.2 Chất chống oxy hóa 14 1.4.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa áp dụng phổ biến… 15 1.5 Phương pháp xác định protein 18 1.5.1 Phương pháp định lượng protein 18 v 1.5.2 Một số phương pháp kết tủa tách phân đoạn protein 20 1.5.3 Một số kỹ thuật phân tích protein 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu hóa chất 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Hóa chất .29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 30 2.2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát 15 loài hải miên sàng lọc loài hải miên tiềm để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 31 2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết thích hợp để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa hải miên .32 2.2.4 Thí nghiệm tinh chế sơ dịch chiết từ hải miên có hoạt tính chống oxy hóa………………………………………………………………………………40 2.3 Phương pháp phân tích .45 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng 45 2.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu thực nghiệm .46 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa phân tích nhận diện hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ 15 loài hải miên .47 3.1.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ 15 loài hải miên 47 3.1.2 Phân tích nhận diện hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết 15 loài hải miên Error! Bookmark not defined 3.2 Xác định điều kiện chiết thích hợp để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa hải miên (Ircinia mutans) 51 3.2.1 Xác định loại dung môi chiết thích hợp có hỗ trợ siêu âm không siêu âm để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 51 3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein cao 57 3.2.3 Xác định thời gian chiết thích hợp để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein cao 59 vi 3.2.4 Xác định nhiệt độ chiết thích hợp để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein cao 61 3.2.5 Xác định số lần chiết thích hợp để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein cao 63 3.2.6 Kết thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên 65 3.3 Tinh chế sơ dịch chiết từ hải miên có hoạt tính chống oxy hóa 70 3.3.1 Tách phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên muối ammonium sulfate…………………………………………………………………………… 71 3.3.2 Tinh protein từ dịch chiết hải miên để thu protein có hoạt tính chống oxy hóa cao 76 3.3.3 Phân tích protein dịch chiết hải miên sắc ký cột trao đổi ion 78 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .82 4.1 Kết luận .82 4.2 Đề xuất ý kiến .83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DPPH : 2,2 diphenyl-1picrylhydrazyl DPPH-H : 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine BHT : Butylated hydroxytoluene AS : AA : Ammonium acetate AchE : Ammonium sulfate Acetylcholinesterase SDS – PAGE : Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Kda : kilo Dalton IC50 : Nồng độ mẫu ức chế 50% gốc tự viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các thành phần hợp chất chống oxy hóa nhận diện dịch chiết 15 loài hải miên Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm chọn để khảo sát mẫu ban đầu .66 Bảng 3.3 Kết thí nghiệm leo dốc hàm mục tiêu IC50 DPPH 67 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm leo dốc