HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ HOA THIẾT KẾ CẤU TRÚC CRISPR/CAS9 VÀ SỬ DỤNG TẠO ĐỘT BIẾN GEN ALCOHOL DEHYDROGENASE TRÊN CÀ CHUA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy TS Đồng Huy Giới NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Thị Hoa i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nỗ lực phấn đấu thân, tơi nhận nhiều hướng dẫn, giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân, tập thể đơn vị Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo TS Nguyễn Thị Thanh Thủy - Vụ Trưởng vụ Khoa học Công nghệ thầy TS Đồng Huy Giới – Trưởng môn Sinh học dành nhiều thời gian, tâm huyết, bảo, hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Roland Schaftleitner – Trưởng môn Chọn giống phân tử-AVRDC trao cho hội quý giá học tập nghiên cứu Trung tâm Rau màu Thế giới - Đài Loan, người kiên nhẫn dạy tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập Đài Loan Tôi xin cảm ơn đồng nghiệp trung tâm rau màu giới động viên ủng hộ giúp hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Tài nguyên thực vật tạo hội để tiếp cận với hướng nghiên cứu tích lũy kinh nghiệm, kiến thức để có kết Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo tơi suốt thời gian qua Lời cuối, xin bày tỏ lòng biết ơn tới người thân gia đình ln bên tơi, chăm sóc, động viên tơi toàn thể bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ tơi Mặc dù tơi có nhiều cố gắng hồn thiện luận văn tất nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp quý báu quý thầy cô bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Thị Hoa ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thuyết khoa học 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa khoa học Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Chọn giống trồng 2.1.1 Chọn giống phương pháp lai 2.1.2 Chọn giống phương pháp đột biến 2.1.3 Cây trồng chuyển gen 2.2 Công nghệ chỉnh sửa hệ gen (genome-editing) 2.2.1 Công cụ Zinc finger nucleases (ZFNs) 2.2.2 Công cụ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) 2.2.3 Công cụ CRISPR/Cas9 10 2.3 Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 10 2.3.1 Sự đời CRISPR/Cas 10 2.3.2 Cấu trúc hệ thống CRISPR/Cas 12 2.3.3 Cơ chế hoạt động hệ thống Crispr/cas9 14 2.3.4 Thành tựu nghiên cứu hệ thống CRISPR/Cas9 15 2.4 Gen alcohol dehydrogenase (AHD) cà chua 16 2.5 Tiềm nghiên cứu tạo đột biến cripsr cas9 cà chua 17 iii Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 3.2 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 19 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Thiết kế gRNA 19 3.3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR cas9 20 3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A tumefaciens sốc nhiệt (Van Eck, Conlin et al., 2007) 22 3.3.4 Chuyển cấu trúc CRISPR/cas9 vào cà chua thông qua A tumefaciens 24 3.3.5 Xác định đột biến tạo cấu trúc CRISPR/cas9 27 Phần Kết thảo luận 30 4.1 Kết 30 4.1.1 Thiết kế gRNA đặc hiệu cho gen mục tiêu ADH2-4 ADH2-6 30 4.1.2 Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 33 4.1.3 Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A tumefaciens (GV3101::pMP90) 36 4.1.4 Kết chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua 38 4.1.5 Khảo sát đột biến chuyển gen 41 4.2 Thảo luận 49 Phần Kết luận kiến nghị 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 Tài liệu tham khảo 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CRISPR/Cas9 Clustered regularly interspaced short palindormic repeat/Cas9 ZFN Zinc finger nucleases GMO Genetically Modified Organisms Cây chuyển gen ODM Oligonucleotide directed mutagenesis Oligonucleotide gây đột biến gRNA guideRNA RNA dẫn đường ADH Alcohol dehydrogenase Gen alcohol dehydrogenase TALENs Transcription activator-like effector nucleases Hoạt hóa phiên mã giống nuclease NHEJ Non-homology end joining Cơ chế sửa chữa đầu cuối không tương đồng HDR Homology-directed repair