TRNG I HC NHA TRANG VIN CễNG NGH SINH HC V MễI TRNG B MễN SINH HC -o0o - N TT NGHIP I HC NGHIấN CU THNH PHN LOI CUA GH SNG TNG Y KHNH HềA V PH YấN DA TRấN C IM HèNH THI V DI TRUYN GVHD : TS ng Thỳy Bỡnh SVTH : Nguyn Trỳc Sn MSSV : 55131540 Khỏnh Hũa: 06/2017 i LI CM N Trong sut quỏ trỡnh hc v hon thnh ỏn tt nghip ti Trng i Hc Nha Trang, tụi ó nhn c s quan tõm, giỳp tn tỡnh ca cỏc thy cụ, gia ỡnh v bn bố Nhõn õy tụi xin gi li chõn thnh cm n s giỳp quý bỏu ú Li u tiờn tụi xin chõn thnh cm n sõu sc ti TS ng Thỳy Bỡnh, ngi ó nh hng cng nh tn tỡnh hng dn, giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc hin ti ny Tụi xin chõn thnh cm n n thy cụ giỏo thuc Vin Cụng Ngh Sinh Hc v Mụi Trng Trng i Hc Nha Trang, nhng ngi ó truyn t kin thc v kinh nghim quý bỏu sut quỏ trỡnh hc ca nhng nm va qua Cui cựng, tụi xin gi li cm n chõn thnh ti gia ỡnh, bn bố v cỏc anh ch Phũng thớ nghim Sinh hc Phõn t ó quan tõm, giỳp v h tr tụi sut quỏ trỡnh thc hin ỏn tt nghip Tụi xin chõn thnh cm n! Nha Trang, thỏng 06 nm 2017 Sinh viờn Nguyn Trỳc Sn ii TểM TT Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn nm vựng khớ hu nhit i giú chu nh hng ca khớ hu i dng, cú ng b bin di v l ni cú nhiu vng vnh, m phỏ v nhiu o ln nh ng thi, hai khu vc a dng h sinh thỏi nh rn san hụ, rng ngp mn, m phỏ, t ú to iu kin thun li cho s phỏt trin ca cỏc loi sinh vt, c bit l cỏc loi cua gh sng tng ỏy Tuy nhiờn, hin tỡnh trng khai thỏc thy hi sn mt cỏch quỏ mc v thc trng ụ nhim mụi trng cựng vi bin i khớ hu ó lm suy gim a dng sinh hc cỏc loi sinh vt sng ỏy núi chung v cỏc loi cua gh núi riờng Nghiờn cu hin ti da trờn phng phỏp phõn loi v hỡnh thỏi v di truyn phõn loi mt s loi cua gh sng ỏy phõn b hai khu vc Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn Nghiờn cu phõn loi c 23 loi thuc 16 ging v 12 h, ú cú 14 loi phõn loi c hỡnh thỏi v di truyn, loi ch phõn loi bng hỡnh thỏi Trong s cỏc h m nghiờn cu ghi nhn c thỡ a dng nht l h Portunidae loi, tip n l h Xanthidae loi H Calappidae, Euryplacidae v Gonephacidae mi h cú loi Cỏc h cũn li u ch cú loi gm Galenidae, Dorippidae, Grapsidae, Leucosiidae, Macrophthalmidae, Carpiliidae v Gecarcinucidae Trỡnh t gen CO1 mtDNA c s dng kt hp vi mt s trỡnh t trờn Genbank xõy dng cõy phỏt sinh loi bng phng phỏp Nieghbor Joining vi giỏ tr bootstrap (BT) 1000 ln Cõy phỏt sinh loi cho thy s phõn tỏch di truyn ca h cua gh c phõn thnh nhúm chớnh: nhúm I (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae, Portunuidae) v nhúm II (Calappidae, Macrophthalmidae v Grapsidae) Trong ú, nhúm I phõn thnh nhúm ph gm nhúm I.1 (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae) v nhúm I.2 (Portunuidae) Nhúm II chia thnh nhúm gm nhúm II.1 (Calappidae) v nhúm II.2 (Macrophthalmidae v Grapsidae) iii MC LC LI CM N i TểM TT ii DANH MC HèNH .v DANH SCH CC T VIT TT viii M U CHNG TNG QUAN 1.1 Tng quan v vựng nghiờn cu .3 1.1.1 V trớ a lý, khớ hu v ti nguyờn thiờn nhiờn ca Khỏnh Hũa 1.1.2 V trớ a lý, khớ hu v ti nguyờn thiờn nhiờn ca Phỳ Yờn 1.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu a dng cỏc loi cua gh nc v th gii 1.3 ng dng k thut di truyn nghiờn cu a dng sinh hc cua gh 10 1.3.1 DNA ty th v nghiờn cu di truyn .10 1.3.2 ng dng k thut di truyn mó vch (DNA barcoding) nghiờn cu a dng sinh hc cua gh .12 1.3.3 Nghiờn cu mi quan h tin húa v phỏt sinh loi cua gh .14 CHNG VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 16 2.1 i tng, a im v phng phỏp thu mu 16 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 16 2.3 Phõn loi da vo hỡnh thỏi 17 2.4 Nghiờn cu di truyn cua gh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 18 2.4.1 Tỏch chit DNA, khuch i DNA bng k