hàm mục tiêu IC50 tổng khử 69 Bảng 3.5 Kết thí nghiệm leo dốc hàm chập YL 69 Bảng 3.6 Hoạt tính chống oxy hóa 1g protein phân đoạn tách muối ammonium sulfate .74 Bảng 3.7 Hoạt tính chống oxy hóa 1g protein phân đoạn protein 80% tách muối ammonium sulfate trước sau tinh 77 Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxy hóa 1g protein đỉnh 80 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo thể hải miên Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng chất chống oxy hóa gốc tự DPPH 15 Hình 1.3 Phản ứng Biure 19 Hình 1.4 Phản ứng lowry 19 Hình 1.5 Độ hòa tan protein biến thiên theo nồng độ muối 21 Hình 1.6 Sơ đồ điện di SDS – Page 24 Hình 1.7 Sơ đồ phân tách protein điện di – DE .25 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát 15 loài hải miên sàng lọc loài hải miên tiềm để chiết xuất hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 31 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi chiết thích hợp có hỗ trợ siêu âm để thu dịch chiết hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 32 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp để thu dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 34 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp để thu dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 35 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp để thu dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 36 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết thích hợp để thu dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 38 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết để thu dịch hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao 39 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên 40 Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tinh protein từ dịch chiết hải miên .42 Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích protein dịch chiết hải miên sắc ký trao đổi ion Hình 3.1 Khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ 15 loài hải miên vùng biển Việt Nam .47 Hình 3.2 Tổng lực khử dịch chiết 15 loài hải miên vùng biển Việt Nam 49 x Số lần chiết (lần) Độ hấp phụ (517nm) 0,3 0,4 0,2 0,5 Độ hấp phụ (517nm) Độ hấp phụ (517nm) 0.1252 0.1704 0.1944 0.2305 0.0361 0.0006 0.1464 0.1865 0.2362 0.2814 0.0313 0.0003 0.1716 0.2095 0.2632 0.2926 0.0255 0.0008 0.1444 0.1909 0.2379 0.282 0.0286 0.0009 0.1383 0.1659 0.2351 0.2706 0.0356 0.002 Bảng 4.14 Tổng lực khử dịch chiết hải miên với số lần chiết khác Số lần chiết (lần) Độ hấp phụ (700nm) 0.2 0.3 0.4 0.5 lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 0.1246 0.1252 0.1275 0.1692 0.1625 0.1602 0.2667 0.2742 0.2777 0.3159 0.3118 0.3163 0.1419 0.1452 0.1482 0.2512 0.2587 0.257 0.3193 0.3192 0.3187 0.3961 0.4025 0.4037 0.1785 0.1743 0.1752 0.2793 0.2611 0.2627 0.3681 0.3697 0.3686 0.448 0.4321 0.4408 0.1655 0.1687 0.1682 0.2693 0.2697 0.2593 0.3511 0.3515 0.3516 0.4251 0.4229 0.4252 0.162 0.1631 0.1648 0.2655 0.2626 0.2636 0.3505 0.3508 0.3453 0.4152 0.4158 0.4182 Trung bình tổng lực khử (mgBHT/ml) 0,3 0,4 Số lần chiết (lần) 0,2 1.2968 2.0068 1.6561 2.2305 STD 0,5 TB IC50 (ml) 4.031 4.8079 0.0869 0.0003 3.7107 4.8897 6.4083 0.0637 0.0015 3.9349 5.8141 7.1431 0.0532 0.0019 2.0719 3.9052 5.4907 6.8476 0.0547 0.0015 1.9944 3.8643 5.4436 6.6989 0.0556 