Sửa chữa tương đồng trực tiếp DSB Double-strand break Phá vỡ sợi kép EEN Enzyme endonucleases (EENs RNAi RNA interference Can thiệp RNA PAM Protospacer-Adjacent Motif Dạng trình tự liền kề tracrRNA Trans-activating crRNA Tiền RNA hoạt động sgRNA Single-guideRNA RNA dẫn đường đơn v Trình tự xếp kiểu lặp lại ngắn xen lẫn khoảng trống DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các trình tự PAM ứng với biến thể enzyme Cas9 13 Bảng 4.1 Danh sách guideRNA thiết kế cho gen ADH2-6 31 Bảng 4.2 gRNA enzyme cắt giới hạn cho gen ADH2-4 ADH2-6 32 Bảng 4.3 Mồi thiết kế khuếch đại vùng gen đích 33 Bảng 4.4 Số khuẩn lạc/1 đĩa môi trường nồng độ Kanamycine 35 Bảng 4.5 Kết chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua 39 Bảng 4.6 Danh sách mẫu mang đột biến ADH2-4 43 Bảng 4.7 Danh sách mẫu mang đột biến cấu trúc ADH2-6 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc Zinc finger nucleases chế sửa chữa qua trung gian Hình 2.2 Cấu trúc Zinc finger nucleases (ZFNs) Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) Hình 2.3 a)một locus CRISPR nhiễm sắc thể vi khuẩn với đặc trưng đoạn lặp-khoảng trống b) Vi khuẩn nhận biết trình tự PAM bên virus/plasmid hợp nucleic acid ngoại lai 11 Hình 2.4 Cấu trúc hệ thống CRISPR/Cas9 13 Hình 2.5 Mơ tả chế sửa chữa mạch kép bị cắt enzyme Cas9 14 Hình 2.6 Biểu đồ cơng bố khoa học CRISPR/Cas9 theo năm 15 Hình 2.7 Cơ chế xúc tác enzyme ADH 17 Hình 3.1 Giao diện chương trình CCTop để thiết kế gRNA 20 Hình 3.2 Sơ đồ vector pKSE401 20 Hình 3.3 Minh họa gRNA gen mục tiêu 27 Hình 4.1 Giao diện chương trình Cas9 Designer thiết kế gRNA 31 Hình 4.2 Xác định gRNA đặc hiệu gen ADH2-4 32 Hình 4.3 Vị trí guideRNA mồi PCR gen ADH2-6 32 Hình 4.4 Cấu trúc vector pCAMBIA pKSE401 34 Hình 4.5 Vector pKSE401 trước sau biến nạp gRNA 35 Hình 4.6 Kiểm tra vector tái tổ hợp môi trường chọn lọc kanamycine nồng độ 25, 50 100 mg/l gel agarose 1% a) cấu trúc ADH24 b) cấu trúc ADH2-6 36 Hình 4.7 Cấy chang vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 37 Hình 4.8 Kết kiểm tra plasmid tách từ vi khuẩn A tumefaciens sau biến nạp 37 Hình 4.9 Các chồi tái sinh có sức sống 38 Hình 4.10 Quy trình biến nạp tái sinh cấu trúc ADH2-4 ADH2-6 cà chua CLN1621 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 40 Hình 4.11 Kiểm tra chất lượng DNA gel agarose1% 41 Hình 4.12a Minh họa hoạt động enzyme cắt giới hạn gen đích 42 Hình 4.13 Kiểm tra đột biến gen ADH2-4 enzyme cắt giới hạn 42 vii Hình 4.14 Trình tự đột biến nu gen ADH2-4 44 Hình 4.15 Trình tự đột biến chèn nu gen ADH2-4 44 Hình 4.16 Dự đốn thay đổi trình tự amino acid gen ADH2-4 45 Hình 4.17 Các mẫu cà chua mang đột biến gen ADH2-4 45 Hình 4.18 Minh họa phương pháp khảo sát đột biến 46 Hình 4.19 Kết PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen ADH2-6 46 Hình 4.20 Kết cắt enzyme cắt giới hạn AflII 47 Hình 4.21 Kết giải trình tự mẫu đột biến gen ADH2-6 47 Hình 4.22 Kết PCR số 43 cấu trúc ADH2-6 48 Hình 4.23 Dự đốn thay đổi trình tự amino acid cấu trúc ADH2-6 49 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Hệ thống CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindormic Repeat) cas9 công nghệ lĩnh vực sửa chữa hệ gen Nghiên cứu thử nghiệm thành công hệ thống CRIPSR/Cas9 cảm ứng gây đột biến gen mục tiêu thuộc họ Alcohol dehydrogenase cà chua Hai guideRNA (gRNA) thiết kế bổ sung với trình tự gen đích để đưa enzyme Cas9 tới xác vị trí mong muốn để chỉnh sửa Cơ chế tự sửa chữa tế bào đưa phương án khôi phục lại sai hỏng enzyme cas9 gây tạo đột biến gen mục tiêu Hệ thống CRISPR/Cas9 thiết kế cho gen ADH nhiễm sắc thể thứ nhiễm sắc thể thứ hệ gen cà chua Hai cấu trúc tương ứng với gen chuyển nạp vào cà chua dòng CLN1621 (AVRDC) Sau sàng lọc kháng sinh kanamycine, 132 chồi tái sinh từ 1844 mẫu Trong số đó, đột biến xác định đột biến nu: phổ biến từ đến nu, đặc biệt có đột biến 55 nu, chèn đột biến thay nucleotid Kết 08 tái sinh mang đột biến tiếp tục