thut PCR v gii trỡnh t 18 2.4.2 Phõn tớch d liu v xõy dng mi quan h phỏt sinh chng loi 21 CHNG KT QU NGHIấN CU 24 3.1 Phõn loi v hỡnh thỏi 24 3.1.1 Thnh phn cỏc loi cua gh thu c ti tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 24 3.1.2 Bn phõn b cỏc loi cua gh nghiờn cu hin ti 26 iv 3.1.3 c im hỡnh thỏi cỏc loi cua gh thu ti Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 27 3.2 Nghiờn cu di truyn cỏc loi cua gh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 49 3.2.1 Tỏch chit DNA tng s .49 3.2.2 Khuch i, gii trỡnh t DNA cỏc loi cua gh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn.49 3.2.3 So sỏnh s khỏc bit trỡnh t gia cỏc loi cua gh nghiờn cu 50 3.2.4 So sỏnh s tng ng trỡnh t vi Genbank .52 3.2.5 Xõy dng cõy phỏt sinh loi cua gh ti Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 53 KT LUN V KIN NGH .57 TI LIU THAM KHO 58 PH LC v DANH MC HèNH Hỡnh 1.1 Bn tnh Khỏnh Hũa Hỡnh 1.2 Bn tnh Phỳ Yờn Hỡnh 1.3 DNA ty th ngi, bao gm 22 gen tRNA, gen rRNA v 13 vựng mó húa protein Mi tờn mu vng ch vựng gen CO1 mtDNA c s dng nghiờn cu hin ti 10 Hỡnh 2.1 Cỏc ch s o phõn loi cua gh 17 Hỡnh 2.2 Cỏc ch tiờu m phõn loi cua gh .18 Hỡnh 2.3 Chu trỡnh nhit phn ng PCR ca cp mi LCO 1490/HCO 2198 .20 Hỡnh 2.4 Chu trỡnh nhit phn ng PCR ca cp mi CF20/CR19 20 Hỡnh 3.1 Bn phõn b cỏc loi cua gh nghiờn cu hin ti 26 Hỡnh 3.2 c im hỡnh thỏi loi Charybdis natator 28 Hỡnh 3.3 c im hỡnh thỏi loi Charybdis acutifrons .29 Hỡnh 3.4 c im hỡnh thỏi loi Charybdis anisodon 30 Hỡnh 3.5 c im hỡnh thỏi loi Charybdis vadorum .31 Hỡnh 3.6 c im hỡnh thỏi loi Portunus gladiator 32 Hỡnh 3.7 c im hỡnh thỏi loi Podophthalmus vigil .33 Hỡnh 3.8 c im hỡnh thỏi loi Thalamita crenata 34 Hỡnh 3.9 c im hỡnh thỏi loi Atergatis floridus 36 Hỡnh 3.10 c im hỡnh thỏi loi Atergatis integerrimus 37 Hỡnh 3.11 c im hỡnh thỏi loi Liagore rubromaculata 38 Hỡnh 3.12 c im hỡnh thỏi loi Calappa pustulosa 39 Hỡnh 3.13 c im hỡnh thỏi loi Calappa lophos .40 Hỡnh 3.14 c im hỡnh thỏi loi Eucrate alcocki .41 Hỡnh 3.15 c im hỡnh thỏi loi Eucrate crenata 42 Hỡnh 3.16 c im hỡnh thỏi loi Carcinoplax longimanus .43 Hỡnh 3.17 c im hỡnh thỏi loi Carcinoplax purpurea 44 vi Hỡnh 3.18 Kt qu in di DNA tng s ca mt s loi cua gh .49 Hỡnh 3.19 Kt qu in di sn phm PCR on gen CO1 mtDNA ca mt s loi cua gh 49 Hỡnh 3.20 Cõy phỏt sinh loi t phng phỏp Neighbor Joining vi lp li 1000 ln da trờn gen CO1 mtDNA ca cỏc loi cua gh thu ti tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn .54 vii DANH MC BNG Bng 2.1 Trỡnh t cỏc on mi c s dng phn ng PCR 19 Bng 2.2 Thnh phn phn ng PCR 19 Bng 2.3 Trỡnh t gen CO1 mtDNA ca cỏc loi cua gh 22 Bng 3.1 Danh sỏch cỏc loi cua gh thu ti tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 24 Bng 3.2 Ch tiờu hỡnh thỏi cỏc loi cua gh tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 27 Bng 3.3 c im hỡnh thỏi ca loi cua gh ti Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn thuc ging v h 46 Bng 3.4 S khỏc bit v trỡnh t CO1 mtDNA ca 14 loi cua gh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn 51 Bng 3.5 Kt qu tng ng ca cỏc trỡnh t CO1 mtDNA t 14 loi cua gh thu tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn vi d liu t Genbank .52 viii DANH SCH CC T VIT TT bp Base pairs cm Centimeter CBOL Consortium for the Barcode of Life CO1 Cytochrome c oxidase subunit cvt Cng tỏc viờn BT Bootstrap àL Microliter DNA Deoxyribonucleic acid TTL Thc o t l mtDNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer tRNA Transfer ribonucleic acid GB Genbank g Gam NCHT Nghiờn cu hin ti PCR Polymerase Chain Reaction H3 Histone GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase PEPCK Phosphoenolpyruvate carboxykinase rbcL Ribulose bisphosphate carboxylase large chain matK MaturaseK M U a dng sinh hc ang tn ti hin trờn th gii l kt qu ca mt quỏ trỡnh lch s tin húa lõu di vi nhiu bc bin i, phỏt sinh, phỏt trin ri tuyt chng (ng Ngc Thanh v Nguyn Huy Yt, 2009) Do cỏc tỏc nhõn ca t nhiờn v gn õy l s tỏc ng ca ngi lm cho a dng sinh hc ang b suy thoỏi vi tc rt nhanh, cỏc ngun gen hoang dó cng ang trờn suy thoỏi nhanh v b suy gim mnh (Nguyn Minh Quang v ctv, 2011; Schmidt v ctv, 2012) Vit Nam cú tng din tớch vựng bin rng hn triu km2 v ng b bin di 3.260 km2, tri di trờn 15 v v nm vựng nhit i giú ụng Nam V trớ a lý cng nh nhng c trng v khớ hu, lch s phỏt trin a cht, thy lý húa hc ca nc bin ó to ni õy mt mụi trng sng riờng, liờn quan cht ch vi i sng sinh vt cng nh tớnh a dng sinh hc vựng bin ny (Lờ c T v ctv, 2009) Vỡ vy Vit Nam l mt nhng quc gia cú a dng sinh hc bin phong phỳ n nay, cỏc nh khoa hc ó phỏt hin cú khong trờn 11 nghỡn loi sinh vt sng vựng bin Vit Nam, ú cú 692 loi thc vt phự du, 657 loi ng vt phự, khong 2.109 loi cỏ vi trờn 100 loi cỏ kinh t, 653 loi rong bin, 14 loi c bin, 21 loi bũ sỏt bin, 21 loi thỳ bin (Nguyn Vn Chung v ctv, 2009) Cỏc loi ng vt ỏy ó bit khong 6.000 loi, ú ng vt thõn mm 2.500 loi, giun nhiu t 700 loi, rut khoang 650 loi, da gai 350 loi, hi miờn 150 loi, giỏp xỏc 1500 loi vi nhiu loi cua gh cú giỏ tr kinh t (Lờ c T v ctv, 2009) Ngoi ra, vi s lng loi ó bit, cỏc nh khoa hc v ngoi nc ỏnh giỏ bin Vit Nam l mt nhng trung tõm a dng sinh vt bin th gii Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn l hai tnh cú v trớ a lý nm k cú khớ hu nhit i giú chu nh hng ca khớ hu i dng, cú h sinh thỏi bin rt a dng, phong phỳ bc nht Vit Nam vi nhiu loi sinh vt cú giỏ tr kinh t Trong ú, nhiu loi cua, gh khu vc Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn l mt nhng ngun li hi sn cú mc phong phỳ, a dng v thnh phn loi, cú giỏ tr v thc phm v kinh t cao Tuy nhiờn, cỏc nghiờn cu a dng v giỏp xỏc núi chung v cỏc loi cua gh cũn mang tớnh cht riờng l, cha thng nht Ch yu l cỏc nghiờn cu ca Vừ S Tun v ctv (2005); Nguyn Vn Long v ctv (2014); Phan Th Kim Hng v ctv (2014); Hong ỡnh Trung v Nguyn Hu Nht (2016) Nhng nghiờn cu ny ch mang tớnh cht 56 loi, loi Charybdis acutifrons v Charybdis anisodon u cho thy mi quan h gn gi vi loi Charybdis feriatus GB vi giỏ tr sai khỏc ln lt l 10,4% v 11,2% (Ph lc 3) Nhúm II phõn thnh hai nhúm ph: Nhúm II.1 gm loi thuc h Calappidae v nhúm II.2 gm loi thuc h Macrophthalmidae v loi thuc h Grapsidae nhúm II.1, loi Calappa pustulosa cha cú trỡnh t CO1 mtDNA cp nht trờn Genbank, trờn cõy phỏt sinh loi cho thy mi quan h di truyn c th hin gn gi vi loi Calappa joponica GB vi giỏ tr sai khỏc di truyn 1,6% (Ph lc 4) Trong nghiờn cu hin ti, loi Calappa lophos cú v trớ nhỏnh gn vi loi Calappa calappa GB v Calappa clypeata GB, nghiờn cu da trờn gen ty th (16S rRNA v CO1) v gen nhõn (H3, 28S, Enolase) ca Wares v ctv (2016) cng cho thy mi quan h mt thit ca cỏc loi thuc ging Calappa nhúm II.2, loi Macrophthalmus latreillei thuc h Macrophthalmidae v loi Metopograpsus messor thuc h Grapsidae cú v trớ hai nhỏnh gn cho thy s gn gi v mt di truyn Tuy nhiờn, loi Macrophthalmus latreillei cú mt nh hp v khỏ di, mai, cỏc chõn bũ v cng u cú lụng mn rỡa, cũn loi Metopograpsus messor cú mt v hc mt ln, cỏc chõn bũ cú nhiu gai nhn xung quanh Do ú, mi quan h ny cú s khụng phự hp gia hỡnh thỏi v di truyn loi ny khụng cú cỏc c im ni bt bờn ngoi tng ng Cng nhúm II.2, loi Metopograpsus messor cha cp nht trỡnh t gen CO1 mtDNA trờn Genbank, cõy phỏt sinh loi th hin mi quan h gn gi vi Metopograpsus sp GB vi giỏ tr BT 100% V trớ loi Metopograpsus latifrons