Header Page of 126 i VIN HN LM KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT MAI HNG NGHIÊN CứU HOạT TíNH SINH HọC Và THàNH PHầN HóA HọC TRONG Rễ CÂY THổ PHụC LINH (SMILAX GLABRA ROXB.) CủA VIệT NAM Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Mó s: 60420114 LUN VN THC S SINH HC Ngi hng dn khoa hc: TS NGUYN QUC VNG H NI, 2013 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ii LI CM N Tụi xin chõn thnh by t lũng bit n sõu sc ca mỡnh ti TS Nguyn Quc Vng, ngi thy ó tn tỡnh hng dn, ch bo, ng viờn v giỳp tụi sut quỏ trỡnh nghiờn cu v thc hin lun ny Tụi xin gi li cm n chõn thnh ti mi thnh viờn phũng Cụng ngh Húa dc, Vin Húa sinh bin, Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó giỳp v to iu kin cho tụi hon thnh lun ny ng thi tụi xin gi li cm n sõu sc ti phũng hot cht sinh hc - Vin Húa sinh bin, phũng th nghim sinh hc - Vin Cụng ngh sinh hc v th cỏn b Vin Húa sinh bin ó giỳp tụi thc hin cỏc ni dung ca ti Tụi xin gi li cm n n lónh o Vin v c s o to Vin Sinh thỏi v Ti nguyờn sinh vt ó to iu kin cho tụi thi gian tụi hc v hon thin lun ny Cui cựng, vi lũng bit n sõu sc, tụi xin by t li cm n ti nhng ngi thõn gia ỡnh, cỏc anh ch em lp CHST K15 nhng ngi ó luụn ng h, giỳp tụi sut thi gian hc v nghiờn cu ti lun c thc hin ti phũng Cụng ngh húa dc Vin Húa sinh bin, theo tin thc hin ti VAST0402/13 14 thuc Vin Hn lõm khoa hc v Cụng ngh Vit Nam H Ni, Thỏng 11 nm 2013 Tỏc gi lun Mai Hng S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iii MC LC LI CM N i MC LC iii DANH MC T VIT TT vi DANH MC BNG V HèNH V ix M U MC CH V í NGHA KHOA HC CA TI CHNG : TNG QUAN 1.1 Thc vt hc v tỏc dng cha bnh ca Th phc linh (Smilax glabra Roxb.) 1.1.1 Thc vt 1.1.2 Tỏc dng cha bnh 1.2 Astilbin v thnh phn húa hc r cõy Th phc linh 1.2.1 Astilbin 1.2.2 Thnh phn húa hc r Th phc linh 1.3 Hot tớnh sinh hc ca r cõy Th phc linh 13 1.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu cõy Th phc linh trờn th gii v nc 16 1.4.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc 16 1.4.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu ngoi nc 17 CHNG 2: CC PHNG PHP NGHIấN CU 19 2.1 Phng phỏp to cỏc cao chit v phõn lp cỏc hot cht 19 2.1.1 Phng phỏp to cao chit 19 2.1.2 Cỏc phng phỏp phõn lp 20 2.1.2.1 Sc ký lp mng (thin layer chromatography- TLC) 20 2.1.2.2.Sc ký lp mng iu ch (Preparative thin layer chromatography PTLC) 21 2.1.2.3 Sc ký ct (Column chromatography- CC) 22 2.2 Phng phỏp xỏc nh cu trỳc 22 2.2.1 Ph hng ngoi (Infrared - IR) 22 2.2.2 Ph t ngoi (UV-VIS) 23 2.2.3 Ph cng hng t ht nhõn (NMR) 23 2.2.4 Ph lng (Mass spectrometry- MS) 24 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 iv 2.3 Phng phỏp HPLC xỏc nh hm lng cỏc hp cht 24 2.4 Phng phỏp th nghim hot tớnh sinh hc ca cỏc cao chit 25 2.4.1 Hot tớnh c t bo invitro 25 2.4.1.1 Nguyờn liu 25 2.4.1.2 Phng phỏp nuụi cy t bo invitro 25 2.4.1.3 Phộp th sinh hc xỏc nh hot tớnh gõy c t bo (cytotoxic assay) 25 2.4.2 Hot tớnh chng oxy húa 26 2.4.2.1 Phng phỏp o MDA 26 2.4.2.2 Phng phỏp phõn lp v nhõn nuụi trc tip t bo gan chut 28 CHNG 3: THC NGHIM 30 3.1 Phõn lp astilbin, mt s hp cht v to cỏc