0.0002 2.2.6 Tối ưu hóa tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) thời gian chiết Bảng 4.15 Hoạt tính khử gốc tự DPPH khảo sát tỉ lệ thời gian chiết để thu điều kiện chiết tối ưu Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) Mẫu đối chứng Độ hấp phụ (517nm) 0.2 0.3 0.4 0.5 lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 10 0.3718 0.3366 0.3271 0.3041 0.2908 0.3351 0.3276 0.3059 0.2905 0.3356 0.3279 0.3055 0.2905 20 0.3718 0.3314 0.3107 0.3053 0.2824 0.3315 0.3116 0.3058 0.2824 0.3317 0.3104 0.2952 0.2827 10 0.3718 0.3355 0.3232 0.3149 0.2943 0.3357 0.323 0.3148 0.2943 0.3354 0.3232 0.3147 0.2882 20 0.3718 0.3383 0.3227 0.3189 0.2951 0.3386 0.3225 0.3185 0.2958 0.3385 0.3222 0.3245 0.2957 15 0.3718 0.3322 0.3118 0.3069 0.2838 0.3323 0.3121 0.3066 0.2833 0.3324 0.3119 0.3013 0.2906 15 0.3802 0.3394 0.323 0.3053 0.2936 0.3408 0.3225 0.3057 0.293 0.3392 0.3229 0.3048 0.2934 15 0.3115 0.2682 0.2593 0.2424 0.2254 0.2582 0.2432 0.2272 0.2128 0.2611 0.2406 0.2224 0.2107 Trung bình nồng độ DPPH bị khử trước pha loãng mM/ml 0,2 0,3 0,4 0,5 Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) 10 0.3657 0.3616 0.5391 20 0.4998 0.4925 10 0.3976 0.3992 TB IC50 (µl) STD 0.5424 34.9992 1.1946 0.5399 0.6266 18.5865 0.3943 0.4663 0.4671 27.7652 3.7905 20 0.4017 0.4033 0.436 0.3869 29.7802 0.443 15 0.4908 0.4884 0.49 0.5767 17.1681 4.2907 15 0.4679 0.472 0.4688 0.6168 19.419 1.7188 15 0.427 0.5587 0.58 0.7289 18.4959 0.9385 Bảng 4.16 Tổng lực khử khảo sát tỉ lệ thời gian chiết để thu điều kiện chiết tối ưu Độ hấp phụ (517nm) Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) Lần Lần Lần 0,2 0,3 0,4 0,5 0,2 0,3 0,4 0,5 0,2 0,3 0,4 0,5 8 10 20 0.1404 0,2087 0.2184 0,2871 0.3078 0,3678 0.3848 0,4591 0.1451 0,2093 0.2215 0,2895 0.2996 0,3679 0.3971 0,4578 0.1447 0,2099 0.2202 0,2837 0.3083 0,3656 0.3965 0,4514 10 0.1688 0.2332 0.3258 0.4102 0.1565 0.2258 0.3174 0.4075 0.1614 0.2316 0.3136 0.4132 20 0.1325 0.2021 0.2923 0.3819 0.1315 0.2022 0.2998 0.3826 0.132 0.2007 0.2981 0.3822 1/6 15 0.1684 0.2356 0.3167 0.4048 0.1634 0.2357 0.3138 0.4089 0.1648 0.2292 0.3149 0.4077 1/6 15 0.1593 0.233 0.3314 0.4017 0.1612 0.2299 0.3258 0.4159 0.1624 0.2323 0.3153 0.4162 1/6 15 0.1624 0.2331 0.3166 0.4014 0.1592 0.2379 0.3147 0.3979 0.1506 0.2372 0.3098 0.4096 Trung bình tổng lực khử (mgBHT/ml) 0,3 0,4 Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) 0,2 10 1.6561 3.0762 20 2.8494 10 1.868 STD 0,5 TB IC50 (µl) 4.5279 6.3401 72.5327 0.3457 4.3401 5.7974 7.4684 38.3861 1.592 3.1561 4.8587 6.5335 65.5768 2.1272 20 1.4033 2.7175 4.5316 6.0706 81.4461 2.603 15 2.0892 3.3401 4.7918 5.8123 61.0648 2.02 15 1.9201 3.2323 5.0149 5.8197 63.9658 1.2954 15 1.9777 3.381 4.8086 5.7175 65.0821 3.3639 Bảng 4.17 Hoạt tính khử gốc tự DPPH thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu khả khử gốc tự DPPH (Y1) Mẫu đối Tỷ lệ Thời DM/NL gian Độ hấp phụ (517nm) chứng 0.2 (ml/g) (phút) 0.3 0.4 0.5 lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 15 0.4109 0.3835 0.3519 0.3255 0.3102 0.3844 0.3453 0.3267 0.3136 0.3838 0.3463 0.3295 0.3105 17 0.4109 0.3727 0.3434 0.3054 0.2981 0.3712 0.3439 0.3037 0.2976 0.3717 0.3443 0.3038 0.4109 19 0.4109 0.3882 0.3493 0.3284 0.3184 0.3882 0.3492 0.3282 0.3188 0.3891 0.3496 0.3294 0.3177 21 0.4109 