HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62 62 01 11 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch TS Ramona Thieme NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Hoàng Thị Giang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm huyết tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Ramona Thieme, TS Thilo Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI) - CHLB Đức, người thầy tận tình tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian công sức tạo điều kiện cho trình thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền Chọn giống trồng, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện Sinh học Nông nghiệp, đặc biệt cán Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích hoàn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Hoàng Thị Giang ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 2.2 Nguồn gen khoai tây dại tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 2.2.1 Vai trò nguồn gen kháng bệnh khoai tây 2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh chọn tạo giống khoai tây 2.3 Cơ sở khoa học phương pháp dung hợp tế bào trần 10 2.3.1 Tách tế bào trần 10 2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11 2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12 2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13 2.3.5 Chọn lọc lai soma 14 2.4 Bệnh mốc sương khoai tây 15 iii 2.4.1 Giới thiệu bệnh mốc sương 15 2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm nấm P infestans 17 2.4.3 Cơ sở phân tử tính kháng bệnh mốc sương nấm P infestans gây 18 2.4.4 Các nghiên cứu gen kháng bệnh mốc sương khoai tây 20 2.5 Các phương pháp chọn tạo giống khoai tây 23 2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây phương pháp truyền thống 23 2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây phương pháp chuyển gen 23 2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây phương pháp dung hợp tế bào trần 24 Phần Phương pháp nghiên cứu 29 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 29 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 29 3.2 Vật liệu nghiên cứu 29 3.2.1 Vật liệu thực vật 29 3.2.2 Hóa chất 30 3.2.3 Thiết bị 31 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 32 3.3.2 Xác định lai soma đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 35 3.3.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 37 3.3.4 Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 40 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 41 Phần Kết thảo luận 42 4.1 Kết 42 4.1.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 42 4.1.2 Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập 45 4.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 48 iv 4.1.4 Xác định lai soma phương pháp đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 52 4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 55 4.1.6 Nghiên cứu tạo lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng 70 4.2 Thảo luận 80 Phần Kết luận kiến nghị 87 5.1 Kết luận 87 5.2 Kiến nghị 88 Danh mục công trình công bố 89 Tài liệu tham khảo 90 Phụ lục 100 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA 6-benzyl amino purine BC Backcross CNSH Công nghệ sinh học CT Công thức CV Coefficient of variation DAS – ELISA Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay vi DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme – linked imunosorbent assay FAO Food and Agriculture Organization GA3 Gibberellic Acid IAA Indole-3-acetic acid JKI Julius Kuehn Institute KLCTB Khối lượng củ trung bình LSD Least significant difference MS Murashige and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu OD Optical density PCR Polymerase chain reaction PEG Polyethylene glycol PVX Potato virus X PVY Potato virus Y RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAS Statistical Analysis Systems SH Somatic hybrid SSR Simple sequence repeat Tm Nhiệt độ gắn mồi UV Ultra violet DANH MỤC BẢNG TT 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 Tên bảng Trang Năng suất lượng số lương thực nước phát triển Tình hình sản xuất khoai tây giới năm 2013 Tốp 10 quốc gia có sản lượng khoai tây lớn giới Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013 Tổng kết kết đánh giá tính kháng loài khoai tây dại số loại sâu, bệnh hại khoai tây chống chịu với điều kiện bất thuận môi trường Các vật liệu thu thập, nguồn gốc, độ bội tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 30 Các mồi sử dụng để chọn lọc lai 31 Các cặp mồi phát gen kháng mốc sương 31 Ảnh hưởng nồng độ macerozym cellulase dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần dòng/giống khoai tây thí nghiệm 42 Ảnh hưởng thời gian ủ mô dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu 44 Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 45 Kết tái sinh độ bội lai tái sinh sau dung hợp mật độ tế bào dung hợp khác (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 47 Kết dung hợp dòng khoai tây dại nhị bội với giống khoai tây trồng tứ bội phương pháp xung điện 48 Sự phân chia tổ hợp lai sau dung hợp điều kiện môi trường khác 49 Sự phân chia tổ hợp lai môi trường nuôi cấy khác 50 Ảnh hưởng môi trường tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai 51 Kết nuôi cấy tái sinh chồi tổ hợp lai sau dung hợp 52 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai sau dung hợp 53 Kết chọn lọc lai soma phân tích độ bội thị phân tử SSR 55 vii 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21-A 4.21-B 4.22 4.23-A 4.23- B viii Đặc điểm hình thái nấm P infestans trình nuôi cấy 56 Phản ứng số giống khoai tây với mẫu mốc sương thu thập từ Hà Nội Lạng Sơn 56 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 58 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ (tuber slice test) 60 Kết đánh giá lai soma dòng bố mẹ khả kháng bệnh mốc sương đồng ruộng đánh giá thành thục 61 Kết đánh giá tính trạng nông sinh học dòng/giống khoai tây bố mẹ lai soma 65 Đánh giá tính trạng củ lai soma dòng bố mẹ 67 Kết lai lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 71 Đánh giá khả kháng bệnh mốc sương lai BC1 giai đoạn 72 Kết đánh giá tính trạng nông sinh học lai BC 74 Kết đánh giá tính trạng nông sinh học lai BC 75 Kết đánh giá suất yếu tố cấu thành suất cá lai BC1 76 Kết đánh giá phẩm chất củ lai BC1 77 Kết đánh giá phẩm chất củ lai BC1 78 XỬ LÝ SỐ LIỆU theo chương trình SAS 9.1 I- Xử lý số liệu phần đánh giá dòng lai kháng bẹnh mốc sương CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Model 19 Error Sum of Squares 4730.392750 20 Corrected Total Mean Square F Value 49.375000 39 248.968039 Root MSE 0.989670 3.822236 1.571226 T 19 CHIEU CAO CAY F Anova SS 4730.392750 N Mean 41.10750 Mean Square 248.968039 F Value 100.85 Pr > F