trồng nhà lưới để thu hạt, đánh giá khả di truyền đột biến tạo hệ thống CRIPSR/Cas9 Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến vùng gen Alcohol dehydrogenase, cung cấp sở cho ứng dụng tiềm công cụ chỉnh sửa gen sau này, không cà chua mà nhiều giống trồng khác ix đối chứng CLN1621, vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn biến mẫu 28-1-2 Do đó, việc thiết kế gRNA mang trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn kề trình tự PAM khơng mang lại hiệu cao cho việc xác định đột biến enzyme cắt giới hạn Bên cạnh đó, đột biến 28-1-1, 24-1-2 đột biến 5nu giải thích băng nhỏ sản phẩm cắt sử dụng enzyme hình 4.13 Hình 4.14 Trình tự đột biến nu gen ADH2-4 Hình 4.15 Trình tự đột biến chèn nu gen ADH2-4  Dự đốn thay đổi trình tự amino acid Đột biến xảy làm thay đổi trình tự nucleotide vốn có, kéo theo thay đổi amino acid mà gen mã hóa Sử dụng phần mềm BioEdit.v7.2.5, trình tự mang đột biến dịch mã dự đoán ảnh hưởng đến chức gen mà hệ thống CRISPR/Cas9 tạo Kết trình bày hình 16 cho thấy đột biến gen ADH2-4 dẫn đến thay đổi amino acid, ra, sớm xuất mã ba kết thúc Mặc dù nghiên cứu này, không sâu vào nghiên cứu chức gen, việc xuất sớm mã ba kết thúc chắn phần ảnh hưởng tới chức gen 44 Hình 4.16 Dự đốn thay đổi trình tự amino acid gen ADH2-4 Hình 4.17: Các mẫu cà chua mang đột biến gen ADH2-4 4.1.5.2 Khảo sát đột biến cấu trúc ADH2-6 * Sử dụng kỹ thuật PCR Khảo sát đột biến tương tự gen ADH2-4, thiết kế mồi đặc hiệu ADH2-6F/R khuếch đại vùng gen đích, sử dụng enzyme cắt giới hạn AflI gRNA cắt sản phẩm PCR thành băng 88bp 136bp (hình 4.18) 45 Hình 4.18 Minh họa phương pháp khảo sát đột biến Thí nghiệm gen ADH2-6, chúng tơi thu 56 tái sinh chăm sóc nhà lưới Tiến hành tách DNA kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu ADH2-6F/R thu kết hình 4.19: Hình 4.19 Kết PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen ADH2-6 Kết cho thấy mẫu số 43, 1, 10 có băng khác biệt, khác với mẫu đối chứng (-) CLN1621 Trong tổng số 56 tái sinh, thu 4/56 mẫu xác định có khả mang đột biến nhờ phương pháp PCR Chúng tiếp tục tiến hành thí nghiệm sử dụng enzyme cắt giới hạn tìm kiếm đột biến gen ADH2-6  Sử dụng enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn AflII hoạt hóa nhiệt độ 370C 4h phản ứng hồn toàn với sản phẩm PCR gen ADH2-6 Trên kết trình bày hình 4.19, số băng lớn sản phẩm PCR tồn gel acrylamide 6% sản phẩm cắt Vì vậy, khả xảy đột biết làm biến vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn xảy Cụ thể, sản phẩm PCR mẫu số 43 có băng xuất với kích thước xấp xỉ 170bp băng giữ nguyên sau tiến hành cắt enzyme cắt giới hạn Với mẫu có nhiều băng sản phẩm PCR, buộc phải tiến hành tách băng riêng biệt phương pháp cắt gel 46 sử dụng kỹ thuật clone (Tesniere and Verries 2000) để giải trình tự riêng rẽ băng Hình 4.20: Kết cắt enzyme cắt giới hạn AflII  Giải trình tự Các băng sản phẩm PCR không đặc hiệu vị trí tương đối gần nhau, q trình cắt gel tách băng khó khăn khơng đảm bảo thu tồn băng phụ Dù vậy, chúng tơi thu số kết khả quan đột biến xảy gen ADH2-6 Kết giải trình tự trình bày hình 4.21 Hình 4.21 Kết giải trình tự mẫu đột biến gen ADH2-6 Chúng thu đột biến xuất tái sinh Đặc biệt, mẫu số 43, chúng tơi tìm thấy đột biến cây, đột biến đoạn từ 2bp đến 56bp 47 Hình 4.22 Kết PCR số 43 cấu trúc ADH2-6 Hiện tượng có nhiều đột biến gen nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến dạng khảm tế bào trình phát sinh từ mơ sẹo hay gọi tượng “chimeric”(Wenzler, Mignery et al., 1989) Do đó, tác động CRISPR/Cas9, tái sinh chứa loại đột biến Các mẫu 1, 7, 10 chứa đột biến đoạn Trong đột biến thu cấu trúc ADH2-6 có đột biến đột biến đoạn, đột biến đột biến thay liệt kê bảng 4.7 Bảng 4.7 Danh sách mẫu mang đột biến cấu trúc ADH2-6 STT Mẫu Loại đột biến 1M 1u 10 43-2 43-3 43-4 Mất nu Mất 13 nu Mất nu Mất nu Mất nu Mất nu Mất 38nu 43-5 Mất 55 nu 43-1 Đột biến thay nucleotide Các nu bị chỉnh sửa/bị CTC ATATGTAGCCTC AGCCTCTT CTC TC AGCCTCT TGTAGCCTCTTAAGGATTAA CACTGACAGGGGAGTGA AAGAAAGCAATATGTGTAGC CTCTTAAGGATTAACACTGA CAGGGGAGTGATGCTT TC Vị trí so với trình tự PAM Trước nu Trước nu Trước nu Trước nu Trước nu Trước nu Xóa trình tự PAM Xóa trình tự PAM Trước 15nu  Dự đốn thay đổi trình tự amino acid Phần mềm BioEdit.v7.2.5 xác định mẫu mang đột biến có trình tự amino acid thay đổi Trong có đột biến xuất ba mã kết thúc sớm 48 Đột biến thay mẫu số 43-1 làm đột biến câm, trình tự amino acid dự dốn khơng có thay đổi Hình 4.23 Dự đốn thay đổi trình tự amino acid cấu trúc ADH2-6 4.2 THẢO LUẬN Cà chua loài trồng quan trọng Việt Nam giới Ngày nay, toàn hệ gene chức gen cơng bố cách rõ ràng, vậy, cà chua thích hợp mơ hình, đại diện cho mầm (Sato 2012) Sàng lọc đột biến xác định cần thiết để nghiên cứu chức gen nâng cao chất lượng trồng Tuy nhiên, trình nhiều thời gian hiệu chưa cao CRISPR/Cas9 – công cụ chỉnh sửa hệ gen trồng hệ giải tối đa trở ngại kể Kể từ nghiên cứu thành cơng lồi cá vằn, hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng rộng rãi động thực vật máy đơn giản, hiệu linh hoạt (Mao, Zhang et al., 2013; Sugano, Shirakawa et al., 2014) Năm 2014, CRISPR/cas9 lần áp dụng cà chua, chỉnh sửa gen Argonaute7 (Slago7) (Brooks, Nekrasov et al., 2014; Ron, Kajala et al., 2014) Trong nghiên cứu này, lần chứng minh hiệu hệ thống CRISPR/Cas9 cà chua thông qua gen ADH2-4 ADH2-6 Thiết kế gRNA gen Alcohol dehydrogenase công cụ tin sinh đem lại lợi lớn liệu cập nhật liên tục, vậy, gRNA thiết kế đặc hiệu cho gen đích, tránh nguy gRNA bắt cặp với gen khác làm chức gen Để thiết kế gRNA hiệu quả, cần đảm bảo gRNA hướng đến xác gen đích hạn chế tối đa bắt cặp không đặc hiệu làm ảnh hưởng tới gen khác hệ gen cần quan tâm đến tiêu chí sau: - Tính trình tự bổ sung với gRNA hệ gen - Vị trí trình tự PAM (Protospacer adjacent motif) 49 - %AT gRNA khoảng từ 40-60% - gRNA nằm vùng mã hóa protein Các đột biến gen alcohol dehydrogenase cà chua chứng minh đột biến không gây chết (Wisman, Koornneef et al., 1991) dễ dàng tồn mơi trường chứa alcohol Tuy nhiên, nghiên cứu này, tiến hành chọn lọc nhờ vào gen kháng kanamycine 50mg/L đạt hiệu tới 99% Việc lựa chọn promoter kiểm soát biểu gRNA cas9 quan trọng Ở thực vật, promoter EF1A, CMV, UBO nhiều nghiên cứu sử dụng để điều khiển enzyme cas9 promoter RNA III U26 biểu cho gRNA (Belhaj, Chaparro-Garcia et al., 2013) Vì vậy, chúng tơi lựa chọn vector pKSE401 (Xing, Dong et al., 2014) mang promoter CMV35S RNAIII U26 Ngoài ra, vector pKSE401 chứa vị trí nhận diện enzyme cắt giới hạn BsaI enzyme có giá tương đối thấp so với enzyme RNAIII khác, 1/50 giá enzyme AarI Sử dụng enzyme BsaI mở vector pKSE401 chúng tơi biến nạp hay nhiều gRNA Cas9 nhiều nghiên cứu cho thấy xu hướng cắt vị trí trước trình tự PAM 3-4 nu (Osakabe, Osakabe et al., 2008; Jia and Wang 2014; Ron, Kajala et al., 2014) Do dó, chúng tơi thiết kế thí nghiệm sử dụng enzyme cắt giới hạn phát đột biến cách chọn enzyme có vị trí cắt trước trình tự PAM nu gen ADH2-6 enzyme có vị trí cắt trước trình tự PAM gen ADH2-4 Kết lần khẳng định rằng, enzyme cas9 đa số cắt vị trí dự đốn cách trình tự PAM từ đến nu Tuy nhiên, số đột biến đoạn lớn xảy làm biến trình tự PAM nên khó xác định xác vị trí cắt enzyme cas9 Sau cùng, nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự để xác định cụ thể diễn biến xảy gen đích tác dụng CRISPR/Cas9 Một số phương pháp giúp sàng lọc đột biến mang lại hiệu cao sử dụng enzyme CelI phát bắt cặp không tương đồng sợi DNA kép điều kiện có hạn thử nghiệm phần nhỏ không đề cập luận văn (Colasuonno, Incerti et al., 2016) Dựa vào chế tự sửa chữa tế bào NHJE, xảy đột biến, thường thu đột biến nu (thường từ đến 3,4 nu, lên đến 55 50 nu) Kết tương tự xảy thí nghiệm sử dụng CRISPR/Cas9 gây đột biến gen RIN cà chua (Ito, Nishizawa-Yokoi et al., 2015) Nghiên cứu kết hợp hoạt động guideRNA cho thấy hầu hết đột biến đoạn Ngồi ra, tính di truyền đột biến chứng minh qua loạt báo cáo gần (Doyon, McCammon et al., 2008; Jiang, Zhou et al., 2013; Colasuonno, Incerti et al., 2016) Kết nghiên cứu luận văn bước khởi đầu cho việc ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 chọn tạo giống cà chua giống trồng nói chung Bên cạnh việc khẳng định thêm tính hữu dụng hệ thống theo công bố trước đó, chúng tơi bổ sung thêm chứng chế hoạt động CRISPR/Cas9 phương pháp phát đột biến xảy gen đích 51 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Đã thiết kế thành công gRNA tạo vector tái tổ hợp mang hệ thống CRISPR/Cas9 cho gen ADH2-4 ADH2-6 với dòng vi khuẩn mang vector Agrobacterium tumefaciens GV3101::pMP90 - Đề tài biến nạp tái sinh thành công cấu trúc CRISPR/Cas9 ADH2-4 ADH2-6 gây đột biến hiệu gen Alcohol dehydrogenase cà chua CLN1621 thông qua vi khuẩn A tumefaciens - Hầu hết đột biến thu chủ yếu đột biến nu, số đột biến chèn đột biến điểm Các đột biến làm thay đổi trình tự amino acid, 50% đột biến tạo mã kết thúc 5.2 KIẾN NGHỊ Kết bước đầu nghiên cứu khả quan, nhiên thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tơi mong muốn tiếp tục phát triển nghiên cứu qua kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen cà chua gen khác mang nhiều ý nghĩa thực tiễn gen chống úng, gen kháng virus… - Đánh giá biểu gen đột biến kiểu sức sống cây, mức độ ổn định di truyền đột biến - Thử nghiệm khả chỉnh sửa đa gen cấu trúc thiết kế lúc gen ADH2-4 ADH2-6 cà chua 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đồng, Đ X (2011) "Nghiên cứu quy trình tái sinh hệ thống chuyển gen cà chua (lycopersicon esculentum Mill.) Việt Nam." Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(2): 217-223 Lê Tấn Đức, P Đ T., Nguyễn Hữu Hổ, Hà Trần Minh Dũng, Dương Thị Ngọc Thi (2012) "Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu crylAb vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens." Tạp chí Sinh học (34) Tiếng Anh: Alka, K., H J Windle, et al (2013) "A short chain NAD (H)-dependent alcohol dehydrogenase (HpSCADH) from Helicobacter pylori: a role in growth under neutral and acidic conditions." The international journal of biochemistry & cell biology 45(7) pp 1347-1355 Ban, Y., C Honda, et al (2007) "Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin." Plant and cell physiology 48(7) pp 958-970 Belhaj, K., A Chaparro-Garcia, et al (2013) "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system." Plant methods 9(1) Bicsak, T A., L R Kann, et al (1982) "Tomato alcohol dehydrogenase: purification and substrate specificity." Archives of biochemistry and biophysics 216(2) pp 605-615 Boch, J and U Bonas (2010) "Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function." Phytopathology 48(1) pp 419 Bogdanove, A J and D F Voytas (2011) "TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting." Science 333(6051) pp 1843-1846 Brooks, C., V Nekrasov, et al (2014) "Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system." Plant physiology 166(3) pp 1292-1297 10 Cathomen, T and J K Joung (2008) "Zinc-finger nucleases: the next generation emerges." Molecular Therapy 16(7) pp 1200-1207 11 Chase Jr, T (1999) "Alcohol dehydrogenases: identification and names for gene families." Plant Molecular Biology Reporter 17(4) pp 333-350 12 Colasuonno, P., O Incerti, et al (2016) "DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population." BMC genetics 17(1): 53 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Dirks, R., K Van Dun et al (2009) "Reverse breeding: a novel breeding approach based on engineered meiosis." Plant biotechnology journal 7(9) pp 837-845 Doudna, J A and E Charpentier (2014) "The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9." Science 346(6213): 1258096 Doyon, Y., J M McCammon et al (2008) "Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases." Nature biotechnology 26(6) pp 702-708 Engler, C., M Youles et al (2014) "A golden gate modular cloning toolbox for plants." ACS synthetic biology 3(11) pp 839-843 Feng, Z., B Zhang et al (2013) "Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system." Froger, A and J E Hall (2007) "Transformation of plasmid DNA into E coli using the heat shock method." Journal of visualized experiments: JoVE(6) Garabagi, F and J Strommer (2004) "Distinct genes produce the alcohol dehydrogenases of pollen and maternal tissues in Petunia hybrida." Biochemical genetics 42(5-6) pp 199-208 Godde, J S and A Bickerton (2006) "The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes." Journal of Molecular evolution 62(6) pp 718-729 González-Agüero, M., S n Troncoso et al (2009) "Differential expression levels of aroma-related genes during ripening of apricot (Prunus armeniaca L.)." Plant Physiology and Biochemistry 47(5) pp 435-440 Groschel, S., M A Sanders et al (2014) "A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia." Cell 157(2) pp 369-381 Hoog, J.-O., P Stromberg et al (2003) "The mammalian alcohol dehydrogenases interact in several metabolic pathways." Chemico-biological interactions 143 pp 175-181 Hsu, P D., D A Scott et al (2013) "DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases." Nature biotechnology 31(9) pp 827-832 Iaria, D L., L Bruno, et al (2012) "The aroma biogenesis-related Olea europaea ALCOHOL DEHYDROGENASE gene is developmentally regulated in the fruits of two O europaea L cultivars." Food research international 49(2) pp 720-727 Ito, Y., A Nishizawa-Yokoi, et al (2015) "CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the RIN locus that regulates tomato fruit ripening." Biochemical and Biophysical Research Communications 467(1) pp 76-82 Jansen, R., J Embden et al (2002) "Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes." Molecular microbiology 43(6) pp 1565-1575 54 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Jia, H and N Wang (2014) "Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA." PloS one 9(4): e93806 Jiang, W., H Zhou et al (2013) "Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNAmediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice." Nucleic acids research: gkt780 Jinek, M., K Chylinski et al (2012) "A programmable dual-RNA“guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Science 337(6096): 816-821 Jornvall, H., J Hedlund et al (2013) "Origin and evolution of medium chain alcohol dehydrogenases." Chemico-biological interactions 202(1): 91-96 Joung, J K and J D Sander (2013) "TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing." Nature reviews Molecular cell biology 14(1) pp 49-55 Khan, A J., Q Husain et al (2010) "Association of polymorphism in alcohol dehydrogenase and interaction with other genetic risk factors with alcoholic liver cirrhosis." Drug and alcohol dependence 109(1) pp 190-197 Kim, Y.-J., J.-S Shim et al (2009) "Isolation and characterization of a novel short-chain alcohol dehydrogenase gene from Panax ginseng." BMB reports 42(10) pp 673-678 Komatsu, S., D Thibaut et al (2011) "Characterization of a novel flooding stress-responsive alcohol dehydrogenase expressed in soybean roots." Plant molecular biology 77(3) pp 309-322 Kumar, S., L L Sandell et al (2012) "Alcohol and aldehyde dehydrogenases: retinoid metabolic effects in mouse knockout models." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1821(1) pp 198-205 Li, J.-F., J E Norville et al (2013) "Multiplex and homologous recombinationmediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9." Nature biotechnology 31(8) pp 688-691 Li, T., B Liu et al (2012) "High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice." Nature biotechnology 30(5) pp 390-392 Longhurst, T J., H F Tung et al (1990) "Developmental regulation of the expression of alcohol dehydrogenase in ripening tomato fruits." Journal of Food Biochemistry 14(6) pp 421-433 Lor, V S., C G Starker et al (2014) "Targeted mutagenesis of the tomato PROCERA gene using transcription activator-like effector nucleases." Plant physiology 166(3) pp 1288-1291 Ma, M., A Y Ye et al (2013) "A guide RNA sequence design platform for the CRISPR/Cas9 system for model organism genomes." BioMed research international 2013 55 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 ManrÃ-quez, D., I El-Sharkawy et al (2006) "Two highly divergent alcohol dehydrogenases of melon exhibit fruit ripening-specific expression and distinct biochemical characteristics." Plant molecular biology 61(4-5) pp 675-685 Mao, Y., H Zhang et al (2013) "Application of the CRISPR–Cas system for efficient genome engineering in plants." Molecular plant 6(6) pp 2008 Meng, X., M B Noyes et al (2008) "Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases." Nature biotechnology 26(6): 695-701 Moummou, H., L B Tonfack et al (2012) "Functional characterization of SlscADH1, a fruit-ripening-associated short-chain alcohol dehydrogenase of tomato." Journal of plant physiology 169(15) pp 1435-1444 Nekrasov, V., B Staskawicz et al (2013) "Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease." Nature biotechnology 31(8) pp 691-693 Nordborg, M and D Weigel (2008) "Next-generation genetics in plants." Nature 456(7223) pp 720-723 Osakabe, K., Y Osakabe et al (2008) "Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases." Proceedings of the National Academy of Sciences 107(26) pp 12034-12039 Pabo, C O., E Peisach et al (2001) "Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins." Annual review of biochemistry 70(1) pp 313-340 Pathuri, I P., I E Reitberger et al (2011) "Alcohol dehydrogenase of barley modulates susceptibility to the parasitic fungus Blumeria graminis f sp hordei." Journal of experimental botany: err017 Pavletich, N P and C O Pabo (1991) "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A." Science 252(5007): 809-817 Peng, J., D E Richards et al (1999) ""Green revolution" genes encode mutant gibberellin response modulators." Nature 400(6741) pp 256-261 Perez, E E., J Wang et al (2008) "Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases." Nature biotechnology 26(7) pp 808-816 Perry, D J and G R Furnier (1996) "Pinus banksiana has at least seven expressed alcohol dehydrogenase genes in two linked groups." Proceedings of the National Academy of Sciences 93(23) pp 13020-13023 Plapp, B V., A T.-I Lee et al (2013) "Bradykinetic alcohol dehydrogenases make yeast fitter for growth in the presence of allyl alcohol." Chemico-biological interactions 202(1) pp 104-110 Ran, F A., P D Hsu et al (2013) "Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system." Nature protocols 8(11) pp 2281-2308 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 Ron, M., K Kajala et al (2014) "Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model." Plant physiology 166(2) pp 455-469 Sander, J D., L Cade et al (2011) "Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs." Nature biotechnology 29(8) pp 697 Sato (2012) "The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution." Nature 485(7400) pp 635-641 Sawai, S., K Ohyama, et al (2014) "Sterol side chain reductase is a key enzyme in the biosynthesis of cholesterol, the common precursor of toxic steroidal glycoalkaloids in potato." The Plant Cell 26(9) pp 3763-3774 Shan, Q., Y Wang et al (2013) "Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system." Nature biotechnology 31(8) pp 686-688 Shu, Q Y (2009) "Turning plant mutation breeding into a new era: molecular mutation breeding." Induced plant mutations in the genomics era FAO, Rome pp 425-427 Shukla, V K., Y Doyon et al (2009) "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases." Nature 459(7245) pp 437-441 Singh, R K., V A Sane et al (2010) "Differential expression of the mango alcohol dehydrogenase gene family during ripening." Phytochemistry 71(13) pp 1485-1494 Small, R L and J F Wendel (2000) "Copy number lability and evolutionary dynamics of the Adh gene family in diploid and tetraploid cotton (Gossypium)." Genetics 155(4) pp 1913-1926 Sorek, R., C M Lawrence et al (2013) "CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea." Annual review of biochemistry 82 pp 237-266 Strommer, J (2011) "The plant ADH gene family." The Plant Journal 66(1) pp 128-142 Sugano, S S., M Shirakawa et al (2014) "CRISPR/Cas9 Mediated Targeted Mutagenesis in the Liverwort Marchantia polymorpha L." Plant and cell physiology: pcu014 Tanksley, S D (1979) "Linkage, chromosomal association, and expression of Adh-I and Pgm-2 in tomato." Biochemical genetics 17(11-12) pp 1159-1167 Tanksley, S D and R A Jones (1981) "Effects of O2 stress on tomato alcohol dehydrogenase activity: description of a second ADH coding gene." Biochemical genetics 19(3-4) pp 397-409 Tesniere, C and C Verries (2000) "Molecular cloning and expression of cDNAs encoding alcohol dehydrogenases from Vitis vinifera L during berry development." Plant Science 157(1) pp 77-88 57 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 Tesson, L., C Usal et al (2011) "Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs." Nature biotechnology 29(8) pp 695-696 Thompson, C E., C u L Fernandes et al (2010) "Evaluation of the impact of functional diversification on Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, and Pinaceae alcohol dehydrogenase enzymes." Journal of molecular modeling 16(5) pp 919-928 Van der Oost, J., M M Jore et al (2009) "CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes." Trends in biochemical sciences 34(8) pp 401-407 Van Eck, J., B Conlin et al (2007) "Enhancing beta-carotene content in potato by RNAi-mediated silencing of the beta-carotene hydroxylase gene." American Journal of Potato Research 84(4) pp 331-342 Wang, Y., X Cheng et al (2014) "Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew." Nature biotechnology 32(9) pp 947-951 Wenzler, H C., G A Mignery et al (1989) "Analysis of a chimeric class-I patatin-GUS gene in transgenic potato plants: high-level expression in tubers and sucrose-inducible expression in cultured leaf and stem explants." Plant molecular biology 12(1) pp 41-50 Wisman, E., M Koornneef et al (1991) "Genetic and molecular characterization of an Adh-1 null mutant in tomato." Molecular and General Genetics MGG 226(1-2) pp 120-128 Wu, X., A J Kriz et al (2014) "Target specificity of the CRISPR-Cas9 system." Quantitative biology 2(2) pp 59-70 Wyman, C and R Kanaar (2006) "DNA double-strand break repair: all's well that ends well." Annu Rev Genet 40 pp 363-383 Xing, H.-L., L Dong et al (2014) "A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants." BMC plant biology 14(1): Yano, K., E Yamamoto et al (2015) "Genome-wide association study using whole-genome sequencing rapidly identifies new genes influencing agronomic traits in rice." Nature Genetics 48(8) pp 927-934 Zhang, H., J Zhang et al (2014) "The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation." Plant biotechnology journal 12(6) pp 797-807 Zheng, X., C Hu et al (2011) "Molecular evolution of Adh and LEAFY and the phylogenetic utility of their introns in Pyrus (Rosaceae)." BMC evolutionary biology 11(1): 58 ... enzyme cas9 gây tạo đột biến gen mục tiêu Hệ thống CRISPR/Cas9 thiết kế cho gen ADH nhiễm sắc thể thứ nhiễm sắc thể thứ hệ gen cà chua Hai cấu trúc tương ứng với gen chuyển nạp vào cà chua dòng CLN1621... truyền đột biến tạo hệ thống CRIPSR/Cas9 Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến vùng gen Alcohol dehydrogenase, cung cấp sở cho ứng dụng tiềm công cụ chỉnh sửa gen sau này, không cà chua mà... đổi gen làm biến chức khơng ảnh hưởng đến sinh tồn (Brooks et al., 2014) Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài nghiên cứu: Thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9 sử dụng tạo đột biến gen Alcohol dehydrogenase