0.3936 0.3619 0.3379 0.3236 0.3948 0.3618 0.3368 0.3258 0.3965 0.3612 0.3334 0.3233 10 23 0.4109 0.3943 0.3615 0.3388 0.3237 0.3956 0.3623 0.3377 0.3244 0.3945 0.3627 0.3378 0.3239 Trung bình nồng độ DPPH bị khử trước pha loãng mM/ml 0,2 0,3 0,4 0,5 Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) 15 0.1207 0.1342 0.1722 17 0.138 0.137 0.2192 TB IC50 (µl) STD 0.2053 0.136 0.0021 0.2311 0.1122 0.0009 19 0.126 0.1262 0.1691 0.1906 0.1438 0.0012 21 0.1002 0.1004 0.1515 0.1792 0.1687 0.0006 10 23 0.101 0.0994 0.1497 0.1779 0.17 0.0011 Bảng 4.18 Tổng lực khử thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu (Y1) Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) 17 Độ hấp phụ (700nm) 0.2 0.3 0.4 0.5 lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 0.2017 0.2947 0.3902 0.4226 0.2014 0.2931 0.3909 0.4246 0.2013 0.2937 0.3912 0.4249 Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) 0,2 17 2.7082 Trung bình tổng lực khử (mgBHT/ml) 0,3 0,4 4.4368 5.8141 TB IC50 (µl) STD 0,5 6.8401 36.2 0.0007 Bảng 4.19 Hoạt tính khử gốc tự DPPH thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu tổng lực khử (Y2) Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) A 16 0,4109 Độ hấp phụ (517nm) 0.2 0.3 0.4 0.5 lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 0,3711 0,3448 0,3077 0,2923 0,3708 0,3431 0,3075 0,2927 0,3708 0,3435 0,3074 0,2928 Tỷ lệ DM/NL (ml/g) Thời gian (phút) 16 Trung bình nồng độ DPPH bị khử trước pha loãng mM/ml 0,2 0,3 0,4 0,5 0.1207 0.1342 0.1722 0.2053 TB IC50 (µl) STD 0.136 0.0021 Bảng 4.20 Tổng lực khử thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu tổng lực khử (Y2) Độ hấp phụ (700nm) Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần lần 15 0.1771 0.2475 0.3052 0.3696 0.1775 0.2472 0.3086 0.3694 0.1776 0.2482 0.3089 0.3691 16 0.1619 0.2368 0.2839 0.3489 0.1615 0.2363 0.2937 0.3484 0.1777 0.2358 0.2957 0.3452 17 0.2071 0.2995 0.3852 0.4296 0.2075 0.2992 0.3856 0.4294 0.2076 0.2992 0.3859 0.4294 18 0.1617 0.2378 0.2937 0.3488 0.1611 0.2378 0.2936 0.3487 0.1619 0.2351 0.2932 0.3467 10 19 0.1564 0.2241 0.2856 0.3344 0.1562 0.2249 0.2847 0.3349 0.1566 0.2242 0.2848 0.3346 Tỷ lệ DM/NL 0.2 0.3 0.4 Trung bình tổng lực khử (mgBHT/ml) Thời gian 0.5 TB IC50 0,2 0,3 0,4 0,5 (µl) 2.2509 3.5595 4.632 5.829 44.52 STD (phút) (ml/g) 15 2.341 16 1.9684 3.3606 4.2361 5.4442 50.96 1.265 17 2.8086 4.526 6.119 6.9442 30.92 3.19 18 1.9647 3.3792 4.4182 5.4424 50.65 3.13 10 19 1.8662 3.1245 4.2677 5.1747 54.18 2.14 Bảng 4.21 Hoạt tính khử gốc tự DPPH thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu hàm chập (YL) Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) Độ hấp phụ (517nm) A 0.2 0.3 0.4 0.5 15 0,4018 lần 0,3816 lần 0,3512 lần 0,3232 lần 0,3012 lần 0,3833 lần 0,3513 lần 0,3222 lần 0,3003 lần 0,3817 lần 0,3506 lần 0,3248 lần 0,3008 17 0,4018 0,3706 0,3434 0,3081 0,2945 0,3709 0,3436 0,3073 0,2933 0,3708 0,3436 0,3057 0,2945 19 0,4018 0,3833 0,3562 0,3282 0,3038 0,3833 0,3513 0,3272 0,3043 0,3837 0,3516 0,3278 0,3048 21 0,4018 0,3896 0,3559 0,3289 0,3106 0,3888 0,3568 0,3288 0,3108 0,3895 0,3562 0,3284 0,3103 10 23 0,4018 0,3989 0,3596 0,3283 0,3156 0,3987 0,3594 0,3283 0,3186 0,3993 0,3589 0,3292 0,3178 Bảng 4.22 Tổng lực khử thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu hàm chập (YL) Tỷ lệ Thời DM/NL gian (ml/g) (phút) Độ hấp phụ (700nm) 0.2 15 lần 0,2096 17 0.1989 0.3 0.4 0.5 lần 0,2994 lần 0,3951 lần 0,4291 lần 0,2086 lần 0,2987 lần 0,3967 lần 0,4291 lần 0,2081 lần 0,2993 lần 0,3857 lần 0,4298 0.2883 0.3874 0.4218 0.1965 0.2881 0.3871 0.4274 0.1982 0.2889 0.3867 0.4271 19 0.1776 0.2474 0.3051 0.3691 0.1768 0.2487 0.3087 0.3691 0.1781 0.2483 0.3085 0.3698 21 0.1679 0.2373 0.2954 0.3598 0.1665 0.2381 0.2971 0.3593 0.1682 0.2388 0.2987 0.3581 10 23 0.1562 0.2237 0.2842 0.3468 0.1562 0.2269 0.2839 0.3462 0.1786 0.2354 0.2861 0.3461 4.2 Số liệu thực nghiệm xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa 4.2.1 Số liệu thực nghiệm tách phân đoạn protein muối ammonium sulfat bão hòa Bảng 4.23 Hoạt tính khử gốc tự DPPH tách chiết phân đoạn protein muối ammonium sulfat bão hòa 20% - 80% Độ hấp phụ (517nm) Mẫu Tủa phân đoạn 20% Tủa phân đoạn 30% Tủa phân đoạn 40% Tủa phân đoạn 50% Tủa phân đoạn 60% Tủa phân đoạn 70% Tủa chiết phân đoạn 80% MĐC Lần lần Lần 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.3088 0.2025 0.1820 0.1800 0.1650 0.2015 0.1920 0.1785 0.1620 0.1950 0.1900 0.1797 0.1702 0.3088 0.1620 0.1505 0.1467 0.1373 0.1530 0.1520 0.1430 0.1332 0.1630 0.1513 0.1483 0.1351 0.3088 0.1859 0.1735 0.1630 0.1520 0.1920 0.1720 0.1660 0.1519 0.1830 0.1770 0.1640 0.1522 0.3088 0.1501 0.1303 0.1201 0.1135 0.1500 0.1311 0.1200 0.1130 0.1520 0.1303 0.1205 0.1130 0.3088 0.1530 0.1400 0.1358 0.1210 0.1523 0.1414 0.1390 0.1323 0.1543 0.1403 0.1388 0.1200 0.3088 0.1760 0.1700 0.1601 0.1535 0.1781 0.1695 0.1535 0.1510 0.1795 0.1687 0.1607 0.1530 0.3088 0.1722 0.1560 0.1432 0.1230 0.1720 0.1611 0.1404 0.1221 0.1709 0.1603 0.1415 0.1281 Trung bình nồng độ DPPH bị khử (mM/ml) Mẫu 0.2 4.465 6.116 4.985 6.469 6.367 2.679 2.805 Tủa phân đoạn 20% Tủa phân đoạn 30% Tủa phân đoạn 40% Tủa phân đoạn 50% Tủa phân đoạn 60% Tủa phân đoạn 70% Tủa phân đoạn 80% 0.3 4.943 6.446 5.509 7.293 6.884 2.852 3.062 0.4 5.295 6.661 5.911 7.717 6.994 3.083 3.419 ĐLC 0.5 5.854 7.103 6.414 8.005 7.544 3.198 3.773 0.2 0.167 0.225 0.188 0.046 0.042 0.036 0.014 0.3 0.217 0.031 0.105 0.019 0.030 0.013 0.056 0.4 0.032 0.111 0.063 0.011 0.073 0.082 0.029 0.5 0.170 0.084 0.006 0.012 0.280 0.027 0.066 Bảng 4.24 Tổng lực khử tách chiết phân đoạn protein muối ammonium sulfat bão hòa 20% - 80% Mẫu Lần 0.2 0.3 Lần Lần 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 Tủa phân đoạn 20% 0.1995 0.3330 0.3645 0.4597 0.2036 0.3238 0.3720 0.4607 0.2001 0.3320 0.3630 0.4560 Tủa phân đoạn 30% 0.2521 0.3180 0.3992 0.4203 0.2496 0.3090 0.3890 0.4152 0.2550 0.3120 0.3920 0.4252 Tủa phân đoạn 40% 0.4078 0.4513 0.5323 0.6298 0.4088 0.4552 0.5376 0.6342 0.4092 0.4503 0.5382 0.6320 Tủa phân đoạn 50% 0.4408 0.5656 0.7183 0.8502 0.4590 0.5720 0.7220 0.8519 0.4438 0.5734 0.7213 0.8630 Tủa phân đoạn 60% 0.4547 0.5787 0.7250 0.8599 0.4644 0.5866 0.7260 0.8670 0.4590 0.5880 0.7321 0.8700 Tủa phân đoạn 70% 0.4150 0.5980 0.7017 0.8313 0.4402 0.5978 0.7015 0.8289 0.4312 0.5990 0.7113 0.8392 Tủa phân đoạn 80% 0.5371 0.7065 0.8259 0.8423 0.5430 0.7126 0.8260 0.8530 0.5487 0.7223 0.8231 0.8340 Bảng 4.25 Hàm lượng protein dịch chiết hải miên chiết xuất dung môi khác có hỗ trợ siêu âm Độ hấp phụ lần 0.4438 0.5023 0.6540 0.7630 0.7301 0.6773 0.8159 pha loãng 50 50 50 50 50 20 20 Hàm lượng protein (mg/ml) lần lần lần 20.9748 21.0556 20.9437 25.0280 24.6923 24.5431 34.6575 34.1228 34.6948 40.3519 40.8989 40.2773 38.8164 38.8537 38.2444 14.3131 14.2285 14.2360 17.6004 17.6750 17.6029 Mẫu lần lần TB ĐLC 0.4425 0.4420 20.9913 0.0578 Tủa phân đoạn 20% 0.5077 0.4999 24.7544 0.2484 Tủa phân đoạn 30% 0.6626 0.6632 34.4917 0.3200 Tủa phân đoạn 40% 0.7542 0.7530 40.5093 0.3394 Tủa phân đoạn 50% 0.7295 0.7203 38.6382 0.3415 Tủa phân đoạn 60% 0.6807 0.6776 14.2592 0.0468 Tủa phân đoạn 70% 0.8129 0.8130 17.6261 0.424 Tủa phân đoạn 80% 4.2.2 Số liệu thực nghiệm tinh protein từ dịch chiết hải miên để thu protein có hoạt tính chống oxy hóa cao Bảng 4.26 Hoạt tính khử gốc tự DPPH phân đoạn tổng 80% trước sau tinh Mẫu Lần MĐC Tủa phân đoạn 0.3088 tổng 80% Tinh (tủa 0.3088 phân đoạn 80%) Mẫu Tủa phân đoạn tổng 80% Tinh (tủa phân đoạn 80%) lần Lần 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2025 0.1820 0.1800 0.1650 0.2015 0.1920 0.1785 0.1620 0.1950 0.1900 0.1797 0.1702 0.1620 0.1505 0.1467 0.1373 0.1530 0.1520 0.1430 0.1332 0.1630 0.1513 0.1483 0.1351 Trung bình nồng độ DPPH bị khử (mM/ml) 0.2 0.3 0.4 0.5 ĐLC 0.2 0.3 0.4 0.5 19.4067 21.8781 23.1506 24.0139 0.4383 0.6567 0.7532 0.6354 4.2239 5.4913 6.6536 7.8159 0.1307 0.3133 0.4527 0.2054 Bảng 4.27 Tổng lực khử phân đoạn tổng 80% trước sau tinh Mẫu 0.2 Tủa phân đoạn tổng 80% Tinh (tủa phân đoạn 80%) Lần Lần 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 0.1995 0.3330 0.3645 0.4597 0.2036 0.3238 0.3720 0.4607 0.2001 0.3320 0.3630 0.4560 0.2521 0.3180 0.3992 0.4203 0.2496 0.3090 0.3890 0.4152 0.2550 0.3120 0.3920 0.4252 Trung bình tổng lực khử (mgBHT/ml) Mẫu Tủa phân đoạn tổng 80% Tinh (tủa phân đoạn 80%) Lần 0.3 0.4 Độ lệch chuẩn 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2 0.3 0.4 0.5 137.82 177.14 223.10 271.18 5.3483 7.6690 6.6779 4.4308 35.68 46.95 59.47 72.45 4.1855 3.2313 4.0981 5.6805 Bảng 4.28 Hàm lượng protein phân đoạn tổng 80% trước sau tinh lần Độ hấp phụ lần lần 100 0.3589 0.3868 0.3677 31.089 33.0369 10 0.2304 0.2289 0.2287 6.158 5.9785 Mẫu pha loãng Tủa phân đoạn tổng 80% Tinh (tủa phân đoạn 80%) Hàm lượng protein (mg/ml) lần lần lần 4.2.3 Số liệu thực nghiệm phân tích protein dịch chiết hải miên sắc kí cột trao đổi ion TB ĐLC 32.0593 32.1200 1.262 6.0735 6.0892 0.9231 Bảng 4.29 Phân tích protein dịch chiết hải miên sắc ký cột trao đổi ion Thời gian (phút) OD (280nm) Thời gian (phút) OD (280nm) Thời gian (phút) OD (280nm) Thời gian (phút) OD (280nm) 10 0.0077 90 1.7119 170 0.0901 250 0.7101 20 1.6321 100 1.047 180 0.0069 260 0.4459 30 2.4819 110 0.8345 190 0.0057 270 0.1494 40 3.6123 120 0.718 200 0.0714 280 0.0901 50 3.3113 130 0.6387 210 0.1021 290 0.0548 60 1.9995 140 0.4952 220 0.2727 300 0.0322 70 2.0441 150 0.3839 230 0.2971 310 0.0186 80 2.3005 160 0.172 240 0.3279 320 0.0049 Bảng 2.30 Khả khử gốc tự DPPH phân tích protein dịch chiết hải miên sắc kí cột trao đổi ion Độ hấp phụ (517nm) Nồng độ DPPH bị khử (mmol/0,2ml) Mẫu tính theo thời gian (phút) pha loãng lần lần lần lần lần lần TB ĐLC 10 0.3328 0.3414 0.3372 0.0040 0.0005 0.0022 0.0022 0.002 20 0.3158 0.3244 0.3163 0.0109 0.0074 0.0107 0.0097 0.002 30 10 0.284 0.2765 0.2854 0.2394 0.2700 0.2336 0.2477 0.020 40 10 0.2585 0.2454 0.2541 0.3437 