cao chit TPLEtOH, TPPL-As40 30 3.1.1 Phõn lp astilbin v cỏc hp cht gn astilbin trờn sc ký lp mng 30 3.1.1.1 Qui trỡnh phõn lp astilbin v cỏc hp cht gn astilbin theo SKLM 30 3.1.1.2 S liu ph ca cỏc cht phõn lp c 32 3.1.2 Kho sỏt mt s vựng nguyờn liu Th phc linh Bc 33 3.1.2.1 Thu mua Th phc linh ti cỏc vựng kho sỏt 33 3.1.2.2 Quy trỡnh chung phõn lp v xỏc nh hm lng astilbin t r Th phc linh khụ 35 3.1.3 Giỏm nh thu mua mu v x lý mu Th phc linh 37 3.1.3.1 Giỏm nh mu thc vt 37 3.1.3.2 Thu mua v x lý mu 37 3.1.4 To cỏc cao chit TPL-EtOH, TPL-As40 38 3.2 Xỏc nh hm lng astilbin cỏc cao chit TPL-EtOH, TPL-As40 39 3.2.1 Thit lp thụng s cho sc ký lng 39 3.2.2 Thit lp chng trỡnh chy 40 3.2.3 Thit lp cỏc iu kin thớ nghim cho h thng sc ký lng 40 3.2.4 Thit lp trỡnh t chy cho cỏc mu 41 3.2.5 Kim tra s cú mt ca hp cht cn phõn tớch cỏc mu 42 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 v 3.3 Th nghim hot tớnh c t bo v hot tớnh chng oxy húa ca cỏc cao chit 45 3.3.1 Th nghim hot tớnh c t bo cỏc cao chit TPL-EtOH, TPLAs40 45 3.3.2 Th nghim hot tớnh chng oxy húa 47 CHNG 4: KT QU V THO LUN 49 4.1 Astilbin v mt s hot cht tỏch c t r Th phc linh 49 4.2 Kho sỏt hm lng astilbin r TPL ti Bc..58 4.3 Cao chit TPL-EtOH, TPL-As40.58 4.4 Hm lng astilbin cỏc cao chit TPL-EtOH, TPL-As40 58 4.4.1 Kt qu xõy dng ng chun nh lng astilbin 59 4.4.2 ỏnh giỏ hm lng hp cht astilbin mu cao chit Th phc linh 61 4.5 Hot tớnh c t bo v hot tớnh chng oxy húa ca cỏc dch chit 63 4.5.1 Kt qu sng lc tớnh c t bo trờn dũng t bo ung th KB, LU-1, MCF-7 63 4.5.2 Hot tớnh chng oxy húa ca cỏc dch chit 65 KT LUN 67 KIN NGH 68 TI LIU THAM KHO 69 PH LC 76 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vi DANH MC T VIT TT Vit tt Vit y Ac Nhúm axetyl ACN Axetonnitrin n-Bu Nhúm n-butyl BALB/c Chut bch tng 13 Ph cng hng t ht nhõn Cacbon 13 (Cacbon-13 Nuclear C-NMR Magnetic Resonance) CC Sc ký ct (Column chromatography) DCM Diclometan DMF N,N-Dimethylformamit DMSO Dimethylsulfoxid ((CH3)2SO) DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ED50 Nng bo v ti thiu 50% EMME Ethoxymethylenmalonat ESI-MS Ph lng phun mự in t (Electrospray Ionization Mass Spectrometry ) Et Nhúm etyl EtOAc Etyl axetat EtOH Etanol Ph cng hng t ht nhõn Proton (Proton Nuclear Magnetic H-NMR Resonance Spectroscopy) HMBC HPLC HTCO Ph tng tỏc d ht nhõn qua nhiu liờn kt (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Sc ký lng hiu nng cao (High Performance Liquid Chromatography) Hot tớnh chng oxy húa S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 vii HSQC Ph tng tỏc d ht nhõn qua mt liờn kt (Heteronuclear Single Quantum Coherence) IC50 Nng c ch 50% (Imhibitory Concentration 50%) IR Ph hng ngoi (Infrared spectroscopy) KB T bo ung th biu mụ (Human Epidemoid Carcinoma) LU-1 T bo ung th phi (Human Lung Carcinoma) MCF-7 Dũng t bo ung th vỳ ngi (MCF-7 Human breast adenocarcinoma cell line) MTT 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoli bromua MCPBA m-Chloroperbenzoic acid MDA Malonyl dialdehyd MS Ph lng (Mass spectrometry) Me Nhúm metyl n-hx n-hexan NMR Ph cng hng t ht