GB v Metopograpsus frontalis GB nm trờn mt nhỏnh phự hp theo nghiờn cu ca Ip v ctv (2015), ng thi khong cỏch di truyn ca loi ny gn vi loi Metopograpsus messor nghiờn cu hin ti nhỏnh thuc h Macrophthalmidae, loi Macrophthalmus latreillei (NCHT) th hin mi quan h gn vi cỏc loi cựng ging trờn Genbank gm Macrophthalmus japonicus, Macrophthalmus convexus, Macrophthalmus erato vi giỏ tr sai khỏc ln lt l 11,6%, 10% v 11,2% (Ph lc 5) 57 KT LUN V KIN NGH Kt lun Da trờn kt qu nghiờn cu, chỳng tụi a mt s kt lun nh sau: Thu thp v phõn loi c 23 loi cua gh sng ỏy thuc b, 12 h v 16 ging tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn Xõy dng d liu v c im hỡnh thỏi, phõn b, ng thi tin hnh khuch i on gen CO1 mtDNA ca 14/ 23 loi cua gh thu ti tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn, loi ch phõn loi bng hỡnh thỏi S khỏc bit di truyn ca 14 loi cua gh nm khong t 12% (60/500 nucleotide) n 20,4% (102/500 nucleotide) Trong ú, s khỏc bit nh nht l gia loi Astergatis floridus v Astergatis integerrimus, s khỏc bit ln nht l gia loi Charybdis anisodon v Macrophthalmus latreillei Xõy dng cõy phỏt sinh loi ca 14 loi cua gh thu ti tnh Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn kt hp vi 29 trỡnh t t Genbank Kt qu nghiờn cu cho thy s phõn tỏch rừ rt gia nhúm I (H Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae, Portunuidae) vi nhúm II (H Calappidae, Macrophthalmidae v Grapsidae) Kin ngh Kho sỏt chi tit hn v c im hỡnh thỏi, phõn b, a dng sinh hc ca cỏc loi cua gh sng ỏy Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn núi riờng v Vit Nam núi chung Cn cú cỏc nghiờn cu thờm v ng dng k thut di truyn mó vch (DNA barcoding) cho cụng tỏc phõn loi v nh danh cỏc loi cua gh ng thi, s dng thờm cỏc ch th phõn t khỏc nhm xỏc nh mi quan h tin húa v phỏt sinh chng loi cua gh sng ỏy Khỏnh Hũa v Phỳ Yờn, cng nh cỏc loi cua gh Vit Nam 58 TI LIU THAM KHO Ti liu ting vit: Lu Th Anh, Nguyn ỡnh K, H Qỳy Qunh v Nguyn Hoi Nam (2011) a dng sinh hc khu vc qun o Hũn Mờ Thanh Húa Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 5, pp 371 378 Nguyn Chớ Bn v Lờ Th Vnh (2003) a Phỳ Yờn Nh xut bn Chớnh tr quc gia Thỏi Thanh Bỡnh, Nguyn Vn Vit, Austin C., Trn Th Trang (2009) Nhn dng cỏc loi cua xanh (Scylla sp.) Vit Nam bng gii trỡnh t ADN ty th vựng gen CO1 Tp khoa hc v cụng ngh, 77 81 Tụn Tht Cht v Trn Th Minh Th (2011) Thnh phn loi, c im phõn b h cua bi (Portunidae) tnh Tha Thiờn Hu Tp sinh hc, 105 123 Nguyn Vn Chung, ng Ngc Thanh, Nguyn Tỏc An, Trng Ngc An, Nguyn Tin Cnh, Bựi ỡnh Chung, Phm Ngc ng, Nguyn Xuõn Dc, o Tn H, Phan Nguyờn Hng, Nguyn Khc Hng, Nguyn Quang Phỏch, Nguyn Trng Nho, Nguyn Hu Phng, Nguyn Vn Tin, Vừ S Tun, Nguyn Nht Thi v Nguyn Huy Yt (2009) Sinh vt v sinh thỏi bin Nh xut bn khoa hc t nhiờn v cụng ngh Nguyn Tng Cng, Vn T, Lờ Danh Minh v ng Vn ụng (2015) Thnh phn loi tụm v cua nc ngt quc gia Phong Nha-K Bng, tnh Qung Bỡnh Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 6, pp 493-497 Trng Vn n, Vừ iu, H Th Thu Hoi v Ngụ Th Hng Giang (2010) Nghiờn cu khu h ng vt ỏy khu vc Hi Võn Sn Ch phc v cụng tỏc xõy dng khu bo tn bin Sn Ch Hi Võn B mụn Qun lớ mụi trng v ngun li thy sn trng i hc Nụng Lõm Hu, pp Nguyn Minh Hnh (2016) Thc trng v gii phỏp bo v ngun li thy sn vựng t ngp nc ven bin tnh Phỳ Yờn Tp mụi trng, 6, pp.32 Phan Th Kim Hng, Ha Thỏi Tuyn, Nguyn An Khang v o Tn Ngc (2014) ng vt ỏy vnh Võn Phong, tnh Khỏnh Hũa Tuyn nghiờn cu bin, pp 89 103 59 10 Nguyn Vn Long, Vừ S Tun, Phan Kim Hong, Ha Thỏi Tuyn, Nguyn An Khang, Thỏi Minh Quang, Phan Th Kim Hng (2014) H sinh thỏi rn san hụ vnh Võn Phong, tnh Khỏnh Hũa tỡnh trng v gii phỏp qun lớ Tuyn nghiờn cu bin, pp 121-134 11 Giang Nam v Nguyn Vn Khỏnh (2003) a Khỏnh Hũa Nh xut bn Chớnh tr quc gia 12 Vn Nhng (2003) Dn liu bc u v cua (Brachyura) rng ngp mn Cn Gi, thnh ph H Chớ Minh Tp sinh hc, 25(4): 10 13 Vn Nhng v Hong Ngc Khc (2004) Dn liu bc u v cỏc loi cua rng ngp mn vựng ca sụng Hng Tp sinh hc, 26(4): 13 19 14 Bựi c Quang, Vn T v Lờ Hựng Anh (2013) a dng ng vt ỏy c ln o Bch Long V, thnh ph Hi Phũng Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 5, pp 624 628 15 Nguyn Minh Quang, Bựi Cỏch Tuyn v Nguyn Th ng (2011) Bỏo cỏo Quc gia v a dng sinh hc B ti nguyờn v mụi trng 16 Nguyn Giang Sn, Vừ Anh Khoa, Nguyn Vn Chung v Nguyn Th Diu Thỳy (2011) Phõn tớch trỡnh t on gen ty th 16S-rDNA ca cua xanh (ging Scylla) Vit Nam Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 4, pp 881 885 17 Dng Vn Tng, V ỡnh Duy v Trn Th Vit Thanh (2014) ỏnh giỏ kh nng s dng mó vch CO1 vic nh loi ng vt ti Bo tng thiờn nhiờn Vit Nam Tp Cụng ngh Sinh hc, 12(4), 631 638 18 Nguyn c To v Hong ỡnh Trung (2011) c im thnh phn loi ng vt ỏy v c bin o Cn C, tnh Qung Tr Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 4, pp 328 335 19 ng Ngc Thanh v Nguyn Huy Yt (2009) Bo tn a dng sinh hc bin Vit Nam Nh xut bn khoa hc t nhiờn v cụng ngh 20 ng Ngc Thanh, ng Huy Hunh, Cao Vn Sung, Nguyn Th Lờ, Lờ Xuõn Hu, Thỏi Trn Bỏi v Nguyn Vn Sỏng (2001) ng vt Vit Nam Tp 5, Nh xut bn khoa hc v k thut 60 21 Trn Th Vit Thanh, V Th Thu Hin, Trn Th Liu v Phan K Long (2015) S dng mó vch DNA vic nh loi cỏ bin ti Bo tng thiờn nhiờn Vit Nam, Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 6, pp 855 864 22 Lờ Vn Th v Phan Doón ng (2011) a dng sinh hc ng vt ỏy khụng xng sng c ln v cht lng nc sinh hot nn ỏy ti sụng Vm C ụng, tnh Long An Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 5, pp 741 745 23 Lờ c T, Lờ c An, Nguyn Biu, Hong Trng Lp, Lờ Nh Lai, ng Ngc Thanh, Nguyn Ngc Thy v Nguyn Th Tip (2009) Khỏi quỏt v bin ụng Nh xut bn khoa hc t nhiờn v cụng ngh 24 Nguyn Th Hoi Trang v Nguyn Th Ngc n (2011) nh hng cụng tỏc bo tn a dng sinh hc vựng ven bin xó An Chn, huyn Tuy An, tnh Phỳ Yờn Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 4, pp 949 954 25 Hong ỡnh Trung v Nguyn Hu Nht (2016) c im cu trỳc v phõn b ng vt thõn mm v giỏp xỏc cú giỏ tr kinh t m ễ Loan, tnh Phỳ Yờn i hc Hu, pp 26 Vn T (2015) Cua nc ngt cỏc o ln ca Vit Nam: a dng v bo tn Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 6, pp 15 22 27 Vn T, Lờ Hựng Anh v Nguyn Tng Cng (2012) Thnh phn loi v phõn b ca ng vt ỏy c ln Quc gia Xuõn Thy, Nam nh Hi ngh khoa hc ton quc v sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt ln th 5, pp 835 841 28 Vừ S Tun, Nguyn Huy Yt v Nguyn Vn Long (2005) H sinh thỏi rn san hụ bin Vit Nam, Nh xut bn Khoa Hc v K Thut 29 Vừ S Tun, Nguyn Vn Long, Ha Thỏi Tuyn, Nguyn Xuõn Hũa v Lyndon De Vantier (2005) Cỏc qun c vựng bin ven b khu bo tn bin vnh Nha Trang, Khỏnh Hũa, Vit Nam D ỏn thớ im khu bo tn bin hũn Mun, Bỏo cỏo a dng sinh hc s 13 61 Ti liu ting anh: Abbas, E.M., Abdelsalam, K.M., Geba, K.M., Ahmed, H.O and Kato, M (2016) Genetic and morphological identification of some crabs from the Gulf of Suez, Northern Red Sea, Egypt Egyptian Journal of Aquatic Research, 42, 319-329 Avise, J.C (1995) Mitochondrial DNA Polymorphism and a Connection Between Genetictv and Demography of Relevance to Conservation Mitochondrial DNA Polymorphism and a Connection Between Genetictv and Demography of Relevance to Conservation Conservation Biology, 9, 686-690 Avise, J.C (2009) Phylogeography : retrospect and prospect Journal of Biogeography ( J Biogeogr.), pp 3-15 Baeza, J.A (2016) Molecular phylogeny of porcelain crabs (Porcellanidae: Petrolisthes and allies) from the south eastern Pacific: the genera Allopetrolisthes and Liopetrolisthes are not natural entities PeerJ, 4, 18 Becker, S., Hanner, R and Steinke, D (2011) Five Years of FISH-BOL: Brief Status Report Mitochondrial DNA, 22, 3-9 Berg, C.V.D., Higgins, W.E., Dressler, R.L., Whitten, W.M., Soto Arenas, M.A., Culham, A and Chase, M.W (2000) A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA Lindleyana, 15, pp.96114 Carpenter, K.E and Niem, V.H., (1998) FAO species identification guide for fishery purposes The living marine resources of the Western Central Pacific Volume Cephalopods, crustaceans, holothurians and sharks Rome, FAO Castro, P and Ng, P.K.L (2010) Revision of the family Euryplacidae Stimpson, 1871 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Goneplacoidea) Zootaxa, 130, 130 Chase, M.W., Nicolas, S., Mike, W., James, M.D., Rao, P.K., Nadia, H., and Vincent, S (2005) Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), 1889-1895 10 Chial, H and Craig, J (2008) mtDNA and Mitochondrial Diseases Nature Education 1, 1, 217 62 11 Chin, L.O.C., Guan, T.S., Yusoff, K and Kong, Y.C (2005) Isolation of DNA Microsatellite Markers in the Green-lipped Mussel, Perna viridis Pertanika J Trop Agric Sci, 28(1): 79-85 12 Chung, N.V (2002) The genus charybdis (crustacea: portunidae) in Vietnam Collection of Marine Research Works, pp 167 178 13 Compagno, L.J.V (1998) Fao speciec indentification guide for fishery pusposes western central edited by Norwegian Agency for International Development Fao, (3), 1397-2068 14 Cumberlidge, N., Ng, P.K.L., Yeo, D.C.J., Naruse, T., Meyer, K.S and Esser, L.J (2011) Diversity, endemism and conservation of the freshwater crabs of China (Brachyura: Potamidae and Gecarcinucidae) Integrative Zoology, (6), 45 55 15 Cunningham, C.O., McGillivray, D.M., MacKenzie, K and Melvin W.T (1996) Discrimination between Gyrodactylus salaris, G derjavini and G truttae (Platyhelminthes: Monogenea) using restriction fragment length polymorphisms and an oligonucleotide probe within the small subunit ribosomal RNA gene Parasitology, pp 87-94 16 Daniels, S.R., Stewart, B.A., Gouws, G., Cunningham, M and Matthee, C.A (2002) Phylogenetic relationships of the southern African freshwater crab fauna (Decapoda: Potamonautidae: Potamonautes) derived from multiple data sets reveal biogeographic patterning Molecular Phylogenetictv and Evolution, 25, 511 523 17 Devi, P.L., Joseph, A and Khan, S.A (2015) Diversity of Brachyuran Crabs of Cochin Backwaters , Kerala , India Marine Faunal Diversity in India, pp 75 88 18 Gill, F.B and Slikas, B (1992) Patterns of mitochondrial DNA divergence in North American crested titmice The Condor, 94, 20-28 19 Guinot, D., Ng, P.K.L and Davie, P.J.F (2008) Systema Brachyurorum : Part I An Annotated Checklist of Extant Brachyuran Crabs of the World The Raffles Bulletin of Zoology, 17, 286 20 Hall, T.A (1999) BioEdit: A user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nuclelic Acid Symposium Serier 41: 95-98 63 21 Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball S.L and De Waard, J.R (2003).Biological identifications through DNA barcodes Proc.R.Soc.B 270, 313-321 22 Hebert, P.D.N., Ratnasingham, S and deWaard, J.R (2003) Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proc R Soc Lond B (Suppl.), 270, 96-99 23 Hebert, P.D.N., Stoeckle, M.Y., Zemlak, T.S and Francis, C.M (2004), Identification of Birds through DNA barcodes PLoS Biology, 2, 1657 1663 24 Hubert, S and Hedgecock, D (2004) Linkage Maps of Microsatellite DNA markers for the Pacific Oyster Crassostrea gigas Genetictvs, 168, 351-362 25 Hultgren, K.M and Stachowicz, J.J (2008) Molecular phylogeny of the brachyuran crab superfamily Majoidea indicates close congruence with trees based on larval morphology Molecular Phylogenetictv and Evolution, 48, 986 996 26 Ip, B.H.Y., Schubart, C.D., Tsang, L.M and Chu, K.H (2015) Phylogeny of the shore crab family Grapsidae (Decapoda: Brachyura: Thoracotremata) based on a multilocus approach Zoological Journal of the Linnean Society, 174, 217 227 27 Jeyabaskaran, R., Khan, S.A and Ramaiyan, V (2000) Biodiversity Project on Gulf of Mannar Biosphere Reserve Centre of Advanced Study in Marine Biology Parangipettai 28 Karasawa, H., Feldmann, R.M., and Schweitzer, C.E (2011) Phylogenetic Analysis and Revised Classification of Podotrematous Brachyura (Decapoda) Including Extinct and Extant Families J Crustac Biol, pp 523565 29 Kress, W.J and Erickson, D.L (2008) DNA barcodes: Genes, genomic, and bioinformatictv Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), 2761-2762 30 Kress, W.J., Eriskson, D.L., Jones, F.A., Swenson, N.G., Perez, R., Sanjur, O and Bermingham E (2009) Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamictv plot in Panama Proceedings of the National Academy of Sciences, 109, 31 Kress, W.J., Robledo, C.G., Uriarte, M., and Erickson, D.L (2015) DNA barcodes for ecology, evolution and conservation Trends in Ecology and Evolution, 30, 25-35 64 32 Lai, J.C.Y., Mendoza, J.C.E., Guinot, D., Clark, P.F v Ng, P.K.L (2011) Xanthidae MacLeay, 1838 (Decapoda: Brachyura: Xanthoidea) systematics: A multigene approach with support from adult and zoeal morphology Zoologischer Anzeiger, 250, 407 448 33 Lu, G and Moriyama, E.N (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite Briefings in Bioinformatictv, 5, 378 388 34 Rougerie, R., Decaởns, T., Deharveng, L., Porco, D., James, S.W., Chang, C.H., Richard, B., Potapov, M., Suhardjono, Y and Hebert, D.N (2009) DNA barcodes for soil animal taxonomy Pesq agropec bras., Brasớlia, 44, 789-802 35 Schmidt, M., Torgersen, H and Kuffner, A (2012) World Wide Views Biodiversity Information Booklet, pp 18 36 Shih, H.T., Fang, S.H and Ng, P.K.L (2007) Phylogeny of the freshwater crab genus Somanniathelphusa Bott (Decapoda:Parathelphusidae) from Taiwan and the coastal regions of China, with notes on their biogeography Invertebrate Systematics, 21, 29 37 37 Taberlet, P., Eric, C., Franỗois, P., Ludovic, G., Christian, M., Alice, V., Thierry, V., Gộrard, C., Christian, B., and Eske, W (2007) Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding Nucleic Acids Res, 35(3), pp.14 38 Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A and Kumar, S (2013) MEGA6: Molecular evolutionary genetictv analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution, 30, 2725 2729 39 Taylor, R.W and Turnbull, D.M (2005) Mitochondrial DNA mutations in human disease Nat Rev Genet, 6, 389 402 40 Tsang, L.M., Schubart, C.D., Ahyong, S.T., Lai, J.C.Y., Au, E.Y.C., Chan, T.Y., Ng, P.K.L and Chu, K.H (2014) Evolutionary history of true crabs (Crustacea: Decapoda: Brachyura) and the origin of freshwater crabs Mol Biol Evol Fao, 31 (5), 11731187 41 Vartak, V.R., Narasimmalu, R., Annam, P.K., Singh, D.P and Lakra W.S (2014) DNA barcoding detected improper labelling and supersession of crab food 65 served by restaurants in India Journal of the Science of Food and Agriculture, 95, 359366 42 Vijayan, K and Tsou, C.H (2010) DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective Current science, 99, 1530 - 1540 43 Viswanathan, C., Elumalai, V., Pravinkumar, M and Raffi, S.M (2010) Environmental and Applied Bioresearch DNA Barcoding and First report on the confirmation of mud crab Scylla olivacea (Brachyura: Portunidae) availability in East coast of India J Environ Appl Biores, (1): 44 Ward, R.D., Henner, R and Hebert, P.D.N (2009) The campaign to DNA barcode all fishes, FISH-BOL Journal of Fish Biology, 74, 329-356 45 Wares, J.P., Ewers-saucedo, C and Brandis, D (2016) Evolution of male copulatory organs in box crabs (Decapoda: Eubrachyura: Calappidae De Haan, 1833) Journal of Crustacean Biology, 36, 804 814 46 Ze-Lin, W., Ngan-Ke, Ng., Teo, S.L.M and Velania, F.J.P (2012) Contributions to Marine Science, pp 135 143 Ti liu internet: http://www.chinhphu.vn https://blast.ncbi.nlm.nih.gov http://www.barcodeoflife.org/ https://www.mitomap.org/MITOMAP http://www.marinespecies.org/ PH LC Ph lc Quy trỡnh tỏch chit DNA bng b kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega): - Ct 25 mg mụ c cua gh, cho vo tube 1,5mL v nghin nh - Thờm 275àL Digestion Solution Master Mix vo tube cha mu gm: Nucleic Lysis Solution: 200àL 0,5M EDTA (pH 8,0): 50àL Proteinase K, 20mg/ml: 20àL Rnase A solution, 4mg/ml: 5àL - mu nhit 55oC 16-18 gi (qua ờm) - Cho 250àL Wizard SV Lysis Buffer vo tube cha mu, Vortex - Hỳt mu chuyn sang ct Wizardđ SV Minicolumn Assembly - Ly tõm ct cha mu ti 13000g phỳt - Sau ú loi b dch ng Colletion (dch b ly tõm i xung) - Thờm 650àL Column Wash Solution (CWA, cha 95% Ethanol ó c thờm) Ly tõm 13000g phỳt Loi b dch Chuyn ct Mini cú cha mng lc sang eppendolf khỏc (Lp li bc ny thờm ln) - Loi b dch Ly tõm 13000g phỳt lm khụ cht nn - Chuyn ct Mini sang ng eppendolf 1,5ml mi, thờm 100àL Nuclease Free Water (thờm ln): Ln 1: Sau thờm phỳt nhit phũng Ly tõm 13000g/1phỳt Gi li phn dch eppendolf Ln 2: Sau thờm 10 phỳt nhit phũng Ly tõm 13000g/1phỳt Gi li phn dch eppendolf Ln 3: Sau thờm 15 phỳt nhit phũng Ly tõm 13000g/1phỳt Gi li phn dch eppendolf - Gi DNA sau ln thu dch bo qun nhit t -20oC n -70oC Ph lc 2: Trỡnh t bt cp ca mi thit k CF20 v CR19 Ph lc 3: Bng sai khỏc di truyn ca cỏc loi cua gh thuc ging Charybdis (n v %) Charybdis vadorum (1) Charybdis anisodon (2) Charybdis acutifrons (3) Charybdis variegata GB (4) Charybdis hellerii GB (5) Charybdis feriatus GB (6) Charybdis omanensis GB (7) ID 12,8 13 ID 13,2 ID 11 11,8 11,2 ID 12,8 12 11,6 8,4 ID 11,8 11,2 10,4 10,4 12,2 ID (GB: Kớ hiu cỏc trỡnh t trờn Genbank) 9,6 12 11,6 10,2 11,4 13 ID Ph lc 4: Bng sai khỏc di truyn ca cỏc loi cua gh thuc ging Calappa (n v %) Calappa lophos (1) Calappa pustulosa (2) ID 16,8 16,8 14,8 11,4 ID 1,6 14,5 15,8 ID 14,5 16,2 ID 10,8 Calappa japonica GB (3) Calappa calappa GB (4) Calappa clypeata GB (5) ID (GB: Kớ hiu cỏc trỡnh t trờn Genbank) Ph lc 5: Bng sai khỏc di truyn ca cỏc loi cua gh thuc ging Macrophthalmus (n v %) Macrophthalmus latreillei (1) Macrophthalmus japonicus GB (2) Macrophthalmus convexus GB (3) Macrophthalmus erato GB (4) ID 11,6 10 11,2 ID 10,4 12 ID 8,4 ID (GB: Kớ hiu cỏc trỡnh t trờn Genbank) ... học loài sinh vật sống đáy nói chung loài cua ghẹ nói riêng Nghiên cứu dựa phương pháp phân loại hình thái di truyền để phân loại số loài cua ghẹ sống đáy phân bố hai khu vực Khánh Hòa Phú Yên Nghiên. .. điểm hình thái loài Charybdis acutifrons .29 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái loài Charybdis anisodon 30 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái loài Charybdis vadorum .31 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái. .. DNA – barcoding (Hebert ctv, 2003; Rougerie ctv, 2009) Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài Nghiên cứu thành phần loài cua ghẹ sống tầng đáy Khánh Hòa Phú Yên dựa đặc điểm hình thái di truyền thực