0.3973 0.3617 0.3676 0.027 50 10 0.2438 0.2576 0.2317 0.4038 0.3474 0.4534 0.4015 0.053 60 0.2023 0.2049 0.2142 0.2868 0.2815 0.2625 0.2769 0.013 70 0.227 0.2341 0.2293 0.2363 0.2218 0.2316 0.2299 0.007 80 0.2079 0.2173 0.212 0.2754 0.2561 0.2670 0.2662 0.010 90 0.2522 0.2443 0.2479 0.1847 0.2009 0.1935 0.1931 0.008 100 0.2606 0.2749 0.2638 0.1676 0.1383 0.1610 0.1556 0.015 110 0.2764 0.2831 0.2711 0.1352 0.1215 0.1461 0.1343 0.012 120 0.2906 0.2936 0.2894 0.1062 0.1000 0.1086 0.1050 0.004 130 0.2982 0.2904 0.3018 0.0181 0.0213 0.0167 0.0187 0.002 140 0.2793 0.2686 0.2715 0.0259 0.0302 0.0291 0.0284 0.002 150 0.274 0.2749 0.2804 0.0280 0.0277 0.0254 0.0270 0.001 160 0.2842 0.2972 0.2901 0.0239 0.0185 0.0214 0.0213 0.003 170 0.3032 0.3165 0.302 0.0161 0.0106 0.0166 0.0144 0.003 180 0.3287 0.3363 0.3239 0.0056 0.0025 0.0076 0.0053 0.003 190 0.3372 0.3261 0.3411 0.0022 0.0067 0.0006 0.0032 0.003 200 0.3263 0.3451 0.3349 0.0066 -0.0011 0.0031 0.0029 0.004 210 0.3143 0.3064 0.3013 0.0115 0.0148 0.0169 0.0144 0.003 220 0.2809 0.29 0.2851 0.0252 0.0215 0.0235 0.0234 0.002 230 0.2571 0.2588 0.2641 0.0349 0.0342 0.0321 0.0338 0.001 240 0.2911 0.3081 0.3018 0.1052 0.0704 0.0833 0.0863 0.018 250 0.2929 0.2873 0.2963 0.1015 0.1129 0.0945 0.1030 0.009 260 0.2486 0.2463 0.2377 0.0384 0.0394 0.0429 0.0402 0.002 270 0.2681 0.2732 0.2642 0.0304 0.0284 0.0320 0.0303 0.002 280 0.2848 0.2942 0.2817 0.0236 0.0198 0.0249 0.0227 0.003 290 0.3002 0.3058 0.3182 0.0173 0.0150 0.0099 0.0141 0.004 300 0.3148 0.318 0.3153 0.0113 0.0100 0.0111 0.0108 0.001 310 0.3079 0.3148 0.3265 0.0142 0.0113 0.0065 0.0107 0.004 320 0.3381 0.3412 0.341 0.0018 0.0005 0.0006 0.0010 0.001 Bảng 2.31 Hàm lượng protein mẫu đỉnh phân tích protein dịch chiết hải miên sắc kí cột trao đổi ion Độ hấp phụ (750 nm) Đỉnh Hàm lượng protein (mg/ml) pha loãng lần lần lần lần lần lần (50 phút) 10 0.58 0.59 0.51 5.92 6.06 5.09 5.69 0.102 (80 phút) 0.48 0.46 0.46 2.34 2.22 2.21 2.26 0.092 (250 phút) 0.37 0.40 0.37 0.33 0.36 0.33 0.34 0.020 TB ĐLC [...]... nghiờn cu ca lun ỏn l kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam v hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn Mc tiờu t c l kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam Hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn.Tinh ch s b protein cú hot tớnh chng oxy húa t hi miờn Cỏc phng phỏp phõn tớch... oxy húa Cht chng oxy húa l mt loi húa cht giỳp ngn chn hoc lm chm quỏ trỡnh oxi húa cht khỏc S oxy húa l loi phn ng húa hc trong ú electron c chuyn sang cht oxy húa, cú kh nng to cỏc gc t do sinh ra phn ng dõy chuyn phỏ hy t bo sinh vt Cht chng oxy húa ngn quỏ trỡnh phỏ hy ny bng cỏch kh i cỏc gc t do, kỡm hóm s oxy húa bng cỏch oxy húa chớnh chỳng [66] Cht chng oxy húa chia lm hai loi l cht chng oxy. .. sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam Nhn din mt s hp cht cú hot tớnh chng oxy húa cú trong hi miờn Hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn Tinh ch s b protein cú hot tớnh chng oxy húa trong hi miờn í ngha khoa hc Kt qu nghiờn cu s úng gúp thờm c s khoa hc v hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t hi miờn vựng bin Vit Nam Kt qu nghiờn... dng cỏc hot tớnh sinh hc ca hi miờn Vit Nam vn cũn rt khiờm tt, cha tn dng 1 c ht ngun ti nguyờn bin vụ cựng quý giỏ khai thỏc hiu qu ngun ti nguyờn quý giỏ ny, vic nghiờn cu tỏch chit cỏc hot cht sinh hc t hi miờn l rt cn thit v ú l lý do tụi chn ti Kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam v hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn... hot tớnh chng oxy húa cú trong hi miờn Trong s cỏc ngun hot cht sinh hc chng oxy húa t t nhiờn, hi miờn c xp vo hng cú cha hot cht sinh hc chng oxy húa cao Mt s cht chuyn húa cú ngun gc t loi hi miờn nh polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside v cỏc hp cht phenol cho thy cú kh nng chng oxy húa mnh so vi vitamin E v vitamin C [22] Nghiờn cu ca Li v cng s (1994) cho thy cỏc hot cht sinh hc chit... Microsoft Excel 2010 v SPSS 16.0 Kt qu kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn cho thy tt c cỏc loi hi miờn c kho sỏt u cú kh nng chng oxy húa, loi Diacarnus laevis v loi Ircinia mutans c xỏc nh cú hot tớnh chng oxy húa cao nht Loi hi miờn Ircinia mutans c chn tip tc nghiờn cu hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa iu kin thớch hp nht cho quỏ trỡnh chit tỏch dch chit... tớnh chng oxy húa da vo kh nng kh hydroperoxide Kh nng kh hydroperoxide ca cht chng oxy húa c phõn tớch da vo phng phỏp ca Nabavi v cng s (2008) [57] Kh nng kh hydroperoxide ca cht chng oxy húa cú th l do nú cho in t khi tham gia phn ng oxy húa Vỡ vy kh nng kh hydroperoxide cng biu hin kh nng chng oxy húa mt cht Bn thõn H2O2 l mt cht oxy húa mnh khi nú tham gia vo phn ng Fenton to ra cỏc gc hydeoxyl kớch... thuc chng ung th c chit xut t hi miờn [50] Vit Nam, cỏc nghiờn cu v hot cht sinh hc t hi miờn vn cũn khỏ mi m v cha tỡm thy ti liu nghiờn cu c th v hi miờn Trong khi ú, Vit Nam cú rt nhiu iu kin thun li cho cỏc loi hi miờn cựng vi cỏc ng vt ký sinh sinh sng v phỏt trin Cỏc sn phm t hi miờn ó c nghiờn cu l cú tớnh nng phũng bnh, bao gm c khỏng khun, chng oxy húa, h huyt ỏp, thuc chng ụng mỏu, chng ung... cú (do nhúm hydroxyl khụng liờn kt vi nguyờn t cacbon no) Trong cu trỳc ca chỳng, vũng thm kt hp mnh vi nguyờn t oxy v liờn kt tng i lng lo gia nguyờn t oxy ny vi nguyờn t hydro trong nhúm hydroxyl do ú d tỏch nguyờn t hydro ra khi nhúm nờn chỳng cú tớnh acid tng i cao Mt s polyphenol thc vt tiờu biu nh catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin,... cú hot tớnh sinh hc nhng chit xut vi s h tr ca siờu õm c s dng rng rói vỡ õy l phng phỏp rỳt ngn ỏng k thi gian chit, cú th ỏp dng c cho hu ht cỏc loi dung mụi cú phõn cc khỏc nhau, lng dung mụi s dng ớt, chi phớ thp, gim ụ nhim mụi trng v d ỏp dng 1.4 Quỏ trỡnh oxy húa v cht chng oxy húa 1.4.1 Quỏ trỡnh oxy húa Quỏ trỡnh oxy húa l mt loi phn ng húa hc trong ú electron c chuyn sang cht oxy húa, cú ... chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam v hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn Mc tiờu t c l kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15 loi... chng oxy húa ca dch chit t 15 loi hi miờn vựng bin Vit Nam v hon thin quy trỡnh chit tỏch hot cht sinh hc chng oxy húa t hi miờn Mc tiờu nghiờn cu Kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca dch chit t 15. .. THUYN KHO ST HOT TNH CHNG OXY HểA CA DCH CHIT T 15 LOI HI MIấN VNG BIN VIT NAM V HON THIN QUY TRèNH CHIT TCH HOT CHT SINH HC CHNG OXY HểA T HI MIấN LUN VN THC S Ngnh: Mó s: Quyt nh giao ti: Cụng