nhõn(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) OD Mt quang (Optical Density) PTLC Sc ký lp mng iu ch (Preparative thin layer chromatography) Ph Nhúm phenyl SRB Sulforhodamine B TBA Thiobarbituric acid TLC Sc ký lp mng (thin layer chromatography) TPL Th phc linh TPL-As40 Mu astilbin thụ TPL-EtOH Mu cn chit cn UV-VIS Ph t ngoi S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 viii s Singlet br Broad d Doublet dd Doublet of doublets t Triplet dm Doublet of multiplets q Quartet ppm Parts per million m Multiplet S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ix DANH MC BNG V HèNH V Danh mc bng Bng 3.1: H dung mụi phõn tớch mu theo thi gian 41 Bng 4.1: Cu trỳc phõn t ca hp cht tỏch c r th phc linh 50 Bng 4.2: Kt qu kho sỏt hm lng astilbin r TPL ti tnh Bc 58 Bng 4.3: ng chun, r2, LOD, LOQ ca cỏc cht astilbin 61 Bng 4.4: Kt qu nh lng hm lng ca astilbin cỏc mu 62 Bng 4.5: Kt qu sng lc tớnh c t bo trờn dũng t bo ung th KB 63 Bng 4.6: Kt qu sng lc tớnh c t bo trờn dũng t bo ung th LU-1 64 Bng 4.7: Kt qu sng lc tớnh c t bo trờn dũng t bo ung th MCF-7 64 Bng 4.8: Kt qu xỏc nh hot tớnh chng oxi húa 65 Danh mc hỡnh v Hỡnh 1.1: Cõy th phc linh 1.2: Cụng thc cu to ca astilbin Hỡnh 1.3 Dihydroflavonol c tỏch t r th phc linh 10 Hỡnh 1.4: Mt s cỏc flavonoid khỏc c tỏch t RSG 11 Hỡnh 1.5: Cỏc phenylpropanoid glycoside c tỏch t RSG 11 Hỡnh 1.6: Lignan glycoside c tỏch t RSG 12 Hỡnh 1.7: Cỏc polyphenol, phenolic acid v glycoside ca nú c tỏch t RSG 12 Hỡnh 1.8: Cỏc cu t phenolic mi c tỏch t RSG 18 Hỡnh 3.1: S tỏch astilbin v cỏc hp cht gn trờn SKLM 31 Hỡnh 3.2: Hỡnh nh cỏc mu Th phc linh cỏc vựng 35 Hỡnh 3.3: S phõn lp astilbin t r Th phc linh khụ 36 Hỡnh 3.4: Mu Th phc linh thõn lỏ v c ti 37 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 10 of 126 x Hỡnh 3.5: Hỡnh nh mu Th phc linh ti ti Tuyờn Quang 38 Hỡnh 3.6: S to cao chit TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-ng 39 Hỡnh 3.7: S trỡnh t chy cỏc mu 42 Hỡnh 3.8: Sc ký ca mu Th phc linh AE trờn ct Zorbax Eclipse 43 XDB C18 (4,6 x 150nm, 5àm) 43 Hỡnh 3.9: Sc ký ca mu Th phc linh- ng trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150nm, 5àm) 43 Hỡnh 3.10: Sc ký ca mu Th phc linh- AS4O trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150nm, 5àm) 44 Hỡnh 3.11: Sc ký ca mu Th phc linh- EtOH trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150nm, 5àm) 44 Hỡnh 4.1: Cht (Astilbin) 50 Hỡnh 4.2: Ph 1H-NMR ca astilbin 52 Hỡnh 4.3: Ph 13C-NMR ca astilbin 52 Hỡnh 4.4: Engeletin 53 Hỡnh 4.5: Ph 1H-NMR ca engeletin 54 Hỡnh 4.6: Ph 13C-NMR ca engeletin 54 Hỡnh 4.7: 3-O-caffeoyl-shikimic acid 55 Hỡnh 4.8: Ph 1H-NMR ca cht 56 Hỡnh 4.9: Ph 13C-NMR ca cht 57 Hỡnh 4.10: Ph HMBC ca cht 57 Hỡnh 4.11: Sc ký ca hp cht astilbin ti bc súng 291 nm trờn ct Zobax eclipse XDB C18 60 Hỡnh 4.12: th ng chun astilbin 60 Hỡnh 4.13: Sc ký ca mu th phc linh-As4O v astilbin trờn ct Zorbax eclipe XBD C18 (4,6 x 150 nm, 5àm) 61 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 10 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 95 of 126 85 Ph lc 10: Ph dón khong 5-1 ppm 1H-NMR ca cht 3(3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 95 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 96 of 126 86 Ph luc 11: Ph 13C-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 96 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 97 of 126 87 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 97 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 98 of 126 88 Ph luc 12: Ph 13C-DEPT-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 98 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 99 of 126 89 Ph luc 13: Ph HSQC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 99 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 100 of 126 90 Ph luc 14: Ph dón HSQC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 100 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 101 of 126 91 Ph luc 15: Ph HMBC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 101 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 102 of 126 92 S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 102 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 103 of 126 93 Ph luc 16: Ph dón HMBC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) Ph luc 17: Ph dón HMBC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 103 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 104 of 126 94 Ph luc 18 : Ph dón HMBC-NMR ca cht (3-O-caffeoyl-shikimic acid) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 104 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 105 of 126 95 Ph lc 19: Sc ký ca mu TPL-EtOAc trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5àm) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 105 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 106 of 126 96 Ph lc 20: Sc ký ca mu TPL-ng trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5àm) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 106 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 107 of 126 97 Ph lc 21: Sc ký ca mu TPL-As40 trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5àm) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 107 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 108 of 126 98 Ph lc 22: Sc ký ca mu TPL-EtOH trờn ct Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5àm) S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 108 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Header Page 109 of 126 99 Ph lc 23: Kt qu giỏm nh tờn khoa hc S húa bi Trung tõm Hc liu Footer Page 109 of 126 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... Astilbin thành phần hóa học rễ Thổ phục linh 1.2.1 Astilbin 1.2.2 Thành phần hóa học rễ Thổ phục linh 1.3 Hoạt tính sinh học rễ Thổ phục linh 13 1.4 Tình hình nghiên cứu Thổ phục. .. nhiều nghiên cứu tác dụng chữa bệnh thổ phục linh Trên sở này, định chọn đề tài Nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) Việt Nam để tiến hành nghiên. .. gian quan tâm nghiên cứu đầy đủ hoạt chất hoạt tính sinh học, khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, Thổ phục linh lựa chọn